Name: 跨长度尺度捕获染色体构象 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 学习Hi-C 3.0技术检测染色质相互作用的方法，利用甲醛和DSG交联剂结合限制性内切酶，实现高分辨率、低背景的染色体构象分析，为基因组三维结构研究提供可靠方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢 Denis Lafontaine 在实验方案开发方面的帮助，以及 Sergey Venev 在生物信息学方面的协助。本工作由美国国立卫生研究院共同基金4D基因组计划向 J.D. 提供的资助支持（U54-DK107980，UM1-HG011536）。J.D. 是霍华德·休斯医学研究所的研究员。
本文遵循霍华德·休斯医学研究所（HHMI）的出版物开放获取政策。HHMI实验室负责人此前已在他们的研究论文中向公众授予了非独占性的CC BY 4.0许可，并向HHMI授予了可再许可的许可。根据这些许可，本文的作者接受稿可在发表后立即以CC BY 4.0许可协议自由获取。

<ol><li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li>
<li>Simonis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+organization+of+active+and+inactive+chromatin+domains+uncovered+by+chromosome+conformation+capture-on-chip+%284C%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C).</a> Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).</li>
<li>Dostie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Conformation+Capture+Carbon+Copy+%285C%29%3A+a+massively+parallel+solution+for+mapping+interactions+between+genomic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements.</a> Genome Research. 16 (10), 1299-1309 (2006).</li>
<li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li>
<li>Stadhouders, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+chromosome+conformation+capture+sequencing+for+rapid+genome-scale+high-resolution+detection+of+long-range+chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions.</a> Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).</li>
<li>Kalhor, R., Tjong, H., Jayathilaka, N., Alber, F., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+architectures+revealed+by+tethered+chromosome+conformation+capture+and+population-based+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome architectures revealed by tethered chromosome conformation capture and population-based modeling.</a> Nature Biotechnology. 30 (1), 90-98 (2012).</li>
<li>Hsieh, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+nucleosome+resolution+chromosome+folding+in+yeast+by+micro-C%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by micro-C.</a> Cell. 162 (1), 108-119 (2015).</li>
<li>Hsieh, T. -H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-C+XL%3A+assaying+chromosome+conformation+from+the+nucleosome+to+the+entire+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Micro-C XL: assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome.</a> Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).</li>
<li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+decade+of+3C+technologies%3A+detailed+insights+into+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li>
<li>Rodley, C. D., Bertels, F., Jones, B., O’Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+identification+of+yeast+chromosome+interactions+using+Genome+conformation+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Global identification of yeast chromosome interactions using Genome conformation capture.</a> Fungal Genetics and Biology. 46 (11), 879-886 (2009).</li>
<li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li>
<li>Alipour, E., Marko, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+domain+structures+by+DNA-loop-extruding+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Self-organization of domain structures by DNA-loop-extruding enzymes.</a> Nucleic Acids Research. 40 (22), 11202-11212 (2012).</li>
<li>Lajoie, B. R., Dekker, J., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hitchhiker%E2%80%99s+guide+to+Hi-C+analysis%3A+Practical+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The Hitchhiker’s guide to Hi-C analysis: Practical guidelines.</a> Methods. 72, 65-75 (2015).</li>
<li>Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C+2.0%3A+An+optimized+Hi-C+procedure+for+high-resolution+genome-wide+mapping+of+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation.</a> Methods. 123, 56-65 (2017).</li>
<li>Golloshi, R., Sanders, J. T., McCord, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iteratively+improving+Hi-C+experiments+one+step+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Iteratively improving Hi-C experiments one step at a time.</a> Methods. 142, 47-58 (2018).</li>
<li>Darrow, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+DXZ4+on+the+human+inactive+X+chromosome+alters+higher-order+genome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Deletion of DXZ4 on the human inactive X chromosome alters higher-order genome architecture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (31), 4504-4512 (2016).</li>
<li>Akgol Oksuz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+chromosome+conformation+capture+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays.</a> Nature Methods. 18 (9), 1046-1055 (2021).</li>
<li>Ghuryeid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+Hi-C+links+with+assembly+graphs+for+chromosome-scale+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrating Hi-C links with assembly graphs for chromosome-scale assembly.</a> PLoS Computational Biology. 15 (8), 1007273(2019).</li>
<li>Gu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-mapping+of+nuclear+compartments+using+ultra-deep+Hi-C+shows+that+active+promoter+and+enhancer+elements+localize+in+the+active+A+compartment+even+when+adjacent+sequences+do+not%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Fine-mapping of nuclear compartments using ultra-deep Hi-C shows that active promoter and enhancer elements localize in the active A compartment even when adjacent sequences do not.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Ramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+3D+genome+architecture+through+in+situ+DNase+Hi-C%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mapping 3D genome architecture through in situ DNase Hi-C.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2104-2121 (2016).</li>
<li>Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C+3.0%3A+Improved+Protocol+for+Genome-Wide+Chromosome+Conformation+Capture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hi-C 3.0: Improved Protocol for Genome-Wide Chromosome Conformation Capture.</a> Current Protocols. 1 (7), 198(2021).</li>
<li>Belton, J. -M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C%3A+A+comprehensive+technique+to+capture+the+conformation+of+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Hi-C: A comprehensive technique to capture the conformation of genomes.</a> Methods. 58 (3), 268-276 (2012).</li>
<li>Truch, J., Telenius, J., Higgs, D. R., Gibbons, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+tackle+challenging+ChIP-Seq%2C+with+long-range+cross-linking%2C+Using+ATRX+as+an+example%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">How to tackle challenging ChIP-Seq, with long-range cross-linking, Using ATRX as an example.</a> Methods in Molecular Biology. 1832, Clifton, N.J. 105-130 (2018).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">In situ chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Current Protocols. 1 (8), 174(2021).</li>
<li>Tjong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population-based+3D+genome+structure+analysis+reveals+driving+forces+in+spatial+genome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Population-based 3D genome structure analysis reveals driving forces in spatial genome organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1663-1672 (2016).</li>
<li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle+dynamics+of+chromosomal+organization+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle dynamics of chromosomal organization at single-cell resolution.</a> Nature. 547 (7661), 61-67 (2017).</li>
<li>Ramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+multiplex+single-cell+Hi-C%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Massively multiplex single-cell Hi-C.</a> Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).</li>
<li>Meng, L., Wang, C., Shi, Y., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Si-C+is+a+method+for+inferring+super-resolution+intact+genome+structure+from+single-cell+Hi-C+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Si-C is a method for inferring super-resolution intact genome structure from single-cell Hi-C data.</a> Nature Communications. 12 (1), 4369(2021).</li>
<li>Tavares-Cadete, F., Norouzi, D., Dekker, B., Liu, Y., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-contact+3C+reveals+that+the+human+genome+during+interphase+is+largely+not+entangled%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Multi-contact 3C reveals that the human genome during interphase is largely not entangled.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1105-1114 (2020).</li>
<li>Vermeulen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-contact+4C%3A+long-molecule+sequencing+of+complex+proximity+ligation+products+to+uncover+local+cooperative+and+competitive+chromatin+topologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multi-contact 4C: long-molecule sequencing of complex proximity ligation products to uncover local cooperative and competitive chromatin topologies.</a> Nature Protocols. 15 (2), 364-397 (2020).</li>
<li>Oomen, M. E., Hedger, A. K., Watts, J. K., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+chromatin+interactions+between+and+along+sister+chromatids+with+SisterC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting chromatin interactions between and along sister chromatids with SisterC.</a> Nature Methods. 17 (10), 1002-1009 (2020).</li>
<li>Mitter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+of+sister+chromatids+in+the+replicated+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformation of sister chromatids in the replicated human genome.</a> Nature. 586 (7827), 139-144 (2020).</li>
<li>Krietenstein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+Details+of+Mammalian+Chromosome+Architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural Details of Mammalian Chromosome Architecture.</a> Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).</li>
<li>Hughes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+hundreds+of+cis-regulatory+landscapes+at+high+resolution+in+a+single%2C+high-throughput+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Analysis of hundreds of cis-regulatory landscapes at high resolution in a single, high-throughput experiment.</a> Nature Genetics. 46 (2), 205-212 (2014).</li>
<li>Fullwood, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).</li>
<li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+long-range+chromatin+interactions+by+proximity+ligation-assisted+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq.</a> Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).</li>
<li>Mumbach, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiChIP%3A+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

