从人多能干细胞生成功能性胰岛素分泌胰腺细胞的优化方案

将多能干细胞转化为人类β细胞的过程中，实现高效率且稳定的分化是一个显著的挑战。该挑战受到实验人员遵循实验方案的精确性和一致性的显著影响。此外，每次实验所获得的β细胞产量差异较大，可能导致多次实验间功能性β细胞的产量下降。

在糖尿病的胰岛和β细胞研究背景下，尸体供体胰岛的来源非常有限。因此，利用干细胞分化的β细胞可提供无限且充足的胰岛素分泌细胞来源。β细胞分化技术是本领域的关键性进展，具有诸多优势。

该技术使我们能够探索β细胞的发育与功能，从而更深入地理解糖尿病的病因以及β细胞功能障碍的机制。我们旨在将此技术应用于糖尿病遗传学相关的研究，主要目标是聚焦于某些可能影响β细胞及胰岛功能的基因突变。

该方案将有助于获取带有特定突变的人多能干细胞来源的胰岛细胞。在细胞传代前，用冷包被液包被六孔板，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。吸除含有人多能干细胞的六孔板中的干细胞培养基，每孔加入1毫升无钙镁DPBS。

第二次洗涤后，向每个孔中加入 500 µL 解离溶液，在室温下孵育 2 至 5 分钟。同时，吸去六孔板中的包被溶液，并向每个孔中加入 1 mL 无钙镁的 DPBS。在倒置显微镜下观察细胞解离过程。

当80%至90%的细胞呈现圆形并贴壁时，吸出六孔板各孔中的消化液。随后向六孔板中加入1毫升含有10 µM ROCK抑制剂的干细胞培养基。取10 µL消化后的细胞悬液加入离心管中，再加入等体积的台盼蓝染液。

轻轻混匀，使用血细胞计数板对细胞进行计数。细胞计数后，每孔加入 2 mL 干细胞培养基，其中含有 0.8 × 10⁶ 至 1 × 10⁶ 个细胞/mL 和 10 µM ROCK 抑制剂。迅速将培养板前后、左右各轻轻晃动三次。

将培养板放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。在培养2小时之前，迅速前后左右晃动培养板各10次。将第0天和第4天的基础培养基及补充物在冰上解冻。

每天用37°C水浴将一天培养基和洗涤培养基一各2毫升预热5分钟。接着，吸去六孔板各孔中的干细胞培养基，并加入2毫升洗涤培养基一。吸去洗涤培养基一后，立即向孔壁一侧加入2毫升一天培养基。

将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育24小时。在分化过程的第12天，用2毫升抗黏附冲洗液处理含有400微米微孔的六孔板。在倒置显微镜下观察孔板中是否存在气泡。

若未观察到气泡，则吸出抗黏附冲洗液，并立即每孔加入2毫升洗涤液二。随后吸出胰腺前体细胞培养基，每孔加入0.5毫升解离缓冲液。将细胞在室温下孵育2至5分钟。

当大部分细胞变圆但仍贴壁时，吸除消化缓冲液，并立即向每孔加入一毫升预热的聚集体培养基。使用P1000移液器枪头，轻轻吹打混悬细胞，上下吹打的同时交替采用环形运动，并从孔的顶部到底部移动，以使细胞在整个孔内均匀脱落。将解离后的细胞混合液转移至50毫升锥形管中。

加入一毫升集落培养基至六孔板中，以收集所有剩余细胞。接着，吸除微孔六孔板中的洗涤液二，并加入解离的细胞悬液。将细胞在37摄氏度下孵育24小时。

第二天，使用 P1000 移液枪头，将微孔六孔板中的细胞团簇缓慢收集至 50 毫升锥形管中。加入 1 毫升第 13 天培养基，以收集残留的细胞团簇，并将其转移至管中。静置 5 分钟，使细胞在重力作用下自然沉降至管底。

小心吸取离心管中的上清液，注意不要扰动细胞团块。然后，向管中加入2 mL第13天培养基。通过轻柔吹打混匀，避免吸到细胞团块。

将悬液转移至超低吸附的六孔板中。迅速前后、左右晃动培养板各六次。于37摄氏度孵育细胞48小时。

免疫荧光成像结果显示，这些细胞簇主要由共表达胰腺β细胞标志物的胰岛素生成细胞组成。β细胞特征基因的表达分析显示，约25%的细胞表达Nkx6.1，40%的细胞表达Pdx1。在葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验中，MEL-1来源的细胞簇在高葡萄糖浓度下分泌的胰岛素水平显著高于低葡萄糖浓度下的分泌水平。