Name: 通过纳秒脉冲电场调节雪旺细胞生长以促进体外周围神经再生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学习使用纳秒脉冲电场（nsPEF）刺激雪旺细胞以促进周围神经再生的体外实验方法。该方案通过CCK-8和划痕实验评估细胞增殖与迁移，为神经修复研究提供可靠基础。

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本工作由国家重大科研仪器研制项目（编号：82027803）资助。

1. 冻存RSC96细胞的解冻
<ol>
	<li>将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37 °C水浴中快速振荡解冻，然后加入含有4-6 mL完全培养基的离心管中，充分混匀。</li>
	<li>以1000 × g 离心3-5分钟，弃上清液，将细胞重悬于3 mL完全培养基中。</li>
	<li>将细胞悬液加入含有6-8 mL完全培养基的培养瓶（或培养皿）中，于37 °C孵育过夜。</li>
	<li>次日，在显微镜下观察细胞生长状态和密度。</li>
</ol>
2. 细胞传代：
注意：当细胞密度达到 80%–90% 时，即可进行传代。
<ol>
	<li>弃去培养基，用不含钙、镁离子的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞1-2次。</li>
	<li>向培养瓶中加入0.25% (w/v) 胰蛋白酶-0.53 mM EDTA（T25培养瓶加1-2 mL，T75培养瓶加2-3 mL），于37 °C孵育1-2分钟。</li>
	<li>在显微镜下观察细胞脱落情况。若大部分细胞变圆并脱落，立即将培养瓶移回操作区，轻轻敲击培养瓶，加入含10% FBS的培养基3-4 mL以终止消化。</li>
	<li>混匀后吸取溶液，于1000 × g 离心5分钟。弃去上清液，加入1-2 mL新鲜培养基，轻轻吹打重悬细胞。</li>
	<li>按1:2比例将细胞悬液转移至新的T25培养瓶中，并加入7 mL培养基。</li>
</ol>
3. 纳秒脉冲电场设备的操作
<ol>
	<li>将 RSC96 细胞重悬于 1 mL DMEM 培养基中，并转移至两侧带有电极的比色培养皿中。</li>
	<li>打开电源开关。</li>
	<li>通过旋转仪器上的旋钮调节参数，以改变电场强度。本研究设定的电场强度分别为 5 kV/cm、10 kV/cm、20 kV/cm 和 40 kV/cm。</li>
	<li>缓慢旋转电极，直至出现火花，使细胞根据预设的电场强度接受 5 次纳秒脉冲电场（nsPEF）处理，随后立即分开两个电极。处理后，将接受 nsPEF 处理的实验组细胞与未处理的对照组细胞分别进行后续第 4–6 步操作，在一定时间的细胞培养后（本实验为 1 天）进行分析。</li>
</ol>
4. 细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测
<ol>
	<li>从经电刺激的RSC96细胞中制备特定浓度的细胞悬液。将100 µL细胞悬液加入96孔细胞培养板的每个孔中。根据CCK-8试剂盒的检测要求，控制试剂盒中细胞总数在1 × 103至1 × 106之间。</li>
	<li>从试剂盒中取10 µL CCK-8溶液，加入96孔细胞培养板中。在37 °C的CO2培养箱中继续孵育30分钟至4小时。</li>
	<li>测定吸光度。采用双波长法测量，检测波长为430–490 nm，参考波长为600–650 nm。</li>
	<li>根据细胞增殖实验结果确定后续实验所用的场强强度，并选择增殖状态良好的细胞用于后续实验。</li>
</ol>
5. 细胞划痕实验
<ol>
	<li>在六孔板的每个孔中接种 3 × 105 个细胞，每孔总体积为 2 mL。约 72 小时后，细胞将铺满孔底。分别对实验组和对照组进行检测。</li>
	<li>使用移液器枪头在培养孔底部划一条水平线。确保枪头保持垂直，尽量避免倾斜。</li>
	<li>吸除培养基，并用 PBS 洗涤 2–3 次。</li>
	<li>向每孔加入 2 mL 无血清培养基。</li>
	<li>将培养板放入 37 °C 培养箱中。在 0 小时和 24 小时，于倒置显微镜下以 4 倍放大倍数拍摄图像，观察细胞迁移的变化。</li>
</ol>
6. 免疫荧光
<ol>
	<li>细胞通透化：
	<ol>
		<li>将细胞悬液轻柔吹打后加入培养皿中，用组织学笔在盖玻片上细胞分布均匀的位置画圈。对照组和不同实验组需分别处理。</li>
		<li>加入50–100 µL通透工作液（0.25–0.5% Triton X-100），室温（RT）孵育20分钟。用PBS洗涤三次，每次5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血清封闭：在画好的圈内加入3% BSA，均匀覆盖组织。室温孵育30分钟。</li>
	<li>一抗孵育：轻柔吸除封闭液，向细胞孔中加入适当稀释的一抗（小鼠来源，稀释比例为1:300）。将细胞培养板放入湿盒中，4 °C孵育过夜。</li>
	<li>二抗孵育：将细胞板置于摇床上，洗涤三次，每次5分钟。加入相应的二抗（CY3标记的山羊抗小鼠IgG，稀释比例为1:300），室温孵育50分钟。</li>
	<li>DAPI核染色：
	<ol>
		<li>将盖玻片置于含PBS（pH 7.4）的摇床上，洗涤三次，每次5分钟。</li>
		<li>轻柔干燥载玻片后，在圈内加入DAPI染色液（2 µg/mL，每圈0.5 mL），在避光环境中室温孵育10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封片：将盖玻片置于含PBS（pH 7.4）的摇床上，洗涤三次，每次5分钟。轻柔干燥载玻片后，用抗荧光淬灭封片剂封固盖玻片。</li>
	<li>图像采集：DAPI激发波长为330–380 nm，发射波长检测为420 nm；AF488激发波长为465–495 nm，发射波长检测为515–555 nm；CY3激发波长为510–560 nm，发射波长检测为590 nm；CY5激发波长为608–648 nm，发射波长检测为672–712 nm。</li>
</ol>