细胞操作的关键步骤 
尽管可以使用较少的起始细胞数量，但本实验方案已针对每个测序通道（约 4 亿条 reads）使用约 5 × 106 个细胞进行优化，以确保深度测序后获得足够的文库复杂度。建议在固定前对细胞进行计数。为构建超深度测序文库，我们通常按所需测序深度相应增加测序通道数（及细胞数量）。为实现最佳固定效果，在甲醛（FA）固定前应将含血清的培养基替换为 PBS，并立即加入固定液，避免产生浓度梯度15,22。在收集细胞时，建议优先采用刮取法而非胰酶消化法，因为胰酶处理后细胞由扁平形态转变为球形，可能影响细胞核构象。加入 DSG 后，松散或易聚集的细胞沉淀容易丢失。在此阶段操作细胞时需格外小心，可加入最高至 0.05% 的 BSA 以减少细胞聚团。
对方法的修改 
本方案最初使用人源细胞开发17。然而，基于染色体构象捕获技术的经验，该方案应适用于大多数真核细胞。当起始样本量显著较低（约 1 × 106 个细胞）时，我们建议在裂解和构象捕获步骤 [2.1–2.4] 中使用一半的试剂体积。这样还可使DNA提取步骤 [2.5] 能在台式离心机中使用1.7 mL离心管完成，有助于在低浓度DNA条件下提高沉淀效果。DNA定量结果（步骤 2.6.6）将指导后续操作。若提取的DNA量较少（1–5 µg），建议跳过片段大小选择步骤（步骤 3.3），并通过离心浓缩超滤管（CFU）将体积从130 µL浓缩至约45 µL后，直接进行生物素去除。
本方案专门设计用于在使用甲醛（FA）和二琥珀酰亚胺基戊二酸酯（DSG）交联，并用DpnII和DdeI进行消化后，确保获得高质量的数据。然而，其他交联策略也可能同样有效，例如先使用甲醛（FA）再使用EGS（乙二醇双（琥珀酰亚胺基琥珀酸酯）），该策略也用于ChIP-seq23和ChIA-PET2417。类似地，也可采用不同的酶组合进行消化，例如DpnII与HinfI18，或MboI、MseI与NlaIII19。在调整酶组合时，务必使用能够填补特定5'突出末端的生物素化核苷酸，并为每种酶混合物选择最优化的缓冲液。DpnII附带其专用缓冲液，且酶生产商为DdeI消化推荐了特定缓冲液。但在本方案中，对DpnII与DdeI的双酶消化推荐使用限制性酶切缓冲液（Restriction Buffer），因为该缓冲液可使两种酶的活性均达到100%。
染色体构象捕获技术的故障排除 
在染色体构象捕获实验中，交联、消化和重新连接这三个关键步骤均需在凝胶上观察结果之前完成。为了评估这三个步骤的质量并确定问题可能出在哪个环节，需在消化前（CI）和消化后（DC）分别取样，并与连接完成的Hi-C样品一同上样至凝胶（图2）。该凝胶用于评估Hi-C样品的质量，判断是否值得继续后续实验流程。若缺少CI和DC样品，则难以准确定位导致结果不佳的具体步骤。值得注意的是，连接效果不佳可能源于连接反应本身、末端补平步骤的问题，或交联步骤存在问题。为排查交联问题，应确保每个文库使用的细胞数不超过1 × 107个，并使用新鲜的交联试剂以及洁净的细胞（即用PBS洗涤过的细胞）。对于连接步骤，务必保持细胞和连接混合物处于冰上；在16 °C孵育4小时之前立即加入T4 DNA连接酶，并充分混匀。
文库制备问题排查 
如果在 PCR 滴定后需要超过 10 个 PCR 循环，或在凝胶上无法观察到 PCR 产物（图 4），有几种方法可以挽救 Hi-C 样本。从 PCR 滴定步骤往回排查，第一个选择是重新尝试 PCR。如果产物仍然不足，可在用 1× TLE 缓冲液洗涤磁珠两次后，再次进行末端 A 加尾和接头连接（步骤 3.6）。完成额外的 A 加尾和接头连接后，可按之前方法继续进行 PCR 滴定。如果仍然没有产物，最后的选择是从步骤 3.3 中重新回收 0.8× 的组分，并从此处继续后续操作。
Hi-C3.0 的局限性与优势 
需要认识到，Hi-C 是一种基于细胞群体的方法，用于捕获细胞群体中基因组位点对之间相互作用频率的平均值。虽然某些计算分析方法旨在从群体中解析出多种构象组合25，但原则上，Hi-C 无法识别细胞间的差异。尽管可以进行单细胞 Hi-C26,27，并可通过计算手段进行推断28，但单细胞 Hi-C 并不适合获取超高清分辨率的 3C 信息。Hi-C 的另一个局限性在于其仅能检测成对相互作用。为了检测多点接触相互作用，可采用高频切割酶结合短读长测序（Illumina）16，或利用 PacBio 或 Oxford Nanopore 平台进行长读长测序，开展多点接触 3C29 或 4C30。此外，已有针对姐妹染色单体之间及沿其长度方向接触检测而开发的 Hi-C 衍生技术31,32。
尽管Hi-C19和Micro-C33可用于生成亚千碱基分辨率的互作图谱，但二者均需要大量的测序读长，可能导致成本显著增加。为了在不增加成本的情况下达到相似甚至更高的分辨率，可采用针对特定基因组区域的富集方法（如capture-C34），或针对特定蛋白质相互作用的富集方法（如ChiA-PET35、PLAC-seq36、Hi-ChIP37）。这些富集技术的优点和缺点在于仅对有限数量的相互作用进行采样。通过此类富集手段，Hi-C的全局特性（以及全局标准化的可能性）将丧失。
Hi-C3.0 的重要性与潜在应用 
本实验方案旨在实现高分辨率、超深度的染色体构象捕获（3C），同时检测拓扑关联结构域（TADs）和区室等大尺度染色质折叠特征17（图6）。每个 Hi-C 文库起始样本量为每管 5 × 106 个细胞，此材料通常足以在流动池上对一至两个通道进行测序，获得多达 10 亿条成对末端读长。对于超深度测序，应根据比对上的读段数量和 PCR 重复率准备多管 5 × 106 个细胞。在最高分辨率（&#60;1 kb）下，染色质成环相互作用主要出现在 CTCF 结合位点之间，但也可检测到启动子-增强子之间的相互作用。有关数据分析的详细说明，请参见 Akgol Oksuz 等人17 的研究。

