小鼠小肠淋巴细胞的分离和流式细胞表征

该程序的总体目标是从不同的小肠隔室中分离单细胞群，这些细胞群随后可用于流式细胞术分析或其他表征方法。这种方法可以帮助回答粘膜免疫学中的关键问题，例如微生物群如何影响肠道免疫系统的发育。该技术的主要优点是它们快速、可重现且不需要费力的 percoll 梯度。

要开始此程序，将小鼠背侧朝下放置并用 70% 乙醇喷洒腹部，依次切割皮肤，然后沿着腹侧中线从耻骨联合到剑突的腹膜进行剖腹手术，从而暴露腹膜腔。接下来，通过横切幽门括约肌将小肠与胃分开。轻轻地从腹膜中取出小肠，并梳理掉肠系膜脂肪。

要完全切除小肠，请在回盲部交界处进行第二次切割。将分离的小肠放入含有 10% FBS 的 4 摄氏度 RPMI 培养基中，以最大限度地提高细胞活力。使用弯曲的镊子轻轻去除大块脂肪，并小心避免在此过程中撕裂肠道组织本身。

要去除肠道内容物，用固定在注射器上的 18 号饲针插管小肠的近端，然后用 15 至 20 毫升冷 PBS 轻轻冲洗肠道。用剪刀切除位于小肠肠膜侧的 Peyer 贴片，表现为多分叶白色肿块。然后，将它们放入含有 5% FBS 的冷 RPMI 培养基中。

接下来，将小肠切成三到四英寸的段，在蘸有 RPMI 的纸巾上滚动每个小肠段以去除残留的脂肪，然后用钝手术刀将脂肪从组织中梳理开。严格注意完全去除肠系膜脂肪对于确保淋巴细胞的活力至关重要，因为即使是微小的脂肪也会导致细胞死亡。之后，用弯曲的镊子将肠段插管并抓住组织的远端，将组织翻过来，然后用一对直镊子轻轻地从近端去除组织段，导致组织倒置。

将组织段放入装有 30 毫升提取培养基和搅拌棒的杯子中。盖上盖子，在 37 摄氏度下搅拌 15 分钟。搅拌应剧烈，但不要湍流。

15 分钟后，使用钢过滤器将组织块与含有上清液的上皮细胞分离，上皮细胞应该看起来浑浊。在 RPMI 培养基中手动搅拌组织块以洗去残留的提取培养基。然后，将纸巾放在干纸巾上，翻转数次，以利于去除提取培养基未释放的残留粘液。

随后，将组织碎片放入装有 600 微升消化培养基的单点 5 毫升试管中。将组织切碎，直到碎片不再粘在剪刀上并且溶液看起来均匀。此步骤对于确保组织完全酶消化至关重要。

将组织切碎，直到碎片不再粘在剪刀上并且溶液看起来均匀，这对于确保细胞产量以及确保结果的可重复性至关重要。将切碎的小肠加入装有 25 毫升消化培养基的杯子中，并在 37 摄氏度下搅拌 30 分钟。在消化过程中，用血清移液管上下输送，以帮助分解任何大块组织。

接下来，通过 100 微米的细胞过滤器将消化组织过滤到 15 毫升的试管中。用 20 毫升含 10% FBS 的 RPMI 培养基冲洗过滤器。然后，将过滤后的溶液在 4 摄氏度下离心 10 分钟。

小心倒出上清液，并将沉淀重悬于一毫升含有 10% FBS 的 RPMI 培养基中。通过 40 微米的细胞过滤器将重悬的细胞过滤到 15 毫升的试管中。用 20 毫升含 10% FBS 的 RPMI 冲洗过滤器。

随后，将过滤后的溶液在 4 摄氏度下离心 10 分钟。小心倒出上清液，并将沉淀重悬于含有 2% FBS 的 1 毫升 RPMI 培养基中。在此过程中，将切除的 Peyer's Patches 转移到装有 25 毫升消化培养基和搅拌棒的杯子中。

盖上盖子，在 37 摄氏度下旋转 10 分钟。然后，将消化的 Peyer's Patches 通过 40 微米的细胞过滤器过滤到 15 毫升的试管中。如果仍有结块，请使用 1 毫升注射器柱塞的平端将它们压入过滤器。

然后，用 10 毫升含有 10% FBS 的 RPMI 培养基冲洗过滤器。将过滤后的溶液在 4 摄氏度下离心 10 分钟。然后，小心倒出上清液，并将沉淀重悬于含有 2% FBS 的 1 mL RPMI 培养基中。

小肠淋巴细胞单细胞悬液的流式细胞术分析应产生具有与脾细胞相似的前向和侧向散射特征的离散细胞群。如果在分离的初始阶段没有将组织保持在 4 摄氏度，淋巴细胞可能会开始死亡，从而导致淋巴细胞群具有较低的前向散射，并且更难与其他上皮细胞和死细胞分离。此外，如果肠系膜脂肪没有从小肠组织中完全去除，淋巴细胞将几乎完全丢失。

通常，小肠 LP 淋巴细胞的活力为 80%。一旦掌握，就可以在不到 4 小时的时间内处理四只小鼠并准备好用于染色的单细胞悬液。在此过程中，重要的是要完全去除所有肠系膜脂肪并充分切碎组织以确保完全消化。

在此程序之后，单细胞悬液可用于流式细胞术以外的目的，例如体外实验、基因表达分析或过继转移，以进一步表征这些细胞的功能。开发后，这项技术为粘膜免疫学的研究人员探索小鼠肠道免疫系统的个体发育和功能意义铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何通过清理肠系膜脂肪、提取上皮层、用胶原酶消化组织，从不同的小肠隔室中分离单细胞悬液有了很好的了解。