Name: 用长期植入的 EMG 电极记录头部固定小鼠的前肢肌肉活动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T14:35:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: 学习在头部固定小鼠前肢肌肉中长期植入EMG电极的技术，用于记录肌肉活动并研究初级与次级运动皮层对运动控制的差异性影响。该方法为解析运动控制机制提供了可靠的电生理手段。

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作者谨此感谢 Claire Warriner 博士为本方法的开发所做出的贡献。Mark Agrios 和 Sajishnu Savya 协助完成了图示的制备工作。本研究得到了 Searle 学者奖、Sloan 研究奖学金、Simons 全球大脑合作计划试点奖、Whitehall 研究资助奖、芝加哥生物医学联盟（由芝加哥社区信托基金的 Searle 基金支持）、NIH 资助项目 DP2 NS120847（A.M.）以及 NIH 资助项目 2T32MH067564（A.K.）的支持。

所有实验和操作均按照美国国立卫生研究院（NIH）指南进行，并经西北大学机构动物护理和使用委员会批准。其他国家和（或）机构可能有不同的规定，需对本操作流程进行相应修改。本研究所用动物为12至20周龄、体重不低于20 g的C57BL6/J成年雄性小鼠（见材料表）。
1. 电极组制备
注意：在洁净的实验台面上，使用放大倍数为10x–40x的体视显微镜和清洁的裸手进行这些步骤。参见 图1 用于详细说明电极导线剥离的示意图（图1A）和连接器组件（图1B).
<ol>
	<li>剪切导线：对于每对电极，剪取两段PFA涂层编织不锈钢丝（7股，0.0055&#34; 直径）（参见 材料表）。上臂肌肉的导线每根剪成9.5 cm长，下臂肌肉的导线每根剪成10.5 cm长。</li>
	<li>将两根导线用一个单结系在一起——植入时，该结将位于植入部位外侧（近端结）。打结的导线构成一个电极对。
	<ol>
		<li>使用18 G针头插入一块瓦楞纸板，将结打在距离插入端6 cm处，并通过将电极丝拉紧固定在纸板上来收紧针头周围的结。插入端将缩短至约5.5 cm，剩余的0.5 cm被结占用。</li>
		<li>小心取出针头，用手将结拉紧两次，以进一步加固。 
		注意：打结时不应过度收紧；以这种方式打结可形成大小合适的近端结，从而将植入的电极固定在组织中。</li>
		<li>上臂肌肉的连接端应确保长度为3.5 cm，前臂肌肉的连接端应确保长度为4.5 cm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从每根导线的打结处开始剥离绝缘层：一根导线剥离1-1.5毫米，另一根导线剥离2-2.5毫米，每根导线均剥离0.5毫米的绝缘层。 图1 说明每根导线的剥线位置。
	<ol>
		<li>将电极拉紧并用胶带固定在一块平整的纸板上，使两个连接端的导线并在一起，而插入端的导线分开。</li>
		<li>使用手术刀在绝缘层上做切口，标记出需要去除绝缘层的两端位置。</li>
		<li>在每个切口处，使用手术刀片在导线的上方、侧面和下方各进行约2次切割，每个切口处共进行约6次切割。 
		注意：必须避免过度切割导线本身，否则可能导致线丝断裂。需要通过练习掌握适当的压力，以完全切断绝缘层的同时尽量减少对导线的损伤。</li>
		<li>将电极对旋转180度，在每个切口处重复进行6次切割。</li>
		<li>根据需要进行额外切割，以分离出0.5 mm的绝缘层，露出下方的金属导线。所需切割次数取决于施加的压力和手术刀片的锋利程度。</li>
