跨尺度染色体构象捕获

该方案能够以低背景信号准确检测多个长度尺度上的染色体折叠特征。例如，可在染色体区室的背景下分析启动子-增强子相互作用。使用限制性内切酶可避免对输入材料的消化程度进行优化。

无需通过凝胶分离进行筛选即可捕获连接产物。最常见的问题是DSG固定后细胞丢失，以及捕获足够量的DNA以构建高质量文库。首先，使用连接真空泵的巴斯德吸管从含有5 × 10⁶个细胞的150毫米培养皿中吸除培养基。

用10毫升HBSS洗涤细胞两次。为交联细胞，将23.125毫升1%甲醛溶液加入15厘米培养皿中。室温孵育10分钟，每隔2分钟用手轻轻摇动培养皿。

接下来，加入 1.25 毫升 2.5 摩尔的甘氨酸，轻轻摇动培养板以终止交联反应，然后在室温下孵育 5 分钟。随后将样品置于冰上继续孵育 15 分钟，以彻底停止交联反应。使用细胞刮棒或橡胶刮棒将细胞从培养板上刮下，并用移液器将细胞悬液转移至 50 毫升锥形管中。

将悬液在室温下以1,000 × g离心10分钟，通过抽吸弃去上清液。用10毫升杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤沉淀物一次。然后，在进行DSG交联前再次离心。

使用DSG进行交联时，将沉淀的细胞重悬于9.9毫升DPBS中。然后加入100微升300毫摩尔的DSG。通过倒置混匀管内溶液，并在旋转仪上室温条件下孵育40分钟以交联细胞。

交联后，加入1.925毫升2.5摩尔的甘氨酸，颠倒混匀，并在室温下孵育5分钟。接着，将细胞在2,000 × g下离心15分钟，并将沉淀重悬于1毫升含0.05%牛血清白蛋白的DPBS中，然后转移至1.7毫升离心管。在4摄氏度下以2,000 × g离心15分钟，弃去上清液。

在进行染色体构象捕获之前，将沉淀物在液氮中速冻。将交联的细胞等分试样重悬于1 mL冰预冷的裂解缓冲液中，其中含有10 µL蛋白酶抑制剂混合物，转移至Dounce匀浆器中，在冰上孵育15分钟。缓慢上下移动A型研杵30次以匀浆细胞，孵育1分钟使细胞冷却，然后再进行30次研磨。

最后一次研磨后，将裂解液转移至1.7毫升离心管中。将裂解后的悬液在2,500 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，轻轻弹击或涡旋振荡以重新悬浮湿润的沉淀物。

尽可能吸除上清液，以获得呈酸奶状且结块最少的物质。在离心前，将沉淀重悬于500 µL预冷的限制性缓冲液中。第二次洗涤后，根据细胞大小，向沉淀残留体积中加入约340 µL限制性缓冲液，再通过移液将沉淀重悬于总体积为360 µL的限制性缓冲液中。

留出18微升裂解液用于检测染色质完整性（CI）。向剩余的裂解液中加入38微升1%十二烷基硫酸钠至hi-C管中，使总体积达到380微升，用移液器轻轻吹打混匀，避免产生气泡。将样品在65摄氏度下孵育10分钟（不振荡），以打开染色质结构，随后立即将管子置于冰上。

用 Triton X-100 配制消化混合液后，取 107 微升该混合液加入 hi-C 管中，使总体积达到 487 微升，并在 37 摄氏度的恒温混匀仪中以间隔振荡方式过夜消化染色质。次日，将样品转移至 65 摄氏度加热 20 分钟，以灭活残留的内切酶活性。将样品置于冰上后，留出 10 微升消化对照（DC）样品，于 4 摄氏度保存。

使用移液器或离心方法去除盖子上的冷凝液。然后加入58 µL生物素填补混合液，使总体积达到535 µL。在23°C条件下于恒温混匀仪中孵育4小时前，轻轻吹打混匀，避免产生气泡。

孵育后，加入665 µL连接混合液，使样品体积达到1,200 µL。用移液器吹打混匀样品，在热混仪中于16°C孵育4小时。接着，将50 µL蛋白酶K分两次加入hi-C样品管中，于65°C过夜孵育，并间隔振荡。

进行DNA纯化时，加入100%预冷乙醇，于4°C下以18,000 × g离心30分钟。从非沉淀侧彻底移除上清液，将样品空气干燥10分钟，或直至沉淀明显干燥。沉淀干燥后，通过移液或涡旋将其溶解于450 µL Tris低EDTA缓冲液中。

将溶解后的悬浮液转移至截留分子量为3千道尔顿的0.5毫米离心过滤单元（CFU）中。以最大速度离心CFU 10分钟，弃去滤过液。第二次洗涤后，向柱中加入80微升Tris低EDTA缓冲液。

将柱子放入新的收集管中，在最大转速下离心两分钟。最后，将样品上样至0.8%琼脂糖凝胶。PCR梯度结果的琼脂糖凝胶显示，大多数文库需要进行五到八个循环的最终PCR扩增。

通过琼脂糖凝胶上较小片段观察到最终扩增的PCR文库的细胞消化情况，可确认正确连接接头的存在，并作为测序前的质量检查。测序后，比对数据显示，DpnII与DdeI的组合显著增加了短程相互作用，其效果相当于在传统甲醛交联基础上添加DSG。从二维相互作用矩阵中还可直接观察到长距离和短距离相互作用信号的改善。

区室信号在远距离处表现为CRISPR，在由染色质环形成的短距离处则呈现更明显的点状结构。除了甲醛之外，使用DSG进行交联可减少随机连接，从而提高顺式相对覆盖度。在交联过程中及交联后，避免细胞丢失至关重要。

细胞沉淀可能松散或不可见，且在某些缓冲液中细胞会粘附在移液器吸头。