Enhancing Peripheral Nerve Regeneration with nsPEF-Stimulated Schwann Cells

<ol><li>Jing, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+electrical+stimulation+with+different+electric-field+intensities+in+the+regulation+of+the+differentiation+of+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells.</a> ACS Chem Neurosci. 10 (1), 348-357 (2018).</li>
<li>Nocera, G., Jacob, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Schwann+cell+plasticity+involved+in+peripheral+nerve+repair+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury.</a> Cell Mol Life Sci. 77, 3977-3989 (2020).</li>
<li>Aguilar, Z. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAguilar%2C+Z+%22Nanomaterials+for+Medical+Applications%22">Nanomaterials for Medical Applications</a>. , Newnes. (2012).</li>
<li>Xie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+functional+Schwann+cells+from+adipose-derived+stem+cells+in+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of functional Schwann cells from adipose-derived stem cells in defined conditions.</a> Cell Cycle. 16 (9), 841-851 (2017).</li>
<li>Rosenbalm, T. N., Levi, N. H., Morykwas, M. J., Wagner, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+via+repeated+biphasic+conducting+materials+for+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Sci+Mater+Med%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation via repeated biphasic conducting materials for peripheral nerve regeneration.</a> J Mater Sci Mater Med. 34 (11), 1-18 (2023).</li>
<li>Daly, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+characterization+of+multiple+biomaterial+conduits+for+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Comparison and characterization of multiple biomaterial conduits for peripheral nerve repair.</a> Biomaterials. 34 (34), 8630-8639 (2013).</li>
<li>Lee, B. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-to-side+neurorrhaphy+using+an+electrospun+PCL%2Fcollagen+nerve+conduit+for+complex+peripheral+motor+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">End-to-side neurorrhaphy using an electrospun PCL/collagen nerve conduit for complex peripheral motor nerve regeneration.</a> Biomaterials. 33 (35), 9027-9036 (2012).</li>
<li>Kim, V., Gudvangen, E., Kondratiev, O., Redondo, L., Xiao, S., Pakhomov, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peculiarities+of+neurostimulation+by+intense+nanosecond+pulsed+electric+fields%3A+how+to+avoid+firing+in+peripheral+nerve+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Peculiarities of neurostimulation by intense nanosecond pulsed electric fields: how to avoid firing in peripheral nerve fibers.</a> Int J Mol Sci. 22 (13), 7051(2021).</li>
<li>Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+transplantation+therapy+for+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cell transplantation therapy for spinal cord injury.</a> Nat Neurosci. 20 (5), 637-647 (2017).</li>
<li>Chen, Y. Y., McDonald, D., Cheng, C., Magnowski, B., Durand, J., Zochodne, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+and+Schwann+cell+partnership+during+nerve+regrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Axon and Schwann cell partnership during nerve regrowth.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 64 (7), 613-622 (2005).</li>
<li>Yi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+modulates+Schwann+cell+proliferation%2C+migration+and+differentiation+following+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Tau modulates Schwann cell proliferation, migration and differentiation following peripheral nerve injury.</a> J Cell Sci. 132 (6), (2019).</li>
<li>Min, Q., Parkinson, D. B., Dun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrating+Schwann+cells+direct+axon+regeneration+within+the+peripheral+nerve+bridge%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Migrating Schwann cells direct axon regeneration within the peripheral nerve bridge.</a> Glia. 69 (2), 235-254 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., Zhao, Q., Chen, Q., Xu, L., Yi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of peripheral nerve regeneration.</a> Mol Neurobiol. 60 (1), 329-341 (2023).</li>
<li>Nishi, M., Kawata, M., Azmitia, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophic+interactions+between+brain-derived+neurotrophic+factor+and+S100%CE%B2+on+cultured+serotonergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Trophic interactions between brain-derived neurotrophic factor and S100β on cultured serotonergic neurons.</a> Brain Res. 868 (1), 113-118 (2000).</li>
<li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-sc8+inhibits+Schwann+cell+proliferation+and+migration+by+targeting+EGFR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">miR-sc8 inhibits Schwann cell proliferation and migration by targeting EGFR.</a> PLoS One. 10 (12), e0145185(2015).</li>
<li>Dong, H. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK+regulates+mitochondrial+oxidative+stress+in+C2C12+myotubes+induced+by+electrical+stimulations+of+different+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Nan+Fang+Yi+Ke+Da+Xue+Xue+Bao%22%5BJournal%5D)">AMPK regulates mitochondrial oxidative stress in C2C12 myotubes induced by electrical stimulations of different intensities.</a> Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 38 (6), 742-747 (2018).</li>