染色体构象捕获技术自2002年以来已被广泛应用1。从根本上讲，所有构象捕获变体均依赖于固定DNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用，以维持染色质的三维结构。随后进行DNA片段化，通常通过限制性酶切实现，最后将空间上邻近的DNA末端重新连接，从而将空间上接近的基因座转化为唯一的共价DNA序列。最初的3C实验方案采用PCR来检测特定的“一对一”相互作用。后续发展的4C实验可检测“一对所有”相互作用2，而5C技术则可检测“多对多”相互作用3。在引入下一代高通量测序（NGS）技术后，染色体构象捕获技术得以全面成熟，使得利用全基因组Hi-C4以及类似的3C-seq5、TCC6和Micro-C7,8等方法实现“全对全”基因组相互作用的检测成为可能（另见Denker和De Laat的综述9）。
在Hi-C技术中，生物素标记的核苷酸用于在酶切后、连接前标记5′突出端（图1）。这使得可通过链霉亲和素包被的磁珠富集正确酶切并重新连接的片段，从而与GCC10方法相区别。Rao等人11对Hi-C实验流程进行了重要改进，即在完整细胞核内（即in situ）进行酶切和重新连接，以减少非特异性连接产物。此外，用MboI（或DpnII）替代HindIII进行酶切，可减小片段大小，提高Hi-C的分辨率。分辨率的提升使得能够检测到较小尺度的染色质结构，并更精确地定位基因组上的接触位点，例如由环挤压（loop extrusion）形成的CTCF结合位点之间的DNA环状结构11,12。然而，这种高分辨率也带来了一些代价。首先，分辨率提高两倍需要测序读长远超四倍（22）的增长13。其次，片段尺寸减小会增加将未酶切的相邻片段误判为已酶切并重新连接片段的可能性14。如前所述，在Hi-C中，已酶切并重新连接的片段与未酶切片段的区别在于连接位点处存在生物素标记。然而，必须有效去除未连接末端的生物素，以确保仅富集真正的连接位点14,15。
随着下一代测序（NGS）成本的降低，研究染色体折叠的细节变得更加可行。为了减小DNA片段的大小，从而提高分辨率，Hi-C方案可以改进为使用切割频率更高的限制性内切酶16，或使用多种限制性内切酶的组合17,18,19。或者，在Micro-C中使用MNase7,8，在DNase Hi-C中使用DNase20，可通过滴定酶量实现最佳消化效果。
最近一项关于3C方法基本原理的系统性评估表明，采用1%甲醛（FA）进行初次交联，随后用3 mM DSG进行二次交联，可显著提高在各个长度尺度上对染色体折叠特征的检测效果17。此外，使用HindIII酶切的Hi-C方法在检测大规模折叠特征（如区室结构）方面表现最佳，而Micro-C在检测小规模折叠特征（如DNA环）方面更具优势。这些结果促使发展出一种单一的高分辨率“Hi-C 3.0”策略，该策略结合使用FA和DSG交联剂，并随后采用DpnII和DdeI两种限制性内切酶进行双酶切21。Hi-C 3.0提供了一种适用于常规使用的有效策略，因其能够准确检测所有长度尺度上的染色体折叠特征17。本文详细描述了Hi-C 3.0实验操作部分，并展示了测序后可预期的典型结果。
<img alt="染色质构象捕获方法示意图；包括固定、消化、连接、纯化步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：Hi-C 实验流程的六个步骤。 首先用 FA 固定细胞，然后使用 DSG（1）；接着进行细胞裂解，并用 DdeI 和 DpnII 进行双重酶切（2）；通过突出末端补平加入生物素，随后连接邻近的平末端（3），之后进行 DNA 纯化（4）；在超声打断和片段大小筛选前，去除未连接末端的生物素（5）；最后，通过生物素 pull-down 富集片段，进行接头连接并通过 PCR 扩增文库（6）。缩写：FA = 甲醛；DSG = 戊二酰亚胺基戊酸酯；B = 生物素。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

