跨长度尺度捕获染色体构象

该协议以低背景信号准确检测多个长度尺度上的染色体折叠特征。例如，启动子增强子相互作用可以在染色体区室的背景下进行分析。使用限制性核酸内切酶可避免优化输入材料的消化水平。

无需通过凝胶分离进行选择即可捕获连接产物。最常见的问题是DSG固定后细胞丢失，并捕获足够的DNA以产生高质量的文库。首先，用巴斯德移液管从包含5×10到第六个细胞的150毫米板中与真空阱耦合的吸出培养基。

用10毫升HBSS洗涤细胞两次。要交联细胞，将23.125毫升1%甲醛溶液倒入15厘米的平板中。在室温下孵育 10 分钟，每两分钟用手轻轻摇动板。

接下来，加入1.25毫升2.5摩尔甘氨酸，轻轻旋转板以淬灭交联反应，然后在室温下孵育五分钟。继续在冰上孵育15分钟以停止交联。用细胞刮刀或橡胶警察从板上刮下细胞，并用移液管将细胞悬液转移到50毫升锥形管中。

在室温下以1， 000倍G离心悬浮液10分钟，并通过抽吸弃去上清液。用10毫升Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水或DPBS清洗沉淀一次。然后，在进行DSG交联之前再次离心。

为了与DSG交联，将沉淀的细胞重悬于9.9毫升DPBS中。然后，加入 100 微升 300 毫摩尔 DSG。通过倒置混合管，并在室温下在旋转器上交联细胞40分钟。

交联后，加入1.925毫升2.5摩尔甘氨酸，倒置混合，室温孵育5分钟。接下来，将细胞以2， 000倍G离心15分钟，并将沉淀重悬于一毫升0.05%牛血清白蛋白DPBS中，然后将其转移到1.7毫升管中。将细胞以2， 000倍G在4摄氏度下离心15分钟，弃去上清液。

在进行染色体确认捕获之前，在液氮中快速冷冻沉淀。将交联细胞等分试样重悬于含有10微升蛋白酶抑制剂混合物的1毫升冰冷裂解缓冲液中，并转移到Dounce均质器中在冰上孵育15分钟。缓慢地上下移动杵A30次以使细胞均质化并孵育一分钟，以使细胞冷却，然后再进行30次冲程。

最后一次冲程后，将裂解物转移到1.7毫升管中。将裂解的悬浮液以2， 500倍G离心五分钟。弃去上清液并轻弹或涡旋以重悬湿沉淀。

尽可能多地去除上清液，以获得团块最少的酸奶状物质。离心前将沉淀重悬于500微升冰冷的限制性缓冲液中。第二次洗涤后，根据细胞大小，在向沉淀的残留体积中加入约340微升后，通过移液将沉淀重悬于360微升的限制性缓冲液中。

留出18微升裂解物用于测试染色质完整性，或 CI.To 剩余裂解物，向hi-C管中加入38微升1%十二烷基硫酸钠，使总体积为380微升，并通过移液小心混合，不要引入气泡。将样品在 65 摄氏度下孵育而不摇晃 10 分钟以打开染色质。然后，立即将管子放在冰上。

用Triton X-100制备消化混合物后，将107微升该混合物加入hi-C管中，使总体积为487微升，并将染色质在37摄氏度下在温度混合器中消化过夜，间隔振荡。第二天，将样品转移到65摄氏度下20分钟，以停用剩余的核酸内切酶活性。将样品放在冰上后，留出 10 微升消化对照或 DC，并将它们储存在 4 摄氏度。

用移液管或旋转从盖子上去除冷凝物。然后，加入 58 微升生物素填充混合物，使总体积为 535 微升。轻轻移液，不要形成气泡，然后在 23 摄氏度下在热混合器中孵育四小时。

孵育后，加入665微升连接混合物，使样品体积为1， 200微升。通过移液混合样品，并在16摄氏度下在热混合器中孵育4小时。接下来，将 50 微升蛋白酶-K 分两次添加到 hi-C 样品管中，并在间隔振荡的情况下在 65 摄氏度下孵育过夜。

对于DNA纯化，加入100%冰冷乙醇，并在4摄氏度下以18， 000倍G离心管30分钟。从非沉淀侧完全除去上清液，并将样品风干10分钟或直到沉淀明显干燥。颗粒干燥后，通过移液或旋转将它们溶解在 450 微升 Tris 低 EDTA 中。

将溶解的悬浮液转移到0.5毫米离心过滤单元或CFU中，截止分子量为3千道尔顿。以最大速度离心CFU10分钟，然后丢弃流出物。第二次洗涤后，向色谱柱中加入80微升Tris低EDTA。

将色谱柱放入新的收集管中，以最大速度离心两分钟。最后，将样品加载到0.8%琼脂糖凝胶上。具有PCR滴定结果的琼脂糖凝胶表明，大多数文库需要5到8个循环的最终PCR扩增。

通过琼脂糖凝胶上的较小片段观察到，最终扩增的PCR文库的细胞消化确认了正确的连接连接点的存在，并可作为测序前的质量检查。测序后，映射数据显示，DpnII和DdeI的组合显着增加了短程接触，因为将DSG添加到常规甲醛交联中。还可以直接从2D交互矩阵在长距离和短距离上观察到改进的信号。

隔室信号在长距离时是CRISPR，由染色质环形成的点在短距离时更为突出。除甲醛外，与DSG交联可减少随机连接，提高顺式的相对覆盖率。重要的是在交联期间和之后不要丢失细胞。

细胞沉淀可以是松散的或不可见的，细胞可以粘在某些缓冲液中的移液器吸头上。