<li>Beebe, S. J., Blackmore, P. F., White, J., Joshi, R. P., Schoenbach, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosecond+pulsed+electric+fields+modulate+cell+function+through+intracellular+signal+transduction+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Meas%22%5BJournal%5D)">Nanosecond pulsed electric fields modulate cell function through intracellular signal transduction mechanisms.</a> Physiol Meas. 25 (4), 1077(2004).</li>
<li>Haberkorn, I., Siegenthaler, L., Buchmann, L., Neutsch, L., Mathys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+single-cell+bioconversion+efficiency+by+harnessing+nanosecond+pulsed+electric+field+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Enhancing single-cell bioconversion efficiency by harnessing nanosecond pulsed electric field processing.</a> Biotechnol Adv. 53, 107780(2021).</li>
<li>Ruiz-Fernández, A. R., Campos, L., Gutierrez-Maldonado, S. E., Núñez, G., Villanelo, F., Perez-Acle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosecond+pulsed+electric+field+%28nsPEF%29%3A+Opening+the+biotechnological+Pandora%27s+box%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Nanosecond pulsed electric field (nsPEF): Opening the biotechnological Pandora's box.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), 6158(2022).</li>
<li>Nuccitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-in-human+trial+of+nanoelectroablation+therapy+for+basal+cell+carcinoma%3A+proof+of+method%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">First-in-human trial of nanoelectroablation therapy for basal cell carcinoma: proof of method.</a> Exp Dermatol. 23 (2), 135-137 (2014).</li>
<li>Nuccitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-thermal+nanoelectroablation+of+UV-induced+murine+melanomas+stimulates+an+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">Non-thermal nanoelectroablation of UV-induced murine melanomas stimulates an immune response.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 25 (5), 618-629 (2012).</li>
<li>Carr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nanosecond+pulsed+electric+field+%28nsPEF%29+can+affect+membrane+permeabilization+and+cellular+viability+in+a+3D+spheroids+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">A nanosecond pulsed electric field (nsPEF) can affect membrane permeabilization and cellular viability in a 3D spheroids tumor model.</a> Bioelectrochemistry. 141, 107839(2021).</li>
<li>Hornef, J., Edelblute, C. M., Schoenbach, K. H., Heller, R., Guo, S., Jiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+analysis+of+infrared+irradiation-assisted+nanosecond-pulsed+tumor+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Thermal analysis of infrared irradiation-assisted nanosecond-pulsed tumor ablation.</a> Sci Rep. 10 (1), 5122(2020).</li>
<li>Zuo, K. J., Gordon, T., Chan, K. M., Borschel, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+to+enhance+peripheral+nerve+regeneration%3A+Update+in+molecular+investigations+and+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation to enhance peripheral nerve regeneration: Update in molecular investigations and clinical translation.</a> Exp Neurol. 332, 113397(2020).</li>
<li>Juckett, L., Saffari, T. M., Ormseth, B., Senger, J. -L., Moore, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+electrical+stimulation+on+nerve+regeneration+following+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">The effect of electrical stimulation on nerve regeneration following peripheral nerve injury.</a> Biomolecules. 12 (12), 1856(2022).</li>
<li>Jessen, K. R., Mirsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+regulation+of+myelination%3A+relevance+for+development%2C+injury%2C+and+demyelinating+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Negative regulation of myelination: relevance for development, injury, and demyelinating disease.</a> Glia. 56 (14), 1552-1565 (2008).</li>
<li>Chen, Z. -L., Yu, W. -M., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Peripheral regeneration.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).</li>
<li>Yin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+papilloma+and+squamous+cell+carcinoma+therapy+utilizing+nanosecond+pulsed+electric+fields+%28nsPEF%29%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Cutaneous papilloma and squamous cell carcinoma therapy utilizing nanosecond pulsed electric fields (nsPEF).</a> PloS One. 7 (8), e43891(2012).</li>
<li>Qi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoexcited+wireless+electrical+stimulation+elevates+nerve+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Photoexcited wireless electrical stimulation elevates nerve cell growth.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 220, 112890(2022).</li>
<li>Mi, Y., Liu, Q., Li, P., Xu, J., Yang, Q., Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gold+nanorods+combined+with+low-intensity+nsPEFs+enhance+antimelanoma+efficacy+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted gold nanorods combined with low-intensity nsPEFs enhance antimelanoma efficacy in vitro.</a> Nanotechnology. 31 (35), 355102(2020).</li>
<li>Ho, T. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels%3A+Properties+and+applications+in+biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Hydrogels: Properties and applications in biomedicine.</a> Molecules. 27 (9), 2902(2022).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