<table><tbody><tr><td>1 kb DNA标准分子量标记</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16500100</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 磁珠，60 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 离心过滤单元（CFU）</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC500396</td><td></td></tr><tr><td>退火缓冲液（5×）</td><td>参见补充材料中的配方</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP 10 mM</td><td>ThermoFisher</td><td>R0441</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-25i 高速制冷超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman 超速离心管 35 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>357002</td><td></td></tr><tr><td>结合缓冲液（2×）</td><td>参见补充材料中的配方</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物素-14-dATP 0.4 mM</td><td>Invitrogen</td><td>19524-016</td><td></td></tr><tr><td>BSA 10 mg/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td>由20 mg/mL稀释而来</td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Falcon</td><td>353089</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形聚丙烯管</td><td>Denville</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形管</td><td>Denville</td><td>C1017-P</td><td></td></tr><tr><td>Covaris 微量管 AFA 纤维带 snap-cap 130 &amp;micro;L</td><td>Covaris</td><td>520045/520077</td><td></td></tr><tr><td>Covaris 超声破碎仪</td><td>Covaris</td><td>E220/E220evolution/M220</td><td></td></tr><tr><td>培养瓶 175 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Falcon</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 150 mm × 25 mm</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>dATP 1 mM</td><td>Invitrogen</td><td>56172</td><td></td></tr><tr><td>dATP 10 mM</td><td>Invitrogen</td><td>56172</td><td></td></tr><tr><td>dCTP 10 mM</td><td>Invitrogen</td><td>56173</td><td></td></tr><tr><td>DdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0175L</td><td></td></tr><tr><td>dGTP 10 mM</td><td>Invitrogen</td><td>56174</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-5x10ML</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 混合液 25 mM</td><td>Invitrogen</td><td>10297117</td><td></td></tr><tr><td>Dounce 匀浆器</td><td>DWK Life Sciences</td><td>8853010002/8853030002</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DpnII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0543M</td><td></td></tr><tr><td>DSG</td><td>ThermoScientific</td><td>20593</td><td></td></tr><tr><td>dTTP 10 mM</td><td>Invitrogen</td><td>56175</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Fisher</td><td>A409-4</td><td>由100%稀释而来</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Fisher</td><td>BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td>甲醛（37%）</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>上样缓冲液（6×）</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸溶于超纯水 2.5 M</td><td>Sigma</td><td>G8898-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630 去垢剂</td><td>MP Biomedicals</td><td>198596</td><td></td></tr><tr><td>Klenow DNA 聚合酶 5 U/&amp;micro;L</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Klenow 片段 3--&gt;5&amp;rsquo; 外切酶缺陷型，5 U/&amp;micro;L</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>连接缓冲液（10×）</td><td>New England Biolabs</td><td>B7203S</td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LoBind 微量离心管 1.7 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>低分子量 DNA 标准分子量标记</td><td>New England Biolabs</td><td>N3233L</td><td></td></tr><tr><td>裂解缓冲液</td><td>参见补充材料中的配方</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁性颗粒分离器</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管 1.7 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>MyOne 链霉亲和素 C1 磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1（10×）</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3.1（10×）</td><td>New England Biolabs</td><td>B7203S</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70013-032</td><td></td></tr><tr><td>PCR（条状）管</td><td>Biorad</td><td>TBS0201/ TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>PCR 扩增仪</td><td>Biorad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Pfu Ultra II 缓冲液（10×）</td><td>Agilent</td><td></td><td>随 Pfu Ultra 提供</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA 聚合酶&amp;nbsp;</td><td>Agilent</td><td>600674</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 相锁管</td><td>Qiagen</td><td>129065</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 相锁管</td><td>Qiagen</td><td>129056</td><td></td></tr><tr><td>苯酚:氯仿:异戊醇</td><td>Invitrogen</td><td>15593-049</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合液</td><td>ThermoFisher</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K溶于超纯水 10 mg/mL</td><td>Invitrogen</td><td>25530-031</td><td></td></tr><tr><td>制冷离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>无RNase A、DNase和蛋白酶的RNase A 10 mg/mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>旋转混合仪</td><td>Argos technologies</td><td>EW-04397-40 或摇床平台</td><td></td></tr><tr><td>SDS 1%</td><td>Fisher</td><td>BP13111</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠 pH = 5.2，3 M</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell GT 水平电泳系统</td><td>Biorad</td><td>1704401</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶 1 U/&amp;micro;L</td><td>Invitrogen</td><td>100004817</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 聚合酶 3 U/&amp;micro;L</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>T4 连接缓冲液（5×）</td><td>Invitrogen</td><td>Y90001</td><td></td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶 10 U/&amp;micro;L</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5425</td><td></td></tr><tr><td>TBE 缓冲液</td><td>参见补充材料中的配方</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris 低 EDTA 缓冲液（TLE）</td><td>参见补充材料中的配方</td><td></td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100（10%）</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Truseq 接头寡核苷酸</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry</td><td>250 nmol，HPLC 纯化</td></tr><tr><td>吐温 20 去垢剂</td><td>Fisher</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>吐温洗涤缓冲液</td><td>参见补充材料中的配方</td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Scientific Industries</td><td>(G560)SI-0236</td><td></td></tr></tbody></table>