		<li>将手术刀片倾斜，沿已松动的绝缘层纵向切割，并用镊子将其从导线上取下。</li>
		<li>检查暴露的导线是否存在断裂和/或绝缘层磨损，以免在插入组织时造成损伤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>剥去连接端每根导线末端1 mm的绝缘层。</li>
	<li>在每根导线的插入端末端剥去5 mm的绝缘层。</li>
	<li>将插入端的线段拧在一起，并用0.5英寸27 G针头的针管部分压接住露出的5 mm端部。移除鲁尔锁末端后，也可使用普通的皮下注射针头。</li>
	<li>对每一对电极重复步骤 1.1–1.6。</li>
	<li>组装连接器。
	<ol>
		<li>剪断12针连接器的母端（参见 材料表降至以下尺寸：# 电极对 × 2 个针脚插槽。</li>
		<li>用钳子小心地从每个连接端口上取下黄铜接头（这些接头预先安装在12针连接器上）。将这些接头保存起来，供下一步使用。</li>
		<li>将每根导线两端各1 mm的裸露部分焊接到黄铜接头的一个叶片的外表面。 
		警告：焊接会产生烟雾，可能引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激。操作时应佩戴手套（或操作后洗手），使用眼部防护装备，并使用局部烟雾抽排装置以减少暴露。
		<ol>
			<li>将黄铜接头固定在辅助手工具的无齿鳄鱼夹中，使其一个叶片的外表面朝上。</li>
			<li>将接头置于显微镜下，以便在焊接过程中实现高精度的视觉控制。使用展开的回形针或一段废金属丝，蘸取少量适用于不锈钢的助焊剂，涂抹于刀片表面。</li>
			<li>使用窄锥形焊笔尖，在刀片上涂抹足量焊料，覆盖黄铜刀片底部约1.5 mm的区域。 
			注意：焊料过多会干扰连接器的组装，而过少则可能导致连接不充分。必要时应准备额外的黄铜接头以重新操作。</li>
			<li>在刀片的焊料表面充分涂覆适用于不锈钢的助焊剂，但应避免助焊剂滴入两刀片之间的间隙中。</li>
			<li>将露出的1 mm电极导线紧贴刀片上的焊料，用烙铁加热焊料，使连接处熔合。</li>
			<li>检查连接：大部分裸露的导线应浸没在焊料中，且导线应牢固地固定在黄铜接头内。确保黄铜接头的两个刀片之间没有残留焊料，否则可能会影响后续插入公插头。最后，确保连接部分与黄铜刀片表面齐平，以便在下一步中将接头重新插入连接器。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用直头镊子，将每个焊接好的黄铜接头重新插入连接器中，确保每对电极的导线彼此相邻，且不与其他电极对的导线缠绕。参见 图1B 用于可视化连接器中单个电极对的方向。 
		注意：理想的从左至右排列顺序为：肱二头肌（连接端3.5 mm）、肱三头肌（连接端3.5 mm）、桡侧腕长伸肌（ECR；连接端4.5 mm）和掌长肌（PL；连接端4.5 mm）。使用记号笔或涂改液在其中一侧做标记，以便在植入过程中追踪连接器的方向。</li>
		<li>将一个12针公头连接器裁剪至与母头端相同尺寸（电极对数×2），并将其连接到母头连接器上。若接头位置发生偏移，可在公头连接器就位后，使用直头镊子将其重新插入。</li>
		<li>用钳子拆除黄铜接头上的凸片。</li>
		<li>用环氧树脂涂覆针脚插槽，确保连接器附近的所有金属或导线与组织绝缘。 
		注意：长时间接触环氧树脂可能引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激。操作时应佩戴手套和护目镜，并仅在通风良好的区域或局部排风装置下使用环氧树脂。</li>
		<li>让连接器在空气中干燥至少30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测试每对电极的电阻，并使用不同颜色的热缩管小段标记针头，以便在手术过程中易于识别。 
