分离，鉴定和小鼠胸腺上皮细胞的分离纯化
2014年8月8日
在这里，我们描述了用于分离，鉴定和小鼠胸腺上皮细胞（TECs的）的纯化的有效方法。该协议可以用于胸腺功能的正常T细胞发育，胸腺机能障碍，和T细胞重建研究。
该程序的总体目标是分离、鉴定和纯化胸腺上皮细胞或技术。这是通过首先酶促消化和机械破坏胸腺以将技术解离成单细胞悬液来实现的。接下来，该技术可以通过流式细胞术进行分析或通过淘选策略进行富集。
最终，胸腺上皮亚群可以通过荧光激活细胞分选来纯化。这种方法可以帮助回答 T 细胞发育领域的许多关键问题，例如，胸腺上皮细胞如何促进胸腺选择？什么原因导致衰老动物的胸腺功能障碍，我们如何在体外实现 T 细胞重建？
该技术的主要优点是可变 emmic germa 细胞的高回收率、emmic 上皮细胞的无偏倚富集以及最终可以通过细胞分选实现的高纯度。要分离胸腺基质细胞，首先要识别胸腺，它就在肋骨下方，看起来像两个薄薄的白色叶覆盖在心脏上。然后断开胸腺周围的结缔组织，并使用弯曲的锯齿镊子轻轻拉动并去除胸腺叶。
将裂片放入含有 5 毫升培养基的 6 孔板中，并修剪周围的脂肪和结缔组织。然后将修剪过的叶转移到装有 5 毫升新鲜制备的酶溶液的新孔中，并使用细剪刀在组织中做小切口。将板放入 37 摄氏度的培养箱中。
20 分钟后，用 5 ml 移液器轻轻上下移液数次，将浆液解离成单细胞悬液。将上清液部分收集在含有 10 mL 富含冷白蛋白缓冲液的 50 mL试管中，并在冰上中和酶。然后向剩余的组织中加入 2.5 毫升酶溶液。
将板孵育 15 分钟。之后，用配备 18 基因针头的 3 毫升注射器轻轻搅动组织，以打碎任何聚集体。然后转移到收集管中。
然后向剩余的组织中加入 2.5 毫升酶溶液。将板孵育 15 分钟。第三次孵育后，用 20 个 5G 针头重复机械搅拌。
在组织孵育最后 5 到 10 分钟后，将上清液转移到收集管中进行离心，以通过流式细胞术鉴定回收的技术。按照标准抗体染色程序，在多参数流式细胞仪上运行样品，并使用适当的传真分析软件分析数据，以通过淘选方法进一步丰富技术。首先，将细胞与适当的抗体一起孵育以进行富集。接下来，将细胞悬液添加到预先编码的淘选板中，然后旋转板并在室温下孵育。
30 分钟后，用力旋转板，然后将上清液转移到锥形管中。用新鲜的培养基冲洗板两次，将洗涤液汇集在收集管中。然后，在离心细胞后，将沉淀重悬于 5 mL 新鲜培养基中，并将细胞悬液转移到新的淘选板中，如刚才所示，在旋转和孵育后收集细胞，以进一步将富集的技术纯化到胸腺细胞亚群中。
用适当的抗体标记后，通过 100 微米喷嘴通过荧光激活细胞分选对技术进行分选，以每体积 30% 体积的 FBS 收集培养基中的细胞。在这种通过流式细胞术鉴定技术的代表性设门策略中，可以观察到 epca 的表达，而不是该技术的 CD 45 的表达。因此，可以根据他们的 ep、camm 和 CD 45 表达技术进行门控，技术由皮质或 CEC 和髓质或 mtech 胸腺上皮亚群组成。
这些亚群可以通过活的 51 抗体来区分，活的 51 抗体识别 ctec 表达的 G 谷氨酰氨基肽酶和凝集素 UEA one，后者与 mtech 结合，ctech 和 Mtech 在其表面表达 MHC 2 类。尽管 mtech 可以进一步分为 mtech 低和 mtech 高人群，但根据它们的 MHC 二表达水平，与具有胶原酶和椎间盘空间的方案相比，使用刚刚证明的基于连接酶的方案可以恢复的技术大约八倍，大约是 9 乘以 10 到五分之一，能够仅从一个小鼠胸腺中恢复，以减少分选时间并提高活力回收的基质细胞。正如刚才所证明的那样，与整个制备的胸腺细胞相比，可以使用淘选来消耗胸腺细胞部位。
在后富集细胞群中，技术含量的比例从不到 0.5% 增加到 15% 以上。平移后，技术子集的比例不会改变，这表明在平移过程中不会选择性地丢失任何子集。与梳理细胞富集样本相比，科技的回收率约为 85%看完这个视频，你应该对如何通过恐慌来富集多个主题生殖细胞，以及如何通过流式细胞术识别和纯化更多的主题上皮消沉有很好的了解。
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概述
本文介绍了一种用于分离、鉴定和纯化小鼠胸腺上皮细胞（TECs）的方法。该协议旨在促进对胸腺功能、T细胞发育和胸腺功能障碍的研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 细胞生物学
- 胸腺功能
背景
- 胸腺上皮细胞在T细胞发育中起着关键作用。
- 了解TECs可以提供对胸腺选择过程的洞察。
- 胸腺功能障碍与衰老和各种疾病相关。
- T细胞重建对于治疗策略至关重要。
研究目的
- 分离和纯化TECs以进行详细分析。
- 研究胸腺选择机制。
- 探索衰老中胸腺功能障碍的原因。
使用的方法
- 酶解和胸腺的机械破碎。
- 流式细胞术用于TECs分析。
- 采用滚动策略丰富TECs。
- 荧光活化细胞分选用于纯化TECs亚群。
主要结果
- 成功分离和纯化TECs。
- 识别参与T细胞发育的关键TECs亚群。
- 对胸腺选择机制的洞察。
- 对T细胞重建治疗的潜在影响。
结论
- 所描述的方法对研究TECs有效。
- 研究结果有助于理解胸腺功能和功能障碍。
- 未来的研究可以在此协议基础上探索T细胞发育。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolating rare stromal populations like thymic epithelial cells enables mechanistic de-risking of T-cell development hypotheses and supports predictive confidence in immunotherapy target validation. This method provides a disease-relevant system for studying thymic selection and dysfunction, directly informing preclinical model design and translational biomarker discovery. By improving recovery and viability of rare cell subsets, it reduces biological ambiguity in early discovery and enhances portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of thymic epithelial cell function in T-cell commitment and selection pathways.
