小鼠肠间充质分离导致端细胞高产量

我们分离肠道间充质的方案导致端细胞的高产量。该方法为研究体内平衡和疾病中涉及端细胞的细胞 - 细胞相互作用提供了一个初始平台。端细胞是对可用的组织解离方案敏感的独特细胞。

因此，该技术的主要优点是分离间充质，包括富集的活端细胞。间充质，包括端细胞，可以作为有组织的离体生长所需的信号分子和生长因子的来源。首先，在含有冷无菌PBS的培养皿中清洗与安乐死小鼠分离的肠道。

将肠放入培养皿中。并使用球尖剪刀，纵向打开肠管，冲洗粪便。将肠道转移到含有新鲜冷PBS的新盘中。

再次清洗肠道后，将小肠切成一厘米长的段，然后将它们转移到装有八毫升PBS的15毫升锥形管中。以每秒一个或两个周期手动摇动试管一分钟。将溶液倒入培养皿中。

并使用镊子将段转移到装有20毫升溶液A的50毫升锥形管中，将管置于37摄氏度的轨道振荡器培养箱中20分钟。孵育后，用手以每秒四到五个周期剧烈摇动试管一分钟以解离上皮。再次重复此步骤。

如前所述切割和洗涤碎片后，将它们转移到装有10毫升无菌PBS的新50毫升管中，并以每秒一个或两个循环的速度倒置管一分钟。将溶液倒入培养皿中。将段转移到装有10毫升无菌PBS的新15毫升管中，并以每秒一到两个循环的速度轻轻上下倾斜两分钟。

在生物安全柜下，用镊子将切片放在无菌实验室湿巾上以干燥它们。干燥后，将段进一步切成块。使用镊子将切好的碎片转移到每孔装有四毫升预热消化溶液的六孔板中。

将板在 37 摄氏度下孵育 50 分钟，每 20 分钟手动轻轻摇动一次板。然后，使用巴斯德移液管将碎片转移到装有 4 毫升 DMEM 的 15 毫升锥形管中。以每秒四到五个周期手动摇动试管一分钟以获得单细胞悬液。

通过 100 微米过滤器将悬浮液过滤到 50 毫升锥形管中。将滤液在 700 克下在 4 摄氏度下离心五分钟。通过抽吸丢弃上清液，并将细胞沉淀重悬于5毫升2%FBS / PBS中。

将悬浮液在700g下再次离心5分钟后，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于12毫升培养基中。最后，将细胞悬液接种在六孔板中。间充质解离后，端细胞失去其细胞特征，呈现圆形细胞形态，并且与随后几天相比，第一天反映的GFP阳性细胞数量较少。

几天后，端细胞表现出小的、拉伸的细胞形态，细胞过程短。接种7至10天后，端细胞恢复其细胞特征，显示出具有长细胞质过程的大而拉伸的细胞形态。流式细胞术揭示细胞组成。

总体而言，基于DAPI染色，69%的分离细胞是活的。其中，60.9%代表上皮污染以及免疫和内皮细胞。端细胞分数分别分散在100k和70k FSC和SSC以上，几乎占门控间充质的10%。

FACS分析显示，端细胞亚群可以通过CD201和GP38阳性染色来定义。使用这些标记物对一天培养的间充质进行免疫染色，尽管细胞没有表现出其细胞特征，但这些分子标记物的表达。该过程产生可存活的基质细胞单细胞悬浮液，其不仅可用于2D培养，还可用于任何其他应用，例如与类器官进行3D共培养或生物打印。