	注意：电阻应在18-50欧姆之间。电阻过低可能表明存在短路，过高则可能表明金属丝股损伤过度。然而，高电阻通常源于针杆与导线连接处（步骤1.6中制作）接触不良，可通过在此连接处进一步压接来解决。</li>
	<li>植入前确保电极组无纤维及其他碎屑。可使用喷雾除尘剂进行清洁，显微镜下检查有助于确认清洁效果。</li>
</ol>
2. 电极植入手术
注意：本节描述了一种外科手术操作，用于将前一节中制备的头固定板和电极植入至肱三头肌、肱二头肌、桡侧腕伸肌（ECR）和掌长肌（PL）。对于后两种肌肉，若不穿过邻近的协同肌，则很难将电极仅植入这些单个肌肉中。有关尝试分离单个肌肉记录信号时的注意事项，请参见下文讨论。头固定板通常需根据特定实验需求进行定制设计和制作。本研究使用了3D打印塑料RIVETS头固定板19。目前可通过Janelia、艾伦研究所及独立科研团队的在线资源获取多种开源头固定板设计。此处描述的头固定板手术方法已成功应用于钛合金和塑料材质的头固定板。该手术必须在立体定位仪（见材料表）上进行，并配备放大倍数为10–40倍的体视显微镜。
<ol>
	<li>使用1.5%戊二醛对电极和头固定板进行冷灭菌，过夜或持续8小时。用无菌水短暂冲洗后，在植入前使其完全风干。 
	注意：戊二醛若被吞咽有害，可引起眼睛、皮肤和呼吸道刺激。请在通风良好的通风橱中佩戴手套操作。</li>
	<li>在诱导室中使用医用级氧气混合2-4%异氟烷诱导麻醉，直至动物失去翻正反射（约3分钟），操作需遵循机构批准的方案。</li>
	<li>将动物转移至可移动的鼻罩以继续麻醉。在使用医用级氧气混合2%异氟烷维持麻醉状态下，术前剃除动物头部、颈部和四肢的毛发。本节其余所有步骤均需在麻醉下进行。根据需要调整异氟烷剂量，以维持1 Hz的呼吸频率并确保无足趾夹捏反射。</li>
	<li>涂抹眼用润滑剂，并在整个手术过程中每1小时重新涂抹一次。</li>
	<li>手术开始时，皮下注射镇痛药（如卡洛芬，5 mg/kg）和抗生素药物（如恩诺沙星，10 mg/kg）（参见材料表）。</li>
	<li>采用以下步骤或机构批准的替代方法植入头固定板。
	<ol>
		<li>将动物头部固定在立体定位仪的耳杆上，并通过连接至立体定位仪的鼻罩提供麻醉（2%异氟烷）。加盖无菌手术单以维持无菌环境。</li>
		<li>使用聚维酮碘消毒片和无菌酒精消毒片清洁头部和颈部。 
		必要时重新涂抹眼用润滑剂。</li>
		<li>在切口部位皮下注射利多卡因（4 mg/kg）（参见材料表）。</li>
		<li>通过夹捏足趾确认麻醉充分。若无翻正反射，从眼睛尾侧边缘至耳朵尾侧边缘沿中线做头部正中切口。</li>
		<li>使用组织夹固定皮肤：在眼睛后方两侧的头端边缘各夹一个，在耳朵后方的尾侧边缘各夹一个。</li>
		<li>用手术刀片轻轻刮除颅骨表面，去除干燥的筋膜。</li>
		<li>在颅骨表面涂一层薄薄的牙科水泥（参见材料表），静置5分钟使其干燥。</li>
		<li>将头固定板放置于动物颅骨上。头固定板的安装方式和位置取决于具体头固定板类型及研究问题。</li>
		<li>使用牙科水泥将头固定板粘附于颅骨，确保颅骨完全被覆盖。静置10分钟使牙科水泥干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将动物转移至可移动的塑料鼻罩，以在剩余手术过程中持续提供麻醉；此装置可在手术期间定期重新定位动物，以便在维持麻醉的同时接触不同肌肉。</li>
	<li>延长颈部背面的切口（头固定板植入时所做切口），使其延伸至耳后1 cm处。</li>
	<li>使用钝性骨刮匙，将颈部切口下方的皮肤与深层组织分离，从颈部切口至前肢开辟一条通路，用于电极植入。</li>