- Operational Value: Provides unbiased enrichment of rare TECs from murine thymus, increasing yield approximately eightfold over collagenase-based methods.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by allowing multiparameter flow cytometry identification of cortical and medullary TEC subsets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified TEC subsets suitable for downstream functional assays like gene expression profiling and Western blot.
- Operational Value: Reduces cell sorting time and minimizes viability loss through thymocyte depletion via panning prior to FACS.
- Operational Value: Enables standardized preparation of single-cell suspensions from thymic stroma for reproducible immunological assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling of thymic dysfunction in aging and immune reconstitution studies.
- Operational Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation by providing purified TECs for in vitro T-cell reconstitution.
- Scientific Value: Enables mechanistic de-risking of targets involved in thymic selection and T-cell development pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology to lead identification continuum by providing validated stromal inputs for immunological target assessment and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of thymic epithelial roles in positive and negative T-cell selection through isolatable, analyzable subsets.
- Screening: Delivers assay-ready, purified TEC populations with enhanced recovery and reduced sorting time for compound or modulator screening.
- Analytics: Enables quantitative multiparameter flow cytometry and molecular profiling (PCR, Western blot) for objective comparison of TEC states.
- Translational Research: Connects to preclinical T-cell reconstitution models by providing purified TECs capable of supporting lymphoid development in vitro.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for isolating rare thymic stromal cells applicable across immunology and immunotherapy discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in T-cell development models by enabling reliable isolation and characterization of rare TEC subsets.
- Operational Value: Improves reproducibility and scalability through enzymatic-mechanical dissociation and panning-based enrichment prior to FACS.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by improving target validation in thymus-dependent immunological pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insights into thymic selection and stromal-immune crosstalk.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymatic tissue dissociation, flow cytometry staining, and fluorescence activated cell sorting.
- Dependent on access to cell culture incubators, centrifuges, flow cytometers, and panning plates coated with appropriate substrates.
- Necessitates standardization of enzyme digestion times and mechanical agitation steps to ensure consistent single-cell suspension quality.
- Requires adaptation considerations when applying to different mouse strains, ages, or disease models affecting thymic cellularity and stromal composition.
- Practical limitations include the rarity of TECs necessitating enrichment steps and the need for careful viability maintenance during prolonged sorting.