跨尺度染色体构象捕获

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

染色体构象捕获技术（3C）用于检测三维染色质相互作用。通常使用甲醛（FA）进行化学交联以固定染色质相互作用，随后通过限制性内切酶消化染色质，并对片段末端进行重新连接，从而将三维（3D）空间上的邻近关系转化为独特的连接产物。最后，在逆转交联、去除蛋白质并分离DNA后，将DNA打断并制备用于高通量测序。在细胞群体中，基因组位点对之间的邻近连接频率反映了它们在三维空间中共定位的频率。
一个测序后的Hi-C文库可提供全基因组范围内所有位点对之间相互作用频率的信息。Hi-C的分辨率和精确度依赖于高效的交联，以维持染色质接触，以及对染色质进行频繁且均一的片段化。本文描述了一种改进的 原位 Hi-C 3.0 协议通过联合使用两种交联剂（甲醛 [FA] 和二琥珀酰基戊二酸酯 [DSG]）提高交联效率，随后采用两种限制性内切酶（DpnII 和 DdeI）进行更精细的消化。Hi-C 3.0 是一种单一实验流程，可精确量化基因组在较小尺度上的折叠特征（如染色质环和拓扑关联结构域 [TADs]），以及在全细胞核较大尺度上的特征（如区室结构）。