	<li>使用一小段胶带将肌电图（EMG）连接器临时固定在头固定板上，以在电极植入过程中保持其位置稳定。</li>
	<li>使用聚维酮碘消毒片和无菌酒精消毒片清洁动物前肢。</li>
	<li>进行肱三头肌切口。
	<ol>
		<li>将动物侧放，使肱三头肌朝上。</li>
		<li>在预定切口部位注射利多卡因（4 mg/kg）。这将缓解局部疼痛，并在植入过程中保持肌肉湿润。 
		&#8203;注意：整个手术过程中肌肉应保持湿润但不滴水。若肌肉或皮肤显得干燥，可根据需要局部涂抹无菌生理盐水。</li>
		<li>沿骨平行方向在肱三头肌上方切开7 mm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用钝性骨刮匙将切口周围的皮肤与深层组织分离。将刮匙插入皮下并向颈部切口方向推进，为电极开辟通路。</li>
	<li>剪除任何遮挡肌肉的筋膜。</li>
	<li>通过将闭合的剪刀从肱三头肌切口插入并推出颈部切口，在穿出切口后轻微张开，以确认从颈部至肱三头肌的通路足够宽敞。</li>
	<li>将肱三头肌电极引至肱三头肌切口：将大号持针器的尖端从肱三头肌切口插入并从颈部切口穿出。用持针器夹住电极针的长轴方向，将其拉至肱三头肌切口。</li>
	<li>肱三头肌植入：参照步骤3 &#34;将电极插入肌肉&#34;进行操作。</li>
	<li>进行前臂远端切口。
	<ol>
		<li>将动物仰卧放置。</li>
		<li>用胶带将前肢沿动物体侧固定，手掌朝下。</li>
		<li>在预定切口部位注射利多卡因（4 mg/kg）。</li>
		<li>从三角肌底部至前臂中段，沿骨平行方向在肱二头肌和桡侧腕长伸肌（ECR）上方做1 cm切口。切口远端应位于前臂肌肉末端上方约2 mm处。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清除筋膜以暴露肱二头肌。</li>
	<li>从前臂远端切口向后至肱三头肌切口上方（近端）开辟通路，路径需位于上臂皮下走行的大血管上方。</li>
	<li>将肱二头肌电极经颈部切口皮下引至肱三头肌切口，再从肱三头肌切口引至前臂远端切口。</li>
	<li>肱二头肌植入：参照步骤3 &#34;将电极插入肌肉&#34;进行操作。
	<ol>
		<li>将动物前肢重新用胶带固定于相同位置，手掌朝下。</li>
		<li>尽可能靠近暴露的肱二头肌近端插入。</li>
		<li>为确保至少3 mm电极埋入肌肉组织，应根据小鼠体型，以略微倾斜于肌纤维的方向插入。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从肱三头肌切口至前臂远端植入部位下方（远端）开辟通路，路径需位于上臂皮下走行的大血管下方，与肱二头肌电极路径分开。</li>
	<li>桡侧腕长伸肌（ECR）植入：参照步骤3 &#34;将电极插入肌肉&#34;进行操作。
	<ol>
		<li>插入至ECR最近端部分。</li>
		<li>在ECR与其拮抗肌之间的皱褶处穿出，并将结扎结打在此皱褶内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从肱三头肌植入点至肘部下方的拇长展肌（PL）植入部位开辟通路。</li>
	<li>拇长展肌（PL）植入：参照步骤3 &#34;将电极插入肌肉&#34;进行操作。
	<ol>
		<li>将动物仰卧放置，用胶带将其前肢固定于头顶上方，手掌朝上。</li>
		<li>在肘部稍远端处插入。</li>
		<li>穿出点应足够靠近腕部肌腱，以确保穿出部位的结扎结位于肌肉上而非腕部肌腱上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将动物重新侧放，使用6-0丝线缝合肱三头肌切口。</li>