近年来，据报告，纳秒脉冲电场（nsPEF）的应用呈现出快速增长态势。nsPEF仅对目标区域产生高度特异性的效应，可在不引起额外热损伤的情况下提供足够的治疗能量，因而对人体更加安全。28这些特性使其在肿瘤治疗和神经再生方面具有良好的转化前景。然而，一些研究也指出了nsPEF存在的一些局限性。与材料研究相比，ES受限于外部电源和导线29此外，最近一项研究证实，围手术期使用利多卡因作为镇痛剂会显著减弱电刺激相关神经再生的改善效果25这些问题可能给未来的研究带来挑战 体内. 
我们仅使用纳秒脉冲电场（nsPEF）刺激RSC96细胞。接受低强度刺激的细胞表现出明显变化。然而，根据实验结果，nsPEF诱导的刺激效应持续时间相对较短，约为3天。未来可考虑结合金纳米棒和纳米水凝胶等能够增强脉冲电场生物电效应的材料，从而增强脉冲电场的生物电效应，并开发出更具靶向性和高效性的治疗策略30,31。
实验操作中有几个关键注意事项如下。首先进行CCK-8实验，通过该实验筛选出电刺激后合适的场强和细胞培养时间，以节省后续实验步骤和操作。在本实验所用仪器和条件下，给予细胞五次电脉冲有助于最大程度地诱导细胞变化。若脉冲频率过低，细胞接收到的电刺激不足以激活增殖及其他生物学反应；反之，频率过高则可能导致细胞发生不可逆损伤。在电刺激过程中，需注意电极之间的距离，保持适当位置，以确保在达到预设电击次数后能迅速分离电极，防止额外电击影响实验结果。电击完成后，应及时将仪器接地，避免仪器受损。
本研究中，低电场强度的纳秒脉冲电场（nsPEF）有效促进了施万细胞（SCs）的增殖、迁移以及相关因子的合成与分泌能力。尽管其潜在机制仍需进一步阐明，但本研究为应用nsPEF刺激细胞增殖与迁移提供了积极的前景。目前研究领域中，关于nsPEF诱导此类细胞增殖与迁移的报道仍较为罕见19。此外，施万细胞的激活涉及多种关键因素。本研究评估了特异性标志蛋白及神经营养因子S100β、转录因子Sox10、GFAP以及神经元细胞骨架成分NF-H的表达变化。这些指标在nsPEF刺激下的改变可用于多维度评估施万细胞的活性、周围神经修复的程度及预后情况。所有结果均表明，nsPEF对施万细胞具有显著的促进作用，并提示良好的修复预后。未来，我们将开展更多动物模型研究，进一步探讨不同强度nsPEF对施万细胞的影响，以筛选出最优的促分化电场刺激模式。

每年，都有数百万人受到周围神经系统（PNS）和中枢神经系统（CNS）神经损伤的影响1。研究表明，神经损伤后，CNS的轴突修复能力非常有限，而PNS由于施万细胞（SCs）具有显著的可塑性，表现出更强的修复能力2。然而，实现周围神经损伤后的完全再生仍然十分困难，持续对人类健康构成重大挑战3,4。目前，尽管自体移植存在供体部位并发症和来源有限等缺点5，仍是常见的治疗方法。这一现状促使研究人员探索替代疗法，包括材料学方法6、分子因子7以及电刺激（ES）。作为一种促进轴突生长和神经再生的因素，选择合适的电刺激方法并探究电刺激与施万细胞之间的关系变得至关重要8。
施万细胞（SCs）是周围神经系统（PNS）中的主要胶质细胞，在PNS再生过程中发挥关键作用9,10。周围神经损伤后，SCs会迅速活化并经历广泛的重编程2,&#160;，从形成髓鞘的状态转变为支持生长的形态，以引导神经再生2。在损伤神经的远端，SCs发生显著增殖，同时远端残端的SCs通过增殖和伸长形成布恩纳带（Bungner's band），这对于引导轴突向靶器官生长至关重要11。此外，来自近端和远端神经残端的SCs会迁移至神经桥接区域，形成SC索状结构，促进轴突再生12。进一步研究表明，在周围神经再生过程中，SCs相关因子的合成与分泌发生改变，包括转录因子13、神经营养因子14以及髓鞘形成调控因子13。这些变化也为评估SCs活性提供了指标。基于上述机制，促进SCs的增殖、迁移及其相关因子的合成与分泌，已成为改善周围神经再生的重要研究方向15。
既往研究表明，电刺激（ES）可用于神经再生1。一种被广泛接受的解释是，电刺激可诱导细胞膜去极化，改变膜电位，并通过改变这些生物分子上的电荷分布影响膜蛋白功能1。然而，广泛使用的强脉冲电场（Intense PEF）可能引起剧烈疼痛、不自主的肌肉收缩以及心室纤维性颤动8。它还会增加肌酸激酶（CK）活性，降低肌肉力量，并诱发迟发性肌肉酸痛（DOMS）的发展16。纳秒脉冲电场（nsPEF）是一种新兴技术，通过纳秒级脉冲持续时间内的高压电场刺激实验对象，正逐渐应用于细胞水平的研究17,18。既往研究报道，nsPEF促进细胞增殖和细胞器活性的可能机制在于膜纳米孔的形成以及离子通道的激活，从而导致胞质内Ca2+浓度升高19。nsPEF利用脉冲功率技术对细胞膜充电，产生具有持续时间短、上升速度快、功率高和能量密度低特征的脉冲20。这些特性表明，nsPEF可能是一种刺激副作用最小的优选模式8。此外，与外科干预相比，nsPEF具有微创性、可逆性、可调节性以及对神经组织无破坏性等优势。nsPEF在生物医学领域的一个主流研究方向是利用高能电场刺激实现肿瘤组织消融21,22,23。一些研究结果表明，12-nsPEF可在不造成损伤的情况下刺激周围神经24。然而，目前关于nsPEF在神经再生领域应用的证据仍十分有限。此外，使用nsPEF刺激施万细胞（SCs）尚属开创性尝试，有助于推动后续的体内（in vivo）和临床研究。本研究旨在探讨nsPEF对SCs的刺激是否能够促进神经再生，从而为今后深入而系统的科学研究提供可靠依据。

