Name: 符合GMP的基因修饰T细胞生成程序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 学习符合GMP标准的基因修饰T细胞制备流程，采用人原代T细胞进行病毒转导。该方法成本低廉，无需昂贵封闭系统，适用于CAR-T等细胞治疗研发，为血液恶性肿瘤治疗提供高效可行的技术方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本研究由欧盟和希腊国家资金通过竞争力、创业和创新运行计划共同资助，项目属于“研究-创造-创新”计划（项目编号：T2EDK - 00474）。我们还要感谢生命选择基金会为细胞治疗研究所GMP实验室&#34;Dimitris Lois&#34;提供的持续支持。

本研究获得了帕特雷大学伦理委员会和帕特雷大学综合医院机构审查委员会的批准。在获取生物样本之前，已从健康个体获得知情同意。参与者的资格评估根据机构程序进行，并符合JACIE关于白细胞单采术的标准。如果本方案将在临床细胞治疗（ACT）环境中实施，则所有操作必须遵守药品生产质量管理规范（GMP）指南，并在符合GMP标准的洁净室中进行。使用病毒载体时需采取特殊安全防护措施，相关操作应在专用的生物安全柜内进行。在本研究中，所描述的操作均在经过验证的H35 HEPA低氧工作站（见材料表）中进行，以确保环境受控且可监控。所有有害液体的去污应使用10%次氯酸钠溶液进行。
1. PBMC 的分离与 T 细胞激活（第 0 天）
<ol>
	<li>根据初始体积，从供体单采袋（leukopaks，参见材料表）中收集细胞至50 mL离心管中。</li>
	<li>使用15 mL完全造血培养基（含5% HSA的商用无血清造血培养基，参见材料表）对细胞袋进行两次冲洗。</li>
	<li>进行基于多糖的密度梯度离心，按1:2（试剂:样本）比例稀释。在室温下以800 × g 离心30分钟，关闭刹车（A/D，9/0）。</li>
	<li>使用微量移液器将外周血单个核细胞（PBMCs）收集至洁净的50 mL离心管中。</li>
	<li>用1× PBS洗涤细胞两次，每次加至50 mL（400 × g，10分钟，室温）。将细胞重悬于5 mL完全培养基中。</li>
	<li>使用台盼蓝染色，通过标准血细胞计数板或自动细胞计数仪（参见材料表）进行细胞计数。</li>
	<li>用完全培养基稀释细胞，使细胞浓度达到2&#160;× 106 个细胞/mL。</li>
	<li>每2 × 106 起始细胞加入10 µL T细胞刺激试剂（参见材料表），激活20 × 106 PBMCs。 
	注：本方案设计用于激活20 × 106 PBMCs，但可根据需要调整以适用于更多细胞数量。</li>
	<li>加入重组人IL-2（rhIL-2，20 U/mL）（参见材料表），轻轻混匀，并将混合液转移至合适的容器中（例如6孔板）。</li>
	<li>将细胞在37 °C、5% CO2 条件下孵育72小时。</li>
</ol>
2. 慢病毒T细胞转导（第3天）
<ol>
	<li>将细胞培养物转移至合适的容器中，例如50 mL锥形管。充分混匀后，在300 x g 室温（RT）孵育10分钟，以去除活化试剂。小心彻底弃去上清液。&#160;将沉淀重悬于1 mL完全培养基中。 
	注意：在此阶段，可将病毒在冰上解冻。</li>
	<li>使用台盼蓝对细胞进行计数。</li>
	<li>将细胞重悬于完全培养基中&#160;中等浓度，以达到可铺板 0.5 x 10 的浓度要求6 细胞置于24孔板中，每孔总体积为400 µL。加入rhIL-7（155 U/mL）和rhIL-15（290 U/mL）（参见 材料表). 
	注意：需考虑所添加病毒的体积，参见步骤 2.4。</li>
	<li>在另一管中，加入 Vectofusin-1（参见 材料表) 加入Opti-MEM培养基中，终浓度为10 µg/mL，体积与将使用的病毒液体积相等。 
	注意：计算 Vectofusin-1 浓度时需考虑细胞培养的总体积。参见步骤 2.3。或者，可使用 GMP 级试剂 Vectofusin-1 GMP。</li>
	<li>将浓缩的病毒以40的感染复数（MOI）与Vectofusin-1/Opti-MEM混合液（1:1比例）混合，充分混匀。将此混合液加入细胞培养物中，必要时用完全培养基调整每孔总体积至400 µL。</li>
	<li>将盖子盖在培养板上，用石蜡膜密封，然后在1000 x g条件下离心 g 在32 °C下孵育2小时。随后，在37 °C、5% CO₂条件下孵育培养板2 过夜。</li>
</ol>
3. 病毒清除与T细胞扩增（第4天）
<ol>
	<li>收集细胞，并将其汇集至合适的容器中，例如50 mL离心管。</li>
	<li>在室温（RT）下以400 × g 离心5分钟。小心彻底去除上清液，并将沉淀重悬于1 mL完全培养基中。</li>
	<li>使用台盼蓝对细胞进行计数。将细胞重悬于完全培养基中，调整浓度至1 × 106 个细胞/mL。加入rhIL-7（155 U/mL）和rhIL-15（290 U/mL）（参见材料表）。</li>
	<li>将细胞以0.3–0.5 × 106 个细胞/cm2 的密度转移至合适的容器中，例如T25培养瓶，在37 °C、5% CO2 条件下培养2天。 
	&#8203;注意：若需要获得更大数量的细胞群体，可在含有rhIL-7和rhIL-15的条件下每2天进行一次传代（1:2），培养条件同上，直至达到所需细胞数量。</li>
</ol>
4. 冷冻保存（第14天）
注意：在此步骤中，转移冻存管至储存位置时需要使用冰。冻存的时机取决于所需的细胞数量。在本方案中，当细胞扩增至第14天并达到25倍扩增时进行冻存。
<ol>
	<li>当达到所需细胞数量时，收集细胞并转移至50 mL离心管中（根据总体积调整离心管数量）。</li>
	<li>在室温（RT）下以400 × g 离心5分钟。小心彻底去除上清液，并将沉淀重悬于10 mL培养基中。如有需要，可合并多个离心管中的细胞。</li>
	<li>使用台盼蓝对细胞进行计数。为每项质量控制（QC）检测（参见第5节）保留一份1 × 106 细胞的等分试样，用于评估病毒载体拷贝数和转导效率。</li>
	<li>在室温下以400 × g 离心10分钟。此时，相应标记冻存管。</li>
	<li>彻底去除上清液，并将沉淀重悬于冻存液中，冻存液由50% HSA和40% HBSS组成，细胞浓度为每冻存管1 × 107 细胞/mL。将细胞悬液转移至相应数量的冻存管中，并向每管加入10%二甲基亚砜（DMSO）。</li>
	<li>将冻存管置于冰上，并立即转移至程序降温仪中进行冷冻保存。冷冻保存完成后，将冻存管转移至受监控的液氮罐中长期保存。</li>
</ol>
5. 质量控制（第14天）
注意：在放行检测中，产品需经过多项测试，包括微生物生长的无菌检测和内毒素水平评估。这些检测在帕特雷大学综合医院和帕特雷大学的认证实验室中进行。支原体的存在由本实验室采用生化检测试剂盒进行检测，并按照制造商说明在发光仪上测定（见材料表）。细胞表型（图1）、细胞数量及活力分别由本实验室通过流式细胞术（见第5.1节）和自动细胞计数仪&#160;（见材料表）进行评估。放行标准依据已发表的数据和关于GMP生产细胞产品的建议10,11制定（表1）。
<ol>
	<li>进行转导效率-流式细胞术染色（第14天） 
	注意：取1 × 106个细胞用于活率（7-AAD）和CD3标志物2染色，以评估转导效率（见材料表）。如果需要检测目的基因（例如CAR T细胞的情况），特异性抗体的颜色应与CD3标志物和7-AAD不同，以避免补偿问题。应设置适当的对照样本。
	<ol>
		<li>将样品放入FACS管中，并加入500 µL FACS缓冲液。</li>
		<li>在室温下以400 × g离心5分钟。</li>
		<li>用移液器完全弃去上清液，将沉淀重悬于1:5稀释的CD3:FACS缓冲液溶液中（见材料表）。</li>
		<li>涡旋混匀样品，在冰上避光孵育30分钟。</li>
		<li>加入500 µL FACS缓冲液，在400 × g离心5分钟（室温）。</li>
		<li>完全弃去上清液，将沉淀重悬于1:20稀释的7-AAD:FACS缓冲液溶液中（见材料表）。</li>
		<li>涡旋混匀样品，在冰上避光孵育10分钟。</li>
		<li>加入200 µL FACS缓冲液，使用流式细胞仪分析样品（见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li>