	<li>将动物仰卧放置，使用6-0丝线缝合前臂远端切口。</li>
	<li>使用牙科水泥将连接器固定在头固定板后部。</li>
	<li>使用6-0丝线缝合颈部切口。</li>
	<li>在切口部位涂抹局部抗生素软膏以减轻炎症。</li>
	<li>为动物佩戴伊丽莎白圈（参见材料表），防止其在恢复期间抓挠缝线。</li>
</ol>
3. 将电极插入肌肉
<ol>
	<li>通过弯曲使针头（27 G，步骤1）略微弯曲。
	<ol>
		<li>用持针器（见材料表）夹住针头，并将其抵在镊子手柄上，形成5-10度的弯曲。</li>
		<li>沿针头长度方向的不同位置共制作三个弯曲。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定针头进入和穿出肌肉的位置。</li>
	<li>使用精细镊子剪除或拉除遮挡进针和出针部位的脂肪和筋膜组织，尽量避免损伤血管以减少出血。</li>
	<li>确保有3-5 mm长的导线平行埋入肌纤维内部，以保证电极导线的暴露部分完全埋藏于肌肉内。</li>
	<li>使用持针器将针头从肌肉近端插入，同时用另一只手以钝性弯镊施加反向压力。将针头穿过肌肉至预定出针位置。</li>
	<li>当针头穿出肌肉后，用钝头镊子夹住针尖并将其完全拉出，持续拉动直至近端结位于进针点上方。</li>
	<li>打远端结。
	<ol>
		<li>用镊子在出针点远端打一个松结，然后收紧成一个约1 cm的环。</li>
		<li>用镊子推动该环，并将其置于出针点上方。</li>
		<li>预判远端结最终应收紧的位置，即出针点远端约0.5 mm处。在此位置用精细弯镊轻轻夹住线环，并将线环在镊子上拉紧。 
		注意：此步骤中不要直接在出针点上方立即收紧远端结，否则下一步完全打结时会压迫肌肉。</li>
		<li>移开精细弯镊，用镊子将结向出针点方向推挤，同时用手指牵拉针端，完成打结。确保近端结和远端结分别正确地位于进针点和出针点之外，以固定植入的电极。</li>
		<li>用直的精细镊子夹住出针处的结，将远端导线紧密缠绕在镊子上，使导线弯曲并朝向肌肉方向（远离皮肤）。</li>
		<li>在远端结远侧0.5 mm处剪断导线，留下一小段导线末端卷绕在结上。 
		上一步可确保剪断后的导线残端不会刺入动物皮肤，从而避免引起刺激或不适。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 术后护理
<ol>
	<li>手术后立即执行以下步骤。
	<ol>
		<li>将动物单独饲养，以防止笼内同伴干扰其缝线。</li>
		<li>将动物置于清洁的笼子中，垫料应较低。移除任何可能影响动物佩戴伊丽莎白圈时活动能力的巢垫和丰富化材料。</li>
		<li>为动物提供水和湿粮，确保其在佩戴伊丽莎白圈期间能够摄取。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后24小时和48小时执行以下步骤。
	<ol>
		<li>取下伊丽莎白圈，允许动物自我理毛20分钟。</li>
		<li>使用异氟烷诱导麻醉，具体操作如步骤2.2和步骤2.3所述。</li>
		<li>注射镇痛剂和抗生素药物。</li>
		<li>检查切口部位是否有缝线脱落、开放性伤口以及感染或刺激迹象。如有需要，重新缝合并涂抹更多局部抗生素。</li>
		<li>每48小时更换一次湿粮，直至取下伊丽莎白圈。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后第6天执行以下步骤。
	<ol>
		<li>检查伤口是否完全愈合。</li>
		<li>若伤口已闭合，可拆除缝线；若伤口仍未闭合，则延迟两天再拆除缝线。在拆除缝线时同时取下伊丽莎白圈。</li>