<table><tbody><tr><td>抗荧光淬灭封片剂</td><td>武汉珈维生物技术有限公司</td><td>G1401</td><td></td></tr><tr><td>抗GFAP小鼠单克隆抗体</td><td>武汉珈维生物技术有限公司</td><td>GB12100-100</td><td></td></tr><tr><td>抗神经丝重链蛋白小鼠单克隆抗体</td><td>武汉珈维生物技术有限公司</td><td>GB12144-100</td><td></td></tr><tr><td>抗S100β小鼠单克隆抗体</td><td>武汉珈维生物技术有限公司</td><td>GB14146-100</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>武汉珈维生物技术有限公司</td><td>GC305010</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>江苏世泰实验器材有限公司</td><td>10212432C</td><td></td></tr><tr><td>CY3标记的山羊抗小鼠IgG</td><td>武汉珈维生物技术有限公司</td><td>GB21302</td><td></td></tr><tr><td>DAPI染色试剂</td><td>武汉珈维生物技术有限公司</td><td>G1012</td><td></td></tr><tr><td>脱色摇床</td><td>武汉珈维生物技术有限公司</td><td>DS-2S100</td><td></td></tr><tr><td>纳秒脉冲电场（nsPEF）高压电源</td><td>Matsusada Precision Inc.</td><td>AU-60P1.6-L</td><td></td></tr><tr><td>组织化学笔</td><td>武汉珈维生物技术有限公司</td><td>G6100</td><td></td></tr><tr><td>破膜液</td><td>武汉珈维生物技术有限公司</td><td>G1204</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>武汉珈维生物技术有限公司</td><td>G6012</td><td></td></tr><tr><td>掌上离心机</td><td>武汉珈维生物技术有限公司</td><td>MS6000</td><td></td></tr><tr><td>PBS粉末</td><td>武汉珈维生物技术有限公司</td><td>G0002</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>武汉珈维生物技术有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>正置荧光显微镜</td><td>Nikon, Japan</td><td>NIKON ECLIPSE C1</td><td></td></tr><tr><td>兔抗SOX10/AF488标记抗体</td><td>北京博奥森生物技术有限公司</td><td>BS-20563R-AF488</td><td></td></tr><tr><td>RSC96施万细胞</td><td>武汉珈维生物技术有限公司</td><td>STCC30007G-1</td><td></td></tr><tr><td>扫描仪</td><td>3DHISTECH</td><td>Pannoramic MIDI</td><td></td></tr><tr><td>纳秒脉冲电场（nsPEF）专用电缆</td><td>Times Microwave Systems</td><td>M17/78-RG217</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>武汉珈维生物技术有限公司</td><td>MV-100</td><td></td></tr></tbody></table>

通过纳秒脉冲电场调控雪旺细胞生长以促进体外周围神经再生

Regulating Schwann Cell Growth by Nanosecond Pulsed Electric Field for Peripheral Nerve Regeneration In Vitro

施万细胞（Schwann cells, SCs）是周围神经系统的髓鞘形成细胞，在周围神经再生过程中发挥关键作用。纳秒脉冲电场（Nanosecond Pulse Electric Field, nsPEF）是一种新兴的神经电刺激方法，已被证明可有效促进细胞增殖及其他生物学过程。为评估施万细胞在nsPEF作用下是否发生显著变化，并探索其在新型周围神经再生方法中的潜力，本研究对培养的RSC96细胞施加了5 kV和10 kV的nsPEF刺激，随后继续培养3至4天。之后检测了施万细胞表达的一些相关因子，以验证刺激的有效性，包括特异性标志蛋白、神经营养因子、转录因子以及髓鞘形成调控因子。代表性结果表明，nsPEF显著增强了施万细胞的增殖与迁移能力，并提高了其合成有利于周围神经再生相关因子的能力。同时，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达水平降低，提示周围神经损伤具有良好的预后。上述结果表明，nsPEF通过刺激施万细胞，在治疗周围神经损伤方面具有广阔的应用前景，是一种极具潜力的高效干预手段。