本文中的图示数据来自Lafontaine等人先前发表研究的独立重复实验21。在获得高通量测序数据后，使用开放染色质集体（Open2C：https://github.com/open2c）对Hi-C数据进行处理。类似的分析流程可在4D核组项目的数据门户中找到（https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline）。简而言之，采用Nextflow流程distiller（https://github.com/open2c/distiller-nf）执行以下步骤：（1）将Hi-C分子的序列比对至参考基因组；（2）解析.sam比对文件并生成包含Hi-C配对信息的文件；（3）过滤PCR重复序列；（4）将配对信息聚合成分箱的Hi-C相互作用矩阵。这些以HDF5格式存储的矩阵（称为coolers）可进一步用于：（1）在HiGlass服务器（https://higlass.io/）上可视化；（2）利用“cooltools”工具集中的大量开源计算工具进行分析，该工具集由开放染色质集体维护（https://github.com/open2c/cooltools），用于提取和量化染色质折叠特征，如区室（compartments）、拓扑关联结构域（TADs）和染色质环（loops）。
在将测序读段对（read pairs）比对到参考基因组后，即可通过几个简单的指标立即评估Hi-C3.0文库的质量。首先，对于人类细胞，通常约有50%的测序读段对能够被唯一比对。由于染色体具有高分子聚合物的特性，大多数比对上的读段（约60%–90%）代表染色体内部的相互作用（顺式相互作用，cis），且相互作用频率随基因组距离的增加而迅速衰减（距离依赖性衰减）。距离依赖性衰减在“尺度图”（scaling plot）中可得到最佳可视化呈现，该图展示了接触概率（每条染色体臂）随基因组距离变化的函数关系。我们发现，使用不同的交联剂和酶可改变长距离和短距离范围内的距离依赖性衰减17。当DSG交联与Mnase酶或可产生较小片段的DpnII-DdeI组合联用时，可增强短距离相互作用的检测能力（图6A）。
距离依赖性衰减也可直接从二维相互作用矩阵中观察到：当远离中心对角线时，相互作用的发生频率逐渐降低图6B）。此外，可通过 Hi-C 矩阵和尺度图中偏离全基因组平均距离依赖性衰减的特征，识别出基因组折叠特征，如区室、拓扑关联结构域（TADs）和染色质环。重要的是，除甲醛（FA）外，使用 DSG 进行交联可减少随机连接事件，这类连接由于染色体的聚合物特性而无限制，因而更易发生在染色体之间（in trans）（图6C）。减少随机连接可提高信噪比，尤其对于染色体间相互作用和超长距离的相互作用（&gt;10-50 Mb 的染色体内相互作用。
<img alt="Hi-C 数据分析：染色质相互作用的接触概率、距离分离及热图展示" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6代表性 Hi-C 文库的比对与过滤结果。 (A) 使用不同酶进行消化，按片段长度（上图）和交联剂（FA 或 FA + DSG）类型（下图）排序的接触概率及其导数的缩放图。MNAse（microC）或 DpnII-DdeI（Hi-C 3.0）消化显著增加短程接触（上图），在 FA 基础上添加 DSG 也有类似效果（下图）。B) 图中各列显示了仅使用FA交联后DpnII消化，以及FA+DSG交联后DpnII或DdeI消化的Hi-C热图。白色箭头指示在DSG交联和DdeI消化后“点”信号强度增强，表明DNA环结构的检测效果更佳。各行显示染色体3在不断提高分辨率下的不同区域，与图C对齐：上行：整条染色体3（0–198,295,559 Mb）；中行：186–196 Mb；下行：191.0–191.5 Mb。 (C) 所示区域的覆盖度图 A黑色箭头表示仅使用甲醛（FA）交联时的较低覆盖度（%cis reads）。缩写：FA = formaldehyde；DSG = disuccinimidyl glutarate；chr = chromosome。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
并非所有比对上的读段都有用。第二个质量指标是PCR重复序列的数量。在连接和超声打断后，完全相同的重复读段几乎不可能随机产生。因此，这类读段很可能来源于PCR扩增，需要被过滤掉。当需要过多的PCR循环次数来扩增低复杂度文库时，通常会出现重复序列。一般而言，对于Hi-C文库，最终PCR扩增通常只需要5-8个循环，具体循环数通过滴定PCR确定（见步骤3.9；图4）。然而，即使经过14轮PCR扩增，仍可能获得足够复杂度的文库。
另一类重复序列读段被称为光学重复（optical duplicates），可能出现在使用规则化芯片（如HiSeq4000）的Illumina测序平台上。光学重复的产生原因包括：芯片过度加载，导致较大的簇被误识别为两个独立的簇；或在第一轮PCR扩增后，原始的成对末端分子发生局部重新簇集。由于这两类光学重复均具有局部性特征，因此可通过其在芯片上的位置与PCR重复进行区分。对于文库中具有 &gt;15%的PCR重复序列需要重新制备，含有光学重复序列的文库可在优化上样流程后重新上样。
补充表 S1：缓冲液与溶液。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001_Suppl%20TableS1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