<li>Brentjens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra38(2013).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+remissions+following+chimeric+antigen+receptor+modified+T+cells+directed+against+CD19+%28CTL019%29+in+patients+with+relapsed+or+refractory+CD19%2B+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sustained remissions following chimeric antigen receptor modified T cells directed against CD19 (CTL019) in patients with relapsed or refractory CD19+ lymphomas.</a> Blood. 126 (23), 183(2015).</li>
<li>Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+manufacturing+of+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Global manufacturing of CAR T cell therapy.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).</li>
<li>Wang, X., Rivière, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+manufacturing+of+CAR+T+cells%3A+foundation+of+a+promising+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Clinical manufacturing of CAR T cells: foundation of a promising therapy.</a> Molecular Therapy - Oncolytics. 3, 16015(2016).</li>
<li>Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+advantages+of+cell+therapy+manufacturing+under+Good+Manufacturing+Practices+within+the+hospital+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting.</a> Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).</li>
<li>Kaiser, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+commercial+process+for+the+manufacture+of+genetically+modified+T+cells+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Towards a commercial process for the manufacture of genetically modified T cells for therapy.</a> Cancer Gene Therapy. 22 (2), 72-78 (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+quality%2C+non-clinical+and+clinical+aspects+of+medicinal+products+containing+genetically+modified+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Medicines+Agency%22%5BJournal%5D)">Guidelines on quality, non-clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modified cells.</a> European Medicines Agency. , EMA/CAT/GTWP/671639/2008 Rev. 1 - corr., Committee for Advanced Therapies (CAT) (2020).</li>
<li>Castella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+CAR+T-Cell+production+%28ARI-0001%29+using+a+closed+semi-automatic+bioreactor%3A+experience+from+an+academic+phase+I+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Point-of-care CAR T-Cell production (ARI-0001) using a closed semi-automatic bioreactor: experience from an academic phase I clinical trial.</a> Frontiers in Immunology. 11, 482(2020).</li>
<li>Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviruses+as+gene+transfer+agents+for+delivery+to+non-dividing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Lentiviruses as gene transfer agents for delivery to non-dividing cells.</a> Current Opinion in Biotechnology. 9 (5), 457-463 (1998).</li>
<li>Ausubel, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+CGMP-grade+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+International%22%5BJournal%5D)">Production of CGMP-grade lentiviral vectors.</a> Bioprocess International. 10 (2), 32-43 (2012).</li>
<li>Van der Loo, J. C. M., Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+challenges+in+viral+vector+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and challenges in viral vector manufacturing.</a> Human Molecular Genetics. 25 (R1), R42-R52 (2016).</li>
<li>Rad, S. M. A. H., Poudel, A., Tan, G. M. Y., McLellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+choice%3A+Who+should+drive+the+CAR+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Promoter choice: Who should drive the CAR in T cells.</a> PLoS One. 15 (7), e0232915(2020).</li>
<li>Sandrin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+pseudotyped+with+a+modified+RD114+envelope+glycoprotein+show+increased+stability+in+sera+and+augmented+transduction+of+primary+lymphocytes+and+CD34%2B+cells+derived+from+human+and+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors pseudotyped with a modified RD114 envelope glycoprotein show increased stability in sera and augmented transduction of primary lymphocytes and CD34+ cells derived from human and nonhuman primates.</a> Blood. 100 (3), 823-832 (2002).</li>