低强度脉冲电场促进细胞增殖 
根据CCK-8检测结果，5 kV/cm组RSC96细胞的增殖速率显著快于对照组细胞。然而，随着参数升高（20 kV/cm和40 kV/cm），细胞增殖速率变得不稳定，甚至低于对照组。40 kV/cm组RSC96细胞的增殖速率显著低于对照组和5 kV/cm组，差异具有显著统计学意义（P &lt; 0.05）。由于未达到细胞增殖实验的要求，后续实验排除了20 kV/cm和40 kV/cm组（图1）。
低强度脉冲电场促进 S100β 的表达 
S100β 作为施万细胞（SCs）的特异性标志蛋白，参与多种功能，包括神经突延伸和轴突增殖14。此外，研究发现 S100β 蛋白在发育过程中可发挥神经营养因子的作用，且在神经损伤情况下其表达量增加。先前的研究表明，S100β 可与脑源性神经营养因子（BDNF）协同作用，调控不同的信号转导级联反应，促进神经元成熟和轴突生长14,25。在显微镜下，细胞爬行实验中各组均可见散在分布的红色胞质 S100β 阳性细胞（图 2A）。培养 3 天后，RSC96 细胞在 5 kV/cm 组的荧光积分光密度（IOD）显著高于对照组和 10 kV/cm 组，差异具有统计学意义（***P &lt; 0.001；****P &lt; 0.0001）（图 2B）。
低强度脉冲电场促进 NF-H 的表达 
NF-H 可与其他中间丝蛋白相互作用形成网络结构，是神经元细胞骨架的主要成分之一。在显微镜下，细胞爬行实验中各组均可见散在分布的红色胞质 NF-H 阳性细胞（图 3A）。培养 3 天后，RSC96 细胞在 5 kV/cm 组中的荧光积分光密度（IOD）显著高于对照组和 10 kV/cm 组，具有显著性统计学差异（*P&lt;0.05；**P &lt; 0.01）（图 3B）。
低强度脉冲电场调控GFAP的表达 
胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达是星形胶质细胞活性的指标之一。神经损伤后，星形胶质细胞最初表现为反应性增殖，在早期具有保护作用。然而，胶质细胞过度增殖可导致胶质瘢痕的形成，阻碍神经纤维的连接26。既往研究表明，在轴突生长过程中通常表达的基因会重新表达，例如GFAP27。显微镜下，在各组细胞爬行实验中均观察到散在分布的红色胞质GFAP阳性细胞（图4A）。培养3天后，RSC96细胞在5 kV/cm组中的荧光积分光密度（IOD）显著低于对照组和10 kV/cm组，差异具有统计学意义（****P &lt; 0.0001；***P &lt; 0.001）（图4B）。
低强度脉冲电场促进 Sox10 的表达 
Sox10 在施万细胞（SCs）中持续表达，是周围神经髓鞘形成的关键转录因子13。显微镜下观察细胞爬行实验中，各组均可见散在分布的绿色胞质 Sox10 阳性细胞（图 5A）。培养 3 天后，RSC96 细胞在 5 kV/cm 组中的平均灰度值显著高于对照组和 10 kV/cm 组，差异具有统计学意义（*P &lt; 0.05；*P &lt; 0.05）（图 5B）。
低强度脉冲电场促进细胞迁移 
通过比较RSC96细胞在划痕实验24小时后的迁移速率，观察到5 kV/cm组中RSC96细胞的迁移速度显著快于对照组和10 kV/cm组（图6）。
<img alt="细胞增殖柱状图；光密度（O.D.）值，不同电场强度，显著变化" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66097/66097fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：在 5 kV/cm、10 kV/cm、20 kV/cm 和 40 kV/cm 电场刺激下 RSC96 细胞增殖的 CCK8 检测结果，以及对照组。 结果数据为 ≥3 次重复实验的均值 ± 标准差。NS 表示无显著性差异；*P &lt; 0.05；**P &lt; 0.01；**P &lt; 0.01 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66097/66097fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="S-100β蛋白的免疫荧光显微镜图像，DAPI染色及荧光结果柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66097/66097fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：在5 kV/cm、10 kV/cm电刺激及对照条件下RSC96细胞中S100β的表达。 结果基于≥3次重复实验，以均值±标准差表示。***P &lt; 0.001；****P &lt; 0.0001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66097/66097fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="免疫荧光显微镜，NF-H蛋白表达，电场效应，荧光强度" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66097/66097fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：在5 kV/cm、10 kV/cm电场刺激下及对照组中RSC96细胞NF-H的表达。 结果数据为≥3次重复实验的平均值±标准差。*P &lt; 0.05；**P &lt; 0.01。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66097/66097fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="GFAP 免疫荧光检测结果、显微镜图像及荧光强度柱状图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66097/66097fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：在 5 kV/cm 和 10 kV/cm 电场刺激下及对照组中 RSC96 细胞 GFAP 的表达。 结果数据以均值 ± 标准差表示，基于 ≥3 次重复实验。****P &lt; 0.0001；***P &lt; 0.001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66097/66097fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="不同条件下Sox10、DAPI染色及合并图像的免疫荧光显微镜照片。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66097/66097fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：在5 kV/cm、10 kV/cm刺激下及对照组中RSC96细胞Sox10的表达情况。 结果基于≥3次重复实验，以均值±标准差表示。*P &lt; 0.05；**P &lt; 0.01。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66097/66097fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞迁移分析；划痕实验结果；0小时和24小时的比较；不同电场条件。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66097/66097fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：在5 kV/cm、10 kV/cm电场刺激下及对照组RSC96细胞的划痕实验。 结果基于≥3次重复实验，以均值±标准差表示。**P &lt; 0.01；***P &lt; 0.001。统计学分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66097/66097fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