Hi-C 3.0 是一种改进的 Hi-C 实验方案，结合使用甲醛和二琥珀酰亚胺基戊二酸酯交联剂，并采用 DpnII 和 DdeI 限制性内切酶混合酶切，以提高染色质相互作用检测的信噪比和分辨率。

染色体构象捕获技术（3C）用于检测三维染色质相互作用。通常使用甲醛（FA）进行化学交联……

该方案能够以低背景信号准确检测多个长度尺度上的染色体折叠特征。例如，可在染色体区室的背景下分析启动子-增强子相互作用。使用限制性内切酶可避免对输入材料的消化程度进行优化。无需通过凝胶分离进行筛选即可捕获连接产物。最常见的问题是DSG固定后细胞丢失，以及捕获足够量的DNA以构建高质量文库。首先，使用连接真空泵的巴斯德吸管从含有5 × 10⁶个细胞的150毫米培养皿中吸除培养基。用10毫升HBSS洗涤细胞两次。为交联细胞，将23.125毫升1%甲醛溶液加入15厘米培养皿中。室温孵育10分钟，每隔2分钟用手轻轻摇动培养皿。接下来，加入 1.25 毫升 2.5 摩尔的甘氨酸，轻轻摇动培养板以终止交联反应，然后在室温下孵育 5 分钟。随后将样品置于冰上继续孵育 15 分钟，以彻底停止交联反应。使用细胞刮棒或橡胶刮棒将细胞从培养板上刮下，并用移液器将细胞悬液转移至 50 毫升锥形管中。将悬液在室温下以1,000 × g离心10分钟，通过抽吸弃去上清液。用10毫升杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤沉淀物一次。然后，在进行DSG交联前再次离心。使用DSG进行交联时，将沉淀的细胞重悬于9.9毫升DPBS中。然后加入100微升300毫摩尔的DSG。通过倒置混匀管内溶液，并在旋转仪上室温条件下孵育40分钟以交联细胞。交联后，加入1.925毫升2.5摩尔的甘氨酸，颠倒混匀，并在室温下孵育5分钟。接着，将细胞在2,000 × g下离心15分钟，并将沉淀重悬于1毫升含0.05%牛血清白蛋白的DPBS中，然后转移至1.7毫升离心管。在4摄氏度下以2,000 × g离心15分钟，弃去上清液。在进行染色体构象捕获之前，将沉淀物在液氮中速冻。将交联的细胞等分试样重悬于1 mL冰预冷的裂解缓冲液中，其中含有10 µL蛋白酶抑制剂混合物，转移至Dounce匀浆器中，在冰上孵育15分钟。缓慢上下移动A型研杵30次以匀浆细胞，孵育1分钟使细胞冷却，然后再进行30次研磨。最后一次研磨后，将裂解液转移至1.7毫升离心管中。将裂解后的悬液在2,500 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，轻轻弹击或涡旋振荡以重新悬浮湿润的沉淀物。尽可能吸除上清液，以获得呈酸奶状且结块最少的物质。在离心前，将沉淀重悬于500 µL预冷的限制性缓冲液中。第二次洗涤后，根据细胞大小，向沉淀残留体积中加入约340 µL限制性缓冲液，再通过移液将沉淀重悬于总体积为360 µL的限制性缓冲液中。留出18微升裂解液用于检测染色质完整性（CI）。向剩余的裂解液中加入38微升1%十二烷基硫酸钠至hi-C管中，使总体积达到380微升，用移液器轻轻吹打混匀，避免产生气泡。将样品在65摄氏度下孵育10分钟（不振荡），以打开染色质结构，随后立即将管子置于冰上。用 Triton X-100 配制消化混合液后，取 107 微升该混合液加入 hi-C 管中，使总体积达到 487 微升，并在 37 摄氏度的恒温混匀仪中以间隔振荡方式过夜消化染色质。次日，将样品转移至 65 摄氏度加热 20 分钟，以灭活残留的内切酶活性。将样品置于冰上后，留出 10 微升消化对照（DC）样品，于 4 摄氏度保存。使用移液器或离心方法去除盖子上的冷凝液。然后加入58 µL生物素填补混合液，使总体积达到535 µL。在23°C条件下于恒温混匀仪中孵育4小时前，轻轻吹打混匀，避免产生气泡。孵育后，加入665 µL连接混合液，使样品体积达到1,200 µL。用移液器吹打混匀样品，在热混仪中于16°C孵育4小时。接着，将50 µL蛋白酶K分两次加入hi-C样品管中，于65°C过夜孵育，并间隔振荡。进行DNA纯化时，加入100%预冷乙醇，于4°C下以18,000 × g离心30分钟。从非沉淀侧彻底移除上清液，将样品空气干燥10分钟，或直至沉淀明显干燥。沉淀干燥后，通过移液或涡旋将其溶解于450 µL Tris低EDTA缓冲液中。将溶解后的悬浮液转移至截留分子量为3千道尔顿的0.5毫米离心过滤单元（CFU）中。以最大速度离心CFU 10分钟，弃去滤过液。第二次洗涤后，向柱中加入80微升Tris低EDTA缓冲液。将柱子放入新的收集管中，在最大转速下离心两分钟。最后，将样品上样至0.8%琼脂糖凝胶。PCR梯度结果的琼脂糖凝胶显示，大多数文库需要进行五到八个循环的最终PCR扩增。通过琼脂糖凝胶上较小片段观察到最终扩增的PCR文库的细胞消化情况，可确认正确连接接头的存在，并作为测序前的质量检查。测序后，比对数据显示，DpnII与DdeI的组合显著增加了短程相互作用，其效果相当于在传统甲醛交联基础上添加DSG。从二维相互作用矩阵中还可直接观察到长距离和短距离相互作用信号的改善。区室信号在远距离处表现为CRISPR，在由染色质环形成的短距离处则呈现更明显的点状结构。除了甲醛之外，使用DSG进行交联可减少随机连接，从而提高顺式相对覆盖度。在交联过程中及交联后，避免细胞丢失至关重要。细胞沉淀可能松散或不可见，且在某些缓冲液中细胞会粘附在移液器吸头。

