小鼠小肠免疫系统淋巴细胞的分离

该方案的总体目标是从肠道诱导位点（包括 Peyer 斑和肠系膜淋巴结）和效应位点（包括固有层和上皮）中分离淋巴细胞。这种方法可以帮助回答粘膜免疫学领域的关键问题，例如了解对胃肠道感染、癌症和炎症性疾病的免疫反应。该技术的主要优点是它确保从小肠的不同隔室中分离出高度纯化和有活力的淋巴细胞，同时将跨室污染降至最低。

通常，刚接触这种方法的个体会很困难，因为识别和分离肠系膜淋巴结和 Peyer 斑片以及平衡速度和精度以获得最佳产量具有挑战性。要开始该方案，请将先前麻醉的小鼠放在其背上并用 70% 乙醇喷洒。用剪刀做一个中线切口，打开皮肤和腹壁，露出腹膜腔。

接下来找到盲肠并使用镊子轻轻拉下盲肠。使用镊子小心地将小肠向右移动，露出与结肠对齐的整个肠系膜淋巴结或 MLN 链。确定链中距离盲肠最近的底部节点。

用一组镊子抓住周围的肠系膜脂肪，然后用另一组镊子镊子镊住淋巴结周围的脂肪，轻轻地将 MLN 链从底部移动到顶部。然后用收获培养基润湿毛巾，并将 MLN 链放在纸巾上。通过滚动纸巾上的链条并用两套镊子将脂肪拉下来，去除肠系膜脂肪。

将 MLN 置于冷收获培养基中，用于以后的分离步骤。用剪刀剪开幽门括约肌下方和盲肠上方的小肠。使用一组镊子将肠道从回肠缓慢拉出至十二指肠，同时使用另一组镊子去除附着的肠系膜脂肪。

将肠道放在蘸有收获培养基的纸巾上，然后用两套镊子梳理掉剩余的肠系膜脂肪。通过定期涂抹收获培养基，在整个步骤中保持肠道湿润。用弯曲的剪刀从肠道中取出 Peyer 的斑块来收集它们。

从小肠中收集 5-11 个 Peyer 贴片。将 Peyer 贴片放在冷收获培养基中，用于以后的分离步骤。使用镊子的平坦侧，从十二指肠轻轻滑向回肠，以排出粪便内容物和粘液。

重复此步骤一次以去除大部分粘液。使用一根钝头的细剪刀，将钝头插入肠道，将肠子从十二指肠纵向切开到回肠。将打开的肠子横向切成两厘米的小块。

将肠块放入装有 25 毫升冷收获培养基的 50 毫升锥形管中，用于以后的分离步骤。使用 3 毫升注射器的柱塞通过 70 微米细胞过滤器轻轻解离淋巴细胞，从 MLN 中分离淋巴细胞。用 5 毫升冷收获培养基清洗细胞过滤器。

通过在 4 摄氏度下以 400 倍重力离心 5 分钟来沉淀 MLN 细胞。然后将细胞沉淀重悬于 1 mL 冷收获培养基中。将试管倒置 10 次，用 25 毫升冷收获培养基清洗小肠块 3 次。

让肠块沉淀并倒出上清液。接下来，将 20 毫升预热的二硫赤藓糖醇或 DTE 溶液加入含有肠块的 50 毫升锥形管中，并将内容物转移到带有搅拌棒的 50 毫升硅化锥形瓶中。使用培养瓶外部的大磁铁固定搅拌棒，并将组织和溶液转移回 50 mL 锥形管中。

然后以最大设置涡旋试管 10 秒。通过 70 微米的细胞过滤器将上清液转移到新的 50 毫升锥形管中，小心地将组织块保持在原始管中。沉淀细胞。

细胞沉淀重悬于 10 mL 冷收获培养基中并储存在冰上。将 20 毫升预热的 DTE 溶液加入含有肠块的 50 毫升锥形管中，然后转移回含有搅拌棒的 50 毫升硅化锥形瓶中。使用培养瓶外部的大磁铁固定搅拌棒，并将组织和溶液转移回 50 mL 锥形管中。

以最大设置涡旋试管 10 秒。通过 70 微米细胞过滤器将上清液转移到含有来自第一次 DTE 处理上清液的细胞的试管中，然后离心细胞。在室温下将细胞沉淀重悬于 8 mL 44% 密度梯度或 DG 溶液中。

将 8 mL 44% DG 溶液和细胞悬液转移到 17 mm x 100 mm 的 14 ml 聚丙烯圆底管中。用 5 毫升 RT 67%DG 溶液垫住细胞。在 RT 下以 1， 600 倍重力离心 25 分钟，无需使用制动器。

活细胞在 44% 和 67% 界面处形成血沉棕黄层。通过真空抽吸去除顶部的脂肪层。使用巴斯德移液器在界面处收获血沉棕黄层，并转移到含有 40 毫升冷收获培养基的 50 毫升锥形管中。

通过在 4 摄氏度下以 400 倍重力离心 5 分钟来沉淀细胞，然后将细胞沉淀重悬于 1 mL 冷收获培养基中。向剩余的肠块中加入 25 毫升预热的 EDTA 溶液，从肠组织块中去除上皮细胞，并将内容物转移到带有搅拌棒的 50 毫升硅化锥形瓶中并搅拌。握住搅拌棒，小心地丢弃上清液，同时将肠块保留在培养瓶中。

再重复一次上皮细胞去除步骤。接下来加入 50 毫升室温收获培养基，并用磁铁短暂搅拌内容物。然后让肠块沉淀并小心丢弃上清液。

加入 30 毫升预热的胶原酶溶液，搅拌肠块。搅拌后，通过 70 μm 细胞过滤器将消化的组织和上清液转移到 50 mL 锥形管中。使用 3 毫升注射器的柱塞轻轻解离剩余的组织碎片，使其捣碎过滤器。

用 10 毫升冷收获培养基洗涤过滤器并沉淀细胞。离心后，将细胞沉淀重悬于 8 毫升环境温度 44%DG 溶液中。将 8 mL 44%DG 溶液细胞悬液转移到新鲜的 70 mm x 100 mm 聚丙烯圆底管中。

用 5 mL 环境温度 67%DG 溶液垫底，然后离心梯度。通过真空抽吸去除顶部的脂肪层。使用巴斯德移液器在界面处收获血沉棕黄层，并转移到含有 40 毫升冷收获培养基的 50 毫升锥形管中。

最后，将细胞沉淀重悬于一毫升冷收获培养基中。每个肠道免疫区室都以淋巴细胞亚群的独特组成为代表。MLN 主要由 α β T 细胞组成，而 PP 淋巴细胞主要是 B 细胞。

LP 淋巴细胞组成主要由 α、β T 细胞和 B 细胞组成。IEL 主要是 γ δ T 细胞和 α β T 细胞，基本上没有 B 细胞。LP 和 IEL 区室内的 CD8 α 阳性 α β T 细胞表达 CD8 α 同源二聚体或 CD8 α β 异二聚体，而诱导位点 CD8 α 阳性 α β T 细胞主要表达 CD8 α β 异二聚体。

IEL 区室中的大多数 γ δ T 细胞表达 CD8 α，而在 MLN 中发现的 γ δ T 细胞缺乏 CD8 α。在尝试此程序时，重要的是要记住在组织分离步骤中花费足够的时间和精力，以限制肠道隔室之间的污染。在此程序之后，可以对分离的淋巴细胞进行离体刺激、流式细胞术和其他技术，以进行进一步的表型和功能分析。