通过纳秒脉冲电场调控雪旺细胞生长以促进体外周围神经再生

我们的研究重点是利用纳秒脉冲电场（nsPEF）刺激施万细胞，促进周围神经再生。由于大多数情况下神经再生较为困难，我们希望开发一种高效激活施万细胞的新方法。我们创新性地采用纳秒脉冲电场（nsPEF）来激活施万细胞。

我们很高兴地发现，纳秒脉冲电场（nsPEF）可能是实现周围神经再生的优选模式，且具有最小的刺激副作用。此外，我们的实验方案为后续深入而系统的科学研究提供了可靠基础。本实验室将持续探索nsPEF的应用。

在神经再生方面，我们将建立动物模型以促进体外测试，并评估nsPEF在体外应用的安全性。由于目前关于nsPEF在周围神经再生中应用的证据有限，我们希望能够在该领域取得突破。首先，将含有1 mL RSC96细胞悬液的冻存管置于37°C水浴中，同时快速振荡。

将细胞悬液转移至含有4到6毫升完全培养基的离心管中，充分混匀。以1000 ×g离心3到5分钟，弃去上清液，用3毫升完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含有6到8毫升完全培养基的培养瓶中，于37°C孵育过夜。

当细胞密度达到80%至90%时，弃去培养基，并用不含钙离子和镁离子的PBS冲洗细胞一至两次。然后向培养瓶中加入0.25%胰蛋白酶和0.53毫摩尔EDTA。孵育结束后，在显微镜下观察细胞脱落情况。

当大部分细胞变圆并迅速脱落时，立即将培养瓶移回工作区域并轻轻拍打。加入三到四毫升含10%FBS的培养基以终止消化。然后充分混匀培养瓶中的内容物，并吸除溶液。

离心细胞悬液。以1000 ×g离心五分钟。弃去上清液后，用一至二毫升新鲜培养基通过轻柔吹打重新悬浮细胞。

将细胞悬液以1:2的比例转移至新的T25培养瓶中，并加入7 mL培养基。首先，用1 mL DMEM培养基重悬培养的RSC 96细胞，然后将其转移至两侧带有电极的比色培养皿中。打开仪器电源开关，旋转旋钮以设定电场强度。

小心旋转电极，直至出现火花。根据预设的场强强度，使细胞接受五次纳秒脉冲电场刺激。处理后立即分开两个电极。

首先，取经电刺激的RSC96细胞，向96孔细胞培养板的每孔中加入100微升细胞悬液。从试剂盒中取10微升CCK-8溶液，加入96孔细胞培养板中。将培养板置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中，继续孵育30分钟至4小时。

在六孔板的每个孔中接种3 × 10⁵个细胞，每孔总体积为2 mL。将移液枪头垂直放置，在培养孔底部用枪头划一条水平线。吸去培养基后，用PBS洗涤细胞2至3次。

每孔加入 2 mL 无血清培养基，然后将培养板放入 37°C 培养箱中。在 0 小时和 24 小时时，于倒置显微镜下以 4 倍放大倍数拍摄图像，以观察细胞迁移的变化。CCK-8 检测结果显示，与对照组相比，5 kV/cm 组的 RSC96 细胞增殖显著加快。

相比之下，较高参数组的增殖速率比对照组和每厘米五千伏组更不稳定。划痕实验显示，每厘米五千伏组中RSC96细胞的迁移速率明显快于对照组和每厘米十千伏组。首先，取经电刺激培养的RSC96细胞。

然后使用组织学笔在盖玻片上细胞分布均匀的位置画圈。向细胞中加入 50 至 100 微升（µL）透化工作液，在室温下孵育 20 分钟。随后用 PBS 洗涤细胞三次，每次五分钟。

接下来，在圆圈内加入3% BSA，均匀覆盖组织，并在室温下孵育30分钟。随后，轻轻去除封闭液，向细胞中加入适当稀释的一抗。将细胞培养板放入湿盒中，在4°C条件下孵育过夜。

然后在持续振荡的条件下，用 PBS 洗涤细胞三次，每次五分钟。加入相应的二抗，在室温下孵育 50 分钟。孵育结束后，将盖玻片放入 PBS 中，在振荡条件下洗涤三次，每次五分钟。

然后让载玻片自然干燥，并向干燥的载玻片上加入DAPI染色液。最后，使用抗荧光淬灭封片剂封固干燥的盖玻片。使用特定的激发和发射波长采集图像。

对于Alexa Fluor 488 SCI 3和SCI 5，显微分析显示所有组别中均存在散在的细胞质S100-Beta阳性细胞（呈红色）。与对照组和10千伏/厘米组相比，5千伏/厘米组的S100-Beta荧光积分光密度增加。

在细胞爬行实验中，所有组别均观察到GFAP和Sox10阳性细胞，且细胞质呈散在分布。然而，5千伏/厘米组的GFAP表达水平显著低于对照组和10千伏/厘米组。5千伏/厘米组的RSC96细胞Sox10表达的平均灰度值显著升高，提示Sox10表达增强。