capturing-chromosome-conformation-across-length-scales

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

跨长度尺度捕获染色体构象

Hi-C 方法能够无偏倚地在全基因组范围内鉴定染色质相互作用（1）。Hi-C...

Hi-C：一种研究基因组三维结构的方法

染色体捕获关联（ACT）检测是一种用于鉴定远端DNA相互作用的新型无偏倚方法。对远端DNA相互作用的表征将有助于我们确定在正常生理状态以及疾病状态下，细胞核结构与基因表达之间的关系。...

关联染色体捕获法用于鉴定远端DNA相互作用

本研究描述了一种生成高分辨率图像的实验方案 原位 紧密分期的原肠胚形成前Hi-C文库 黑腹果蝇...

从精确分期的早期Drosophila胚胎中构建全基因组染色质构象捕获文库

染色质成环在基因调控中起着重要作用；然而，目前尚无技术能够实现对染色质环的选择性且可逆的修饰。本文介绍了一种利用CRISPR-dCas9进行染色质环重排的强大系统（CLOuD9），该系统已被证明可选择性且可逆地调控靶向位点的基因表达。...

CRISPR介导的染色质环结构重排

鉴定基因与调控元件之间的物理相互作用具有挑战性，但染色体构象捕获技术为此提供了便利。该4C-seq方案的改进通过减少PCR模板的过度扩增，减轻了PCR偏好性，同时通过增加限制性内切酶消化步骤，提高了测序读段的可比对性。...

利用下一代测序技术对染色体构象捕获环化文库（4C-seq）进行基因调控序列的高通量鉴定

我们报道了在由胚胎干细胞生成的拟胚体中应用定量染色体构象捕获技术并结合高通量测序的方法。该技术可用于鉴定和定量分析在胚胎干细胞分化过程中特定基因的潜在增强子与启动子区域之间的相互作用。...

通过定量染色体构象捕获技术（4C）鉴定类胚体中的增强子-启动子相互作用

基因组在细胞核空间内以不同的结构形式组织，这些结构可通过染色体构象捕获技术揭示。细胞核内Hi-C方法可获得果蝇细胞系中全基因组范围的染色质相互作用数据，从而生成可在限制性酶切片段水平上以兆碱基分辨率进行分析的接触图谱。...

果蝇细胞核内Hi-C技术

本方案描述了染色质捕获结合高通量测序（Capture...

通过捕获式 Hi-C 解析高分辨率 3D 染色质结构 via Capture Hi-C

本文介绍了一种利用全基因组染色体构象捕获方法Micro-C-XL，以核小体分辨率绘制三维基因组结构的实验方案。...

利用 Micro-C-XL 绘制哺乳动物三维基因组相互作用

本文详细介绍了染色体构象捕获（3C）技术的一种改进方法，重点强调本科生的参与和学习过程。...

通过3C获得A：面向本科生的染色体构象捕获技术

我们提出了一种三色染色质单分子定位显微镜（SMLM）染色与分析方案，可实现常染色质、异染色质和RNA聚合酶II（RNAP...

一种用于在致密核环境中研究染色质的多标记单分子定位显微镜实验方案

学习Hi-C 3.0技术检测染色质相互作用的方法，利用甲醛和DSG交联剂结合限制性内切酶，实现高分辨率、低背景的染色体构象分析，为基因组三维结构研究提供可靠方案。

跨尺度染色体构象捕获

探索更多视频