<li>Costello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+stimulated+and+unstimulated+T+lymphocytes+by+HIV-1-derived+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into stimulated and unstimulated T lymphocytes by HIV-1-derived lentiviral vectors.</a> Gene Therapy. 7 (7), 596-604 (2000).</li>
<li>Radek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectofusin-1+improves+transduction+of+primary+human+cells+with+diverse+retroviral+and+lentiviral+pseudotypes%2C+enabling+robust%2C+automated+closed-system+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Vectofusin-1 improves transduction of primary human cells with diverse retroviral and lentiviral pseudotypes, enabling robust, automated closed-system manufacturing.</a> Hum Gene Therapy. 30 (12), 1477-1493 (2019).</li>
<li>Hanenberg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+retrovirus+and+target+cells+on+specific+fibronectin+fragments+increases+genetic+transduction+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Colocalization of retrovirus and target cells on specific fibronectin fragments increases genetic transduction of mammalian cells.</a> Nature Medicine. 2 (8), 876-882 (1996).</li>
<li>Lamers, C. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retronectin-assisted+retroviral+transduction+of+primary+human+T+lymphocytes+under+good+manufacturing+practice+conditions%3A+tissue+culture+bag+critically+determines+cell+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Retronectin-assisted retroviral transduction of primary human T lymphocytes under good manufacturing practice conditions: tissue culture bag critically determines cell yield.</a> Cytotherapy. 10 (4), 406-416 (2008).</li>
<li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> Journal of Virology. 74 (21), 10074-10080 (2000).</li>
<li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+%28CAR-T%29+cells+expanded+with+IL-7%2FIL-15+mediate+superior+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li>
<li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+manufacturing+of+non-activated+potent+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).</li>
<li>Wang, R. -N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocols+for+%CE%B3%CE%B4+T+cell+expansion+and+lentiviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimized protocols for γδ T cell expansion and lentiviral transduction.</a> Molecular Medicine Reports. 19 (3), 1471-1480 (2019).</li>
<li>Yuan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+and+optimization+of+protocols+for+producing+recombinant+lentivirus+carrying+the+anti-Her2+chimeric+antigen+receptor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis and optimization of protocols for producing recombinant lentivirus carrying the anti-Her2 chimeric antigen receptor gene.</a> The Journal of Gene Medicine. 20 (7-8), e3027(2018).</li>
<li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closed-system+manufacturing+of+CD19+and+dual-targeted+CD20%2F19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+using+the+CliniMACS+Prodigy+device+at+an+academic+medical+center%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T cells using the CliniMACS Prodigy device at an academic medical center.</a> Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).</li>
<li>Mock, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+manufacturing+of+chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+adoptive+immunotherapy+using+CliniMACS+Prodigy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Automated manufacturing of chimeric antigen receptor T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy.</a> Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).</li>
</ol>