此处，我们介绍一种应用纳秒脉冲电场（nsPEF）刺激施万细胞的实验方案 体外相关因子的合成与分泌能力以及细胞行为的变化验证了采用纳秒脉冲电场（nsPEF）刺激的成功。该研究对周围神经再生方法持积极评价。

施万细胞（Schwann cells, SCs）是周围神经系统中的髓鞘形成细胞，在周围神经再生中发挥关键作用。纳秒脉冲...

我们的研究重点是利用纳秒脉冲电场（nsPEF）刺激施万细胞，促进周围神经再生。由于大多数情况下神经再生较为困难，我们希望开发一种高效激活施万细胞的新方法。我们创新性地采用纳秒脉冲电场（nsPEF）来激活施万细胞。我们很高兴地发现，纳秒脉冲电场（nsPEF）可能是实现周围神经再生的优选模式，且具有最小的刺激副作用。此外，我们的实验方案为后续深入而系统的科学研究提供了可靠基础。本实验室将持续探索nsPEF的应用。在神经再生方面，我们将建立动物模型以促进体外测试，并评估nsPEF在体外应用的安全性。由于目前关于nsPEF在周围神经再生中应用的证据有限，我们希望能够在该领域取得突破。首先，将含有1 mL RSC96细胞悬液的冻存管置于37°C水浴中，同时快速振荡。将细胞悬液转移至含有4到6毫升完全培养基的离心管中，充分混匀。以1000 ×g离心3到5分钟，弃去上清液，用3毫升完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含有6到8毫升完全培养基的培养瓶中，于37°C孵育过夜。当细胞密度达到80%至90%时，弃去培养基，并用不含钙离子和镁离子的PBS冲洗细胞一至两次。然后向培养瓶中加入0.25%胰蛋白酶和0.53毫摩尔EDTA。孵育结束后，在显微镜下观察细胞脱落情况。当大部分细胞变圆并迅速脱落时，立即将培养瓶移回工作区域并轻轻拍打。加入三到四毫升含10%FBS的培养基以终止消化。然后充分混匀培养瓶中的内容物，并吸除溶液。离心细胞悬液。以1000 ×g离心五分钟。弃去上清液后，用一至二毫升新鲜培养基通过轻柔吹打重新悬浮细胞。将细胞悬液以1:2的比例转移至新的T25培养瓶中，并加入7 mL培养基。首先，用1 mL DMEM培养基重悬培养的RSC 96细胞，然后将其转移至两侧带有电极的比色培养皿中。打开仪器电源开关，旋转旋钮以设定电场强度。小心旋转电极，直至出现火花。根据预设的场强强度，使细胞接受五次纳秒脉冲电场刺激。处理后立即分开两个电极。首先，取经电刺激的RSC96细胞，向96孔细胞培养板的每孔中加入100微升细胞悬液。从试剂盒中取10微升CCK-8溶液，加入96孔细胞培养板中。将培养板置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中，继续孵育30分钟至4小时。在六孔板的每个孔中接种3 × 10⁵个细胞，每孔总体积为2 mL。将移液枪头垂直放置，在培养孔底部用枪头划一条水平线。吸去培养基后，用PBS洗涤细胞2至3次。每孔加入 2 mL 无血清培养基，然后将培养板放入 37°C 培养箱中。在 0 小时和 24 小时时，于倒置显微镜下以 4 倍放大倍数拍摄图像，以观察细胞迁移的变化。CCK-8 检测结果显示，与对照组相比，5 kV/cm 组的 RSC96 细胞增殖显著加快。相比之下，较高参数组的增殖速率比对照组和每厘米五千伏组更不稳定。划痕实验显示，每厘米五千伏组中RSC96细胞的迁移速率明显快于对照组和每厘米十千伏组。首先，取经电刺激培养的RSC96细胞。然后使用组织学笔在盖玻片上细胞分布均匀的位置画圈。向细胞中加入 50 至 100 微升（µL）透化工作液，在室温下孵育 20 分钟。随后用 PBS 洗涤细胞三次，每次五分钟。接下来，在圆圈内加入3% BSA，均匀覆盖组织，并在室温下孵育30分钟。随后，轻轻去除封闭液，向细胞中加入适当稀释的一抗。将细胞培养板放入湿盒中，在4°C条件下孵育过夜。然后在持续振荡的条件下，用 PBS 洗涤细胞三次，每次五分钟。加入相应的二抗，在室温下孵育 50 分钟。孵育结束后，将盖玻片放入 PBS 中，在振荡条件下洗涤三次，每次五分钟。然后让载玻片自然干燥，并向干燥的载玻片上加入DAPI染色液。最后，使用抗荧光淬灭封片剂封固干燥的盖玻片。使用特定的激发和发射波长采集图像。对于Alexa Fluor 488 SCI 3和SCI 5，显微分析显示所有组别中均存在散在的细胞质S100-Beta阳性细胞（呈红色）。与对照组和10千伏/厘米组相比，5千伏/厘米组的S100-Beta荧光积分光密度增加。在细胞爬行实验中，所有组别均观察到GFAP和Sox10阳性细胞，且细胞质呈散在分布。然而，5千伏/厘米组的GFAP表达水平显著低于对照组和10千伏/厘米组。5千伏/厘米组的RSC96细胞Sox10表达的平均灰度值显著升高，提示Sox10表达增强。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

