2024年5月3日
此处,我们介绍一种应用纳秒脉冲电场(nsPEF)刺激施万细胞的实验方案 体外相关因子的合成与分泌能力以及细胞行为的变化验证了采用纳秒脉冲电场(nsPEF)刺激的成功。该研究对周围神经再生方法持积极评价。
我们的研究重点是利用纳秒脉冲电场(nsPEF)刺激施万细胞,促进周围神经再生。由于大多数情况下神经再生较为困难,我们希望开发一种高效激活施万细胞的新方法。我们创新性地采用纳秒脉冲电场(nsPEF)来激活施万细胞。
我们很高兴地发现,纳秒脉冲电场(nsPEF)可能是实现周围神经再生的优选模式,且具有最小的刺激副作用。此外,我们的实验方案为后续深入而系统的科学研究提供了可靠基础。本实验室将持续探索nsPEF的应用。
在神经再生方面,我们将建立动物模型以促进体外测试,并评估nsPEF在体外应用的安全性。由于目前关于nsPEF在周围神经再生中应用的证据有限,我们希望能够在该领域取得突破。首先,将含有1 mL RSC96细胞悬液的冻存管置于37°C水浴中,同时快速振荡。
将细胞悬液转移至含有4到6毫升完全培养基的离心管中,充分混匀。以1000 ×g离心3到5分钟,弃去上清液,用3毫升完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含有6到8毫升完全培养基的培养瓶中,于37°C孵育过夜。
当细胞密度达到80%至90%时,弃去培养基,并用不含钙离子和镁离子的PBS冲洗细胞一至两次。然后向培养瓶中加入0.25%胰蛋白酶和0.53毫摩尔EDTA。孵育结束后,在显微镜下观察细胞脱落情况。
当大部分细胞变圆并迅速脱落时,立即将培养瓶移回工作区域并轻轻拍打。加入三到四毫升含10%FBS的培养基以终止消化。然后充分混匀培养瓶中的内容物,并吸除溶液。
离心细胞悬液。以1000 ×g离心五分钟。弃去上清液后,用一至二毫升新鲜培养基通过轻柔吹打重新悬浮细胞。
将细胞悬液以1:2的比例转移至新的T25培养瓶中,并加入7 mL培养基。首先,用1 mL DMEM培养基重悬培养的RSC 96细胞,然后将其转移至两侧带有电极的比色培养皿中。打开仪器电源开关,旋转旋钮以设定电场强度。
小心旋转电极,直至出现火花。根据预设的场强强度,使细胞接受五次纳秒脉冲电场刺激。处理后立即分开两个电极。
首先,取经电刺激的RSC96细胞,向96孔细胞培养板的每孔中加入100微升细胞悬液。从试剂盒中取10微升CCK-8溶液,加入96孔细胞培养板中。将培养板置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中,继续孵育30分钟至4小时。
在六孔板的每个孔中接种3 × 10⁵个细胞,每孔总体积为2 mL。将移液枪头垂直放置,在培养孔底部用枪头划一条水平线。吸去培养基后,用PBS洗涤细胞2至3次。
每孔加入 2 mL 无血清培养基,然后将培养板放入 37°C 培养箱中。在 0 小时和 24 小时时,于倒置显微镜下以 4 倍放大倍数拍摄图像,以观察细胞迁移的变化。CCK-8 检测结果显示,与对照组相比,5 kV/cm 组的 RSC96 细胞增殖显著加快。
相比之下,较高参数组的增殖速率比对照组和每厘米五千伏组更不稳定。划痕实验显示,每厘米五千伏组中RSC96细胞的迁移速率明显快于对照组和每厘米十千伏组。首先,取经电刺激培养的RSC96细胞。
然后使用组织学笔在盖玻片上细胞分布均匀的位置画圈。向细胞中加入 50 至 100 微升(µL)透化工作液,在室温下孵育 20 分钟。随后用 PBS 洗涤细胞三次,每次五分钟。
接下来,在圆圈内加入3% BSA,均匀覆盖组织,并在室温下孵育30分钟。随后,轻轻去除封闭液,向细胞中加入适当稀释的一抗。将细胞培养板放入湿盒中,在4°C条件下孵育过夜。
然后在持续振荡的条件下,用 PBS 洗涤细胞三次,每次五分钟。加入相应的二抗,在室温下孵育 50 分钟。孵育结束后,将盖玻片放入 PBS 中,在振荡条件下洗涤三次,每次五分钟。
然后让载玻片自然干燥,并向干燥的载玻片上加入DAPI染色液。最后,使用抗荧光淬灭封片剂封固干燥的盖玻片。使用特定的激发和发射波长采集图像。
对于Alexa Fluor 488 SCI 3和SCI 5,显微分析显示所有组别中均存在散在的细胞质S100-Beta阳性细胞(呈红色)。与对照组和10千伏/厘米组相比,5千伏/厘米组的S100-Beta荧光积分光密度增加。
在细胞爬行实验中,所有组别均观察到GFAP和Sox10阳性细胞,且细胞质呈散在分布。然而,5千伏/厘米组的GFAP表达水平显著低于对照组和10千伏/厘米组。5千伏/厘米组的RSC96细胞Sox10表达的平均灰度值显著升高,提示Sox10表达增强。
本研究介绍了一种利用纳秒脉冲电场(nsPEF)在体外刺激施万细胞的实验方案,突显其在促进周围神经再生方面的潜力。研究结果表明,nsPEF能够有效增强与细胞行为相关因子的合成与分泌,证明其在神经再生技术中的有效性。
纳秒脉冲电场(nsPEF)对施万细胞的刺激为调控与周围神经再生相关的细胞行为提供了一种新颖的手段。该方法能够精确研究细胞增殖、迁移及因子合成,有助于提高在再生医学早期发现阶段的预测可靠性。该技术将nsPEF确立为一种潜在的平台技术,可用于降低神经修复相关生物学机制的研究风险,并推动临床前研发管线的决策进程。
nsPEF刺激的施万细胞检测可整合到再生医学和神经生物学领域的从发现到临床前研究的连续进程中。