N.S. 开发了实验方案并撰写了手稿，A.S. 对其进行了审阅和监督；K.S.、G.A. 进行了额外的实验；D.K.、M.L. 在实验过程中提供了重要支持，V.Z.、N.T. 参与了审稿过程。N.T. 是 ProtATonce Ltd. 的成员。其余作者声明不存在利益冲突。

由于慢病毒载体能够转导分裂和非分裂细胞，因此作为基因递送工具，在细胞与基因治疗领域具有重要意义12。然而，使用符合GMP标准的方法大规模生产慢病毒载体仍面临诸多挑战，原因在于转染方法和纯化步骤等多种参数可能导致慢病毒批次间的差异。学术机构通常从慢病毒生产的生物技术公司获取病毒原液，这些公司会提供有关病毒功能性和安全性的文件，以满足放行标准13,14。
成功的转导方案不仅依赖于病毒原液的质量，还取决于靶细胞的状态。外周血单个核细胞（PBMCs）的有效刺激至关重要，因为激活步骤的失败可能导致转导效率低下。此外，启动子和包膜蛋白的选择也会影响转导方案的效率15,16。不同的转导增强剂具有独特的性质，可促进病毒颗粒成功进入靶细胞17,<sup...

过继性细胞疗法（Adoptive Cell Therapies, ACT）和嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）-T细胞的出现，为现代临床实践带来了革命性的变革，确立了个性化医疗的新范式。特别是靶向CD19的CAR-T细胞已展现出卓越的临床疗效，代表了B细胞恶性肿瘤中最先进的T细胞治疗手段1,2,3,4,5。然而，目前商业化基因修饰T细胞疗法在基因转移方面高度依赖病毒载体。在学术环境中，尤其是在符合药品生产质量管理规范（Good Manufacturing Practice, GMP）条件下应用病毒载体实施ACT，面临诸多重大挑战，包括扩增能力受限、需要专用设备、依赖高技能人员，以及需使用符合GMP标准的试剂进行质粒介导的病毒颗粒生产6,7,8。
因此，基因修饰T细胞疗法的制造过程十分复杂，通常始于从白细胞分离产物中分离外周血单个核细胞（PBMC）。通常从PBMC群体中富集T细胞，并使用抗CD3/CD28微复合物进行激活7,9。随后，通过病毒或非病毒载体对T细胞进行基因修饰，这些载体可在现场制备或外包生产。为了达到输注所需的细胞数量，需对基因修饰后的细胞进行扩增，然后进行最终制剂和/或冷冻保存。最后，细胞产品必须通过基于多项质量控制检测的放行标准9。
本方案介绍了一种利用简单技术在符合GMP条件的情况下对健康外周血单个核细胞（PBMCs）进行ex vivo操作，以制备基因修饰T细胞产品的综合性方法。该方案采用慢病毒载体，该载体可由病毒生产公司外包提供，并完成所有必要的定量/功能性、纯度及安全性检测（例如病毒滴度、宿主细胞DNA复制型慢病毒的检测）。在本研究中，所使用的载体为基于VSV-g（水疱性口炎病毒G蛋白）的第二代慢病毒载体，其中目的基因为绿色荧光蛋白（GFP），并实现组成型表达。

<table><tbody><tr><td>24孔TC处理板</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>5 mL FACS管&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon管</td><td>Greiner biomedica</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>6孔TC处理板</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS CANTO II</td><td>BD Biosciences</td><td>V96300084</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Applichem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数仪&amp;nbsp;</td><td>Corning Cell Cytosmart</td><td>J21E0081</td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Greiner biomedica</td><td>122263</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液（D-PBS）</td><td>Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>FACS缓冲液（1× D-PBS，0.5% BSA，2 mM EDTA）</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 软件 v10.6.2&amp;nbsp;</td><td>TreeStar Inc</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Gibco CTS Opti-MEM I 