通过纳秒脉冲电场调节雪旺细胞生长以促进体外周围神经再生

本方案展示了在定制设计的电趋化室中建立二维和三维环境的方法，可用于追踪细胞 体内/离体 利用单细胞水平的时间延时记录，以研究趋电性（galvanotaxis/electrotaxis）及其他细胞对直流电场（DC...

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取一只麻醉后右侧坐骨神经暴露且完整的实验大鼠，该神经支配后肢的运动和感觉功能。切除一段神经，形成缺损，切断神经元轴突，阻断信号传导。切断的远端轴突会退化，导致特化的神经修复细胞或施万细胞脱离。将一种带有微通道的柔软管状仿生导电神经支架缝合至神经两端切断处的外层——神经外膜上。在神经末端附近植入成对电极，并将导线穿过皮肤下方引至颈部后方。施加持续的电刺激，向支架输送温和的脉冲。来自变性远端的施万细胞迁移进入支架，并沿微通道排列。这些细胞释放生长因子，刺激轴突近端的延伸。当轴突延伸时，施万细胞以富含脂质的髓鞘膜包裹它们，从而恢复信号传导。这展示了支架和电刺激在神经修复中的潜力。...

使用仿生导电支架结合电刺激进行神经修复

来源：Ino, D. et. al., 通过电穿孔法将基因体内转移至啮齿类动物坐骨神经的施万细胞。J. Vis. Exp.

通过电穿孔法将基因转入啮齿类动物坐骨神经的施万细胞

来源：Han, J., et.al. 利用纳秒脉冲电场在体外调控雪旺细胞生长以促进周围神经再生. J. Vis. Exp.

利用纳秒脉冲电场技术体外调控施万细胞生长

来源：Lee, Y., et.al. 将施万细胞移植至PVDF-TrFE导管内以桥接大鼠脊髓横断残端促进轴突再生。J. Vis. Exp.

用于脊髓损伤后轴突再生的施万细胞接种导管

背根神经节（DRG）是包含周围神经系统感觉神经元的结构。经分离后，可与类似施万细胞的脂肪源性干细胞（ASC）进行共培养，从而为研究提供有价值的模型 体外 神经再生与髓鞘化，模拟 体内...

背根神经节神经元与分化后的脂肪源性干细胞：一种 体外 共培养模型用于研究周围神经再生

本文介绍了一种将基因转移至啮齿类动物坐骨神经施万细胞（SCs）的体内技术。该方法操作简便，适用于研究参与髓鞘化施万细胞发育及维持过程中的信号转导机制。...

体内电穿孔法将基因转移至啮齿类动物坐骨神经施万细胞

本文介绍一种在体外从感觉神经和运动神经中纯化成纤维细胞和施万细胞的方法。...

体外从感觉神经和运动神经中纯化成纤维细胞和施万细胞

该方法旨在阐明细胞外基质信号（如基质刚度、蛋白质组成和细胞形态）调控施万细胞（SC）表型的机制。...

可调细胞外基质微环境的制备用于评估施万细胞表型特化

本研究中，我们介绍了一种仅通过微流控系统中直流脉冲刺激诱导神经干细胞和前体细胞（NPCs）分化的实验方案。...

微流控装置中电场诱导的神经前体细胞分化

本方案介绍了一种用于外周神经的无线供电接口的外科植入及操作方法。我们通过将神经刺激器分别植入大鼠坐骨神经或膈神经的实例，展示了该方法的应用价值。...

用于外周神经接口的无线无电池系统的植入与控制

学习使用纳秒脉冲电场（nsPEF）刺激雪旺细胞以促进周围神经再生的体外实验方法。该方案通过CCK-8和划痕实验评估细胞增殖与迁移，为神经修复研究提供可靠基础。

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