从小鼠小肠免疫系统中分离淋巴细胞

本方案的总体目标是从肠道诱导部位（包括派伊尔集合淋巴结和肠系膜淋巴结）以及效应部位（包括固有层和上皮层）中分离淋巴细胞。该方法有助于解答黏膜免疫学领域的关键问题，例如理解机体对胃肠道感染、癌症及炎症性疾病的免疫应答机制。该技术的主要优势在于能够从小肠不同区室中分离出高纯度且具有活性的淋巴ocytes，同时最大限度地减少不同区室间的交叉污染。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为识别和分离肠系膜淋巴结及派伊尔结具有挑战性，同时在操作速度与精确性之间取得平衡以获得最佳得率也较为困难。开始实验前，将先前已麻醉的小鼠仰卧放置，并用70%乙醇喷洒其体表。使用剪刀沿中线做切口，切开皮肤和腹壁以暴露腹腔。

接下来找到盲肠，用镊子轻轻向下牵拉盲肠。用镊子小心地将小肠向右移动，暴露与结肠平行排列的整个肠系膜淋巴结（Mesenteric Lymph Nodes，简称 MLN）链。识别位于该链最底部、最靠近盲肠的淋巴结。

用一把镊子夹住其周围的肠系膜脂肪，并用另一把镊子轻轻夹住淋巴结周围的脂肪，将MLN链从底部向顶部移动。然后用收获液润湿一张纸巾，将MLN链置于纸巾上。通过在纸巾上滚动MLN链，并用两把镊子拉除脂肪，以去除肠系膜脂肪。

将MLN置于冷的收获培养基中，以备后续分离步骤使用。用剪刀在幽门括约肌下方和盲肠上方切断小肠。用一把镊子从小肠末端（回肠）向十二指肠方向缓慢拉出肠段，同时用另一把镊子去除附着的肠系膜脂肪。

将肠道置于用收获液浸湿的纸巾上，用两把镊子轻轻剥离残留的肠系膜脂肪。在整个操作过程中，定期滴加收获液以保持肠道湿润。使用弯头剪刀从肠道上剪下集合淋巴结（Peyer's patches）并收集。

从十二指肠至回肠方向，使用镊子的平端轻轻滑动，以排出小肠内的粪便和黏液。收集5-11个派伊尔结，置于冷的收获培养基中，用于后续分离步骤。

重复此步骤一次，以去除大部分黏液。使用一端为钝头的精细剪刀，将钝端插入肠管，沿肠管从十二指肠至回肠纵向剪开。将打开的肠管横向切成两厘米长的小段。

将肠段放入含有25毫升冷收集培养基的50毫升锥形管中，用于后续分离步骤。通过70微米细胞筛网，使用3毫升注射器的推杆轻轻研磨，从肠系膜淋巴结（MLN）中分离淋巴细胞。用5毫升冷收集培养基冲洗细胞筛网。

在4°C条件下，以400 × g离心5分钟，沉淀肠系膜淋巴结（MLN）细胞。然后将细胞沉淀物重悬于1毫升冷收获培养基中。将小肠组织碎片用25毫升冷收获培养基洗涤3次，每次通过倒置试管10次混匀。

让肠段自然沉降，倒去上清液。随后向装有肠段的50毫升锥形管中加入20毫升预热的二硫苏糖醇（DTE）溶液，并将内容物转移至含搅拌子的50毫升硅化锥形烧瓶中。将磁铁置于烧瓶外侧以固定搅拌子，再将组织和溶液转移回50毫升锥形管中。

然后在最大转速下涡旋振荡离心管10秒。通过70微米细胞滤网将上清液转移至新的50毫升锥形管中，注意将组织碎片保留在原管中。离心收集细胞沉淀。

将细胞沉淀重悬于10毫升冷收获培养基中，并置于冰上保存。向含有肠段的50毫升锥形管中加入20毫升预热的DTE溶液，然后转移回含有搅拌子的50毫升硅化锥形烧瓶中。使用烧瓶外侧的大磁铁固定搅拌子，再将组织和溶液转移回50毫升锥形管中。

将离心管在最大转速下涡旋振荡10秒。通过70微米细胞筛将上清液转移至含有第一次DTE处理上清液细胞的离心管中，并离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于8毫升室温的44%密度梯度（DG）溶液中。

将8毫升44% DG溶液和细胞悬液转移至一个17毫米×100毫米、14毫升的聚丙烯圆底管中。用5毫升室温67% DG溶液在细胞下方形成垫层。在室温下以1,600 × g离心25分钟，离心时不得使用刹车。

活细胞在44%和67%界面处形成乳白色细胞层。用真空抽吸法去除顶部的脂肪层。使用巴斯德吸管收集界面处的乳白色细胞层，并转移至含有40毫升冷收集培养基的50毫升锥形管中。

在4°C条件下，以400×g离心5分钟收集细胞，然后将细胞沉淀重悬于1毫升冷收获培养基中。向剩余的肠道组织碎片中加入25毫升预热的EDTA溶液，以去除上皮细胞，并将内容物转移至含有搅拌子的50毫升硅化锥形瓶中进行搅拌。搅拌过程中，用搅拌子固定住肠道组织碎片，小心弃去上清液，保留组织于锥形瓶中。

再重复一次上皮细胞去除步骤。接着加入 50 毫升室温收获培养基，用磁力搅拌器短暂搅拌内容物。然后让肠段自然沉降，小心弃去上清液。

加入30毫升预热的胶原酶溶液，并搅拌肠道组织碎片。搅拌后，将消化后的组织和上清液通过70微米细胞滤筛转移至50毫升锥形管中。使用3毫升注射器的推杆轻轻按压滤膜上的残留组织碎片，使其充分解离通过滤筛。

用10毫升冷收获培养基洗涤滤膜，并离心收集细胞。离心后，将细胞沉淀重悬于8毫升室温44%DG溶液中。将8毫升44%DG溶液的细胞悬液转移至一个新的70毫米×100毫米聚丙烯圆底管中。

用5毫升室温67%DG溶液铺底，然后离心梯度液。通过真空抽吸去除顶部脂肪层。使用巴斯德吸管在界面处收集血沉棕黄层，并转移至含有40毫升冷收集培养基的50毫升锥形管中。

最后，将细胞沉淀重悬于1毫升冷收获培养基中。每个肠道免疫区室均具有独特的淋巴细胞亚群组成。肠系膜淋巴结（MLN）主要由αβ T细胞构成，而派尔集合淋巴结（PP）淋巴细胞则主要为B细胞。

固有层淋巴细胞的主要组成为αβ T细胞和B细胞。上皮内淋巴细胞则主要由γδ T细胞和αβ T细胞构成，基本不含B细胞。固有层和上皮内淋巴细胞区室中的CD8α阳性αβ T细胞表达CD8α同源二聚体或CD8αβ异源二聚体，而诱导部位的CD8α阳性αβ T细胞主要表达CD8αβ异源二聚体。

IEL区室中的大多数γδ T细胞表达CD8α，而在MLN中发现的γδ T细胞则缺乏CD8α。在进行该操作时，重要的是要注意在组织分离步骤中投入足够的时间和细心操作，以限制不同肠区室之间的污染。完成该操作后，分离得到的淋巴细胞可进一步用于体外刺激、流式细胞术及其他技术，以进行更深入的表型和功能分析。