培养基</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A4124801</td><td></td></tr><tr><td>GMP级rhIL-15</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-114</td><td></td></tr><tr><td>GMP级rhIL-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-146</td><td></td></tr><tr><td>GMP级rhIL-7</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-111</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo;s 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Life Technologies</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>HEPA Whitley H35 低氧工作站</td><td>Don Whitley Scientific</td><td>HA0315172H</td><td></td></tr><tr><td>人血清白蛋白（HSA）</td><td>Baxter</td><td>B05AA01</td><td></td></tr><tr><td>Junior LB 9509 便携式发光仪</td><td>Berthold Technologies</td><td>6506</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X 前病毒定量试剂盒</td><td>Takara Bio</td><td>631239</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP T细胞激活试剂</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-156</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人&amp;nbsp; CD3 抗体（克隆：UCHT-1）</td><td>BD Biosciences</td><td>557706</td><td></td></tr><tr><td>MycoAlert Plus 支原体检测试剂盒</td><td>Lonza Bioscience</td><td>LT07-703</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 可伸展密封膜胶带 5 cm × 75 m</td><td>D.Dutscher</td><td>90261</td><td></td></tr><tr><td>PeriStem PS-650-DB（血细胞分离袋）</td><td>Biomed Device</td><td>SC00816</td><td></td></tr><tr><td>Planer Kryo10 Series III</td><td>Planer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>Greiner biomedica</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝 0.4% 溶液</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Vectofusin-1 GMP</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-165</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO™ 15 无血清造血细胞培养基</td><td>Lonza Bioscience</td><td>A1048501</td><td></td></tr></tbody></table>

一种符合药品生产质量管理规范的基因修饰t细胞制备流程

A GMP-Compliant Procedure for the Generation of Gene-Modified T cells

过继性细胞治疗（Adoptive Cell Therapy, ACT）领域因基因改造细胞的发展而发生了革命性变化，特别是嵌合抗原受体（CAR）-T细胞。这些经过修饰的细胞在血液系统恶性肿瘤患者中已显示出显著的临床疗效。然而，这类疗法的生产成本高昂，且需要进行 extensive 的质量控制评估，限制了其在更广泛患者群体中的可及性。为解决这一问题，许多学术机构正在探索在符合国家和国际监管机构所制定指南的前提下，自行生产基因改造细胞的可行性。
大规模生产基因修饰T细胞产品面临诸多挑战，尤其是在机构生产能力以及满足输注剂量需求方面。其中一个主要挑战是在符合药品生产质量管理规范（GMP）的条件下大规模生产病毒载体，该步骤通常外包给外部公司。此外，简化T细胞转导流程有助于减少不同生产批次之间的差异性，降低成本，并便于人员培训。在本研究中，我们介绍了一种针对原代人T细胞的简化慢病毒转导流程，以荧光标记基因作为目标基因。整个流程遵循符合GMP标准的操作规范，并在本学术机构内部实施。

转导效率的评估 
通过流式细胞术检测转导细胞中目的基因（GFP）的表达情况。代表性结果如图1所示。在第14天，超过95%的细胞为CD3+，表明T细胞成功激活并扩增。在CD3+细胞群中，转导效率为58.7%（TD，图1C），而未转导细胞（UNTD，图1B）的转导效率为0.51%。活率分析显示，在排除7-AAD+细胞后，超过95%的细胞存活（图1A）。数据分析使用FlowJo软件（见材料表）完成。
扩增特征的评估 
从第4天至冷冻保存当天（第14天），转导后的细胞在含重组人IL-7（rhIL-7，155 U/mL）和重组人IL-15（rhIL-15，290 U/mL）的培养...

本方案概述了将目的基因转导至原代人T细胞的过程，确保符合药品生产质量管理规范（GMP）标准。

一种符合药品生产质量管理规范的基因修饰T细胞制备流程

过继性细胞治疗（Adoptive Cell Therapy, ACT）领域因基因改造细胞的发展而得到彻底革新，尤其是嵌合抗原受体……

本方案描述了一种简化且符合良好生产规范（GNP）的人源原代T细胞转导目的基因的方法。该技术旨在实现成本效益高且符合GNP要求，无需使用目前许多学术中心常见的昂贵封闭式生产平台。该方法可潜在应用于基因修饰细胞治疗产品的制备，包括但不限于嵌合抗原受体T细胞（CAR T细胞），后者已成为治疗血液系统恶性肿瘤的范式转变。为了从供血者血液白细胞分离术后收集的细胞中分离外周血单个核细胞（PBMC），采用基于多糖的密度梯度离心法处理样本，保持试剂与样本比例为1:2，在室温下以800 G离心30分钟，离心时关闭刹车。然后使用微量移液器将PBMC收集至一个洁净的50毫升离心管中。用PBS通过离心洗涤细胞两次。在用完全造血培养基重悬洗涤后的细胞之前，通过向每200万个细胞加入10微升T细胞刺激试剂，活化约2000万个获得的细胞。接着，加入重组人白细胞介素-2至终浓度为20单位/毫升，轻轻混匀后转移至六孔板中。在进行病毒转导前，将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养72小时。第3天，将细胞培养物转移至50毫升锥形管中并充分混匀。在室温下以300×g离心10分钟，以去除活化试剂。完全弃去上清液，将沉淀物重悬于1毫升完全培养基中，然后进行细胞计数。使用完全培养基调整细胞悬液的体积，使细胞浓度达到在24孔板中每孔接种50万个细胞的要求。向细胞中加入适当浓度的重组人白细胞介素-7和重组人白细胞介素-15。在另一个离心管中，根据待使用的终病毒体积，将适量的vectofusin-1加入Opti-MEM培养基中。将此混合物与浓缩病毒以1:1的比例混合，确保充分混匀。随后，将含有病毒的混合液加入细胞中。如有必要，用完全培养基将每个孔的总体积调整至 400 微升。盖上培养板盖后，用石蜡膜密封，于 32 摄氏度下以 1000G 离心两小时。随后将培养板置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳环境中过夜孵育。第二天，收集每个孔中的细胞，并将其转移至一个50毫升离心管中。随后，在室温下以400×g离心5分钟。小心吸除上清液后，用1毫升完全培养基充分重悬细胞沉淀，然后进行细胞计数。然后用培养基调整细胞浓度，使每毫升含100万个细胞，并在培养前分别加入155单位/毫升的人重组白细胞介素-7和290单位/毫升的人重组白细胞介素-15。当细胞数量达到预期时，收集细胞并转移至50毫升离心管中，离心。去除上清液后，将沉淀重悬于10毫升培养基中进行细胞计数。再次离心后，彻底弃去上清液，并将沉淀重悬于冷冻保存液中，该溶液由50% HSA和40% HBSS组成，细胞浓度为每毫升冻存管1000万个细胞。将0.9毫升细胞悬液分别转移至所需数量的冻存管中，并向每管加入10%二甲基亚砜。将冻存管置于冰上，并迅速转移至程序降温仪中进行冷冻保存。然后将冻存的样品转移至受监控的液氮罐中进行长期保存。为评估转导效率，向荧光激活细胞分选（

a-gmp-compliant-procedure-for-the-generation-of-gene-modified-t-cells

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

符合GMP的基因修饰T细胞生成程序

一种快速、简便且经济高效的方案，用于制备供体来源的多病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（rCTL），以输注给存在CMV、Adv或EBV感染风险的异基因造血干细胞移植（HSCT）受者。该制备工艺符合GMP标准，有助于推动T细胞免疫治疗在专科中心以外的更广泛应用。...

多病毒特异性T细胞的制备用于预防和治疗异基因造血干细胞移植后病毒感染

该视频概述了通过CRISPR-Cas9系统制备基因修饰CAR T细胞的流程。将CRISPR和CAR慢病毒共同感染T细胞，可实现对目标基因的修饰，并合成嵌合抗原受体（CAR），最终生成基因修饰的CAR...

使用 CRISPR-Cas9 系统基因改造 CAR T 细胞

本视频演示了使用 CRISPR-Cas9 技术在人 T 细胞中进行基因编辑的实验方法。将原代 CD4+ 和 CD8+ T 细胞与靶向特定基因以实现基因敲除的 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物混合。通过电穿孔后，sgRNA 引导 Cas9 至目标 DNA...

一种用于T细胞基因编辑的CRISPR-Cas9技术

在我们首次进行的人体基因治疗临床试验中，将表达靶向CD19的嵌合抗原受体（CAR）的T细胞作为B细胞恶性肿瘤的试验性治疗手段。本文描述了利用Sleeping...

用于外周血和脐带血T细胞基因修饰的Sleeping Beauty及人工抗原呈递细胞的临床应用

化疗和放疗作为标准治疗手段，具有淋巴清除和免疫调节作用，可被用于增强T细胞免疫治疗的抗肿瘤疗效。本文概述了一种生成针对EGFRvIII特异性的嵌合抗原受体（CAR）T细胞的方法，并介绍了在胶质母细胞瘤标准治疗背景下给予该细胞的实施方案。...

在胶质母细胞瘤标准治疗背景下用于过继性治疗的CAR T细胞的制备

本文介绍一种通过将具有目标抗原特异性的现有T细胞受体（TCR）的TCRα或TCRβ链，与外周T细胞受体库中的互补半链配对，从而生成抗原特异性T细胞受体（TCR）的新方法。de...

生成中 从头合成 通过逆转录病毒转导中心半链获得抗原特异性人T细胞受体

本文介绍了一种通过CRISPR/Cas9系统对CAR-T细胞进行基因编辑的实验方案。...

使用 CRISPR/Cas9 在 CAR-T 细胞中敲除 GM-CSF

本文详细介绍了用于临床的嵌合抗原受体T细胞的制备工艺，特别是使用能够进行病毒转导和T细胞培养的自动化细胞处理设备。我们提供了相关建议，并描述了在早期临床试验的工艺开发与实施过程中应注意的潜在问题。...

自动化细胞处理器上的嵌合抗原受体T细胞制备

该方案简化了逆转录病毒载体的制备及小鼠T细胞的转导过程，有助于高效生成小鼠CAR-T细胞。...

高效生成小鼠嵌合抗原受体（CAR）-T细胞

本方案提供了一种简化的流程，用于生成和检测人源嵌合抗原受体调节性T细胞（CAR...

人源嵌合抗原受体调节性T细胞的制备

本方案描述了一种利用气体可渗透快速扩增（G-Rex）装置扩增过继性细胞治疗（ACT）产品（即嵌合抗原受体（CAR）-T细胞和细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞）的可扩展方法，可在具有临床相关性的条件下实现高效且稳定的细胞生长。...

高效快速生成符合GMP可扩展设备的CAR-T细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞

学习符合GMP标准的基因修饰T细胞制备流程，采用人原代T细胞进行病毒转导。该方法成本低廉，无需昂贵封闭系统，适用于CAR-T等细胞治疗研发，为血液恶性肿瘤治疗提供高效可行的技术方案。

一种符合药品生产质量管理规范的基因修饰T细胞制备流程

探索更多视频