		<li>将小鼠转移至新的清洁笼子中，添加足量垫料和丰富化物品。 
		注：动物可在术后7天开始进行实验或水剥夺处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Fabrication and Surgical Implantation of Electromyographic Electrodes in Mice

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</ol>

本方案可实现对固定头部的小鼠在数周内执行多种行为时的稳定肌肉活动记录。近期，该方法已被用于研究小鼠在跑台行走18,20、操纵操纵杆任务18以及共激活任务21等行为过程中肢体肌肉的神经控制机制。&#160;尽管本文所述方案专门针对小鼠肘部和腕部肌肉，但通过调整电极对的长度和/或总数，可轻松修改用于记录不同肌肉或不同数量的肌肉。本文所述方法改编自先前用于在无头部固定条件下记录小鼠前肢和后肢肌肉活动的技术15,16,17。
电极制备需要大量练习才能掌握。建议在学习期间每天练习1-2小时。剥离电极是其中最具挑战性的步骤，因为需要精确控制力度，以切断绝缘层而不损伤内部金属丝。所需力度与刀片锋利程度密切相关，因此在学习过程中频繁更换手术刀片有助于保证操作的可重复性。将导线焊接到连接器的黄铜触点上也可能存在困难，因为不锈钢不易焊接。使用足量适用于不锈钢的助焊剂&#160;有助于促进焊点连接。
植入手术中的主要挑战是在不扰动已植入的导线或近端结的情况下打远端结。近端结必须足够大，以防止在插入部位滑入肌肉内——因此，在电极组件制备的第2步中应避免将结扎得过紧。如果近端结在植入后发生移位，可使用碳纤维尖头镊子小心地将其复位。在用镊子牢固夹住导线的同时，应缓慢收紧远端结，以避免将整个电极拉出。此步骤对于确保植入电极的长期稳定性至关重要：电极上施加过大的张力可能导致动物活动时电极断裂，而过松的电极则可能在恢复期间发生移位，导致组织愈合过程中与相应肌肉失去接触。
动物在手术后恢复情况通常良好，但仍需注意一些潜在的并发症。首先，小鼠一旦有机会便会啃咬缝线和电极。虽然伊丽莎白圈可防止这种行为，但同时也限制了动物自我理毛。部分小鼠会出现眼睛周围黏液样物质积聚的现象。少数雄性小鼠，尤其是年老个体，可能发生尿道阻塞，给动物带来痛苦。每天让动物在检查缝线前自由理毛20分钟，通常足以帮助其避免上述问题。
该方法存在一些重要的局限性需要注意。首先，这些定制电极通常无法分辨单个运动单元的活动。此外，电信号并不能保证完全来自某一特定肌肉（例如肱二头肌），因为难以排除邻近协同肌活动产生的串扰。因此，在发表的研究中，研究者通常根据肌肉的协同作用组别来命名所记录的肌肉（例如肘屈肌）。建议每次实验后进行尸检解剖，以确认各电极的位置，因为在恢复过程中电极可能在组织内发生移位。
对单个运动单元活动感兴趣的研究人员可考虑尝试由埃默里大学先进运动生物工程研究中心（CAMBER）开发的新型肌电图（EMG）电极。这些电极目前仍在研发中，但CAMBER将提供最新的电极设计。这类电极的主要缺点在于使用寿命：本方案中描述的手工制作电极通常可支持数周的记录，而CAMBER电极更适合短期实验。选择EMG记录方法的研究人员可直接联系CAMBER，以确定其电极是否适用于特定实验。

近几十年来，小鼠已成为研究哺乳动物运动系统的理想模式生物。常见的实验方法包括让头部固定的动物执行运动任务，同时监测和/或干扰神经活动1,2,3,4,5。在较大物种（如猫和灵长类动物）中开展的运动系统研究传统上依赖肌电图（EMG）在实验过程中直接测量运动输出6,7,8。然而，在小鼠中记录肌肉活动具有挑战性，因为其肌肉体积过小，无法使用适用于大型哺乳动物实验的商用EMG电极9。许多研究人员选择通过视频追踪肢体运动学4,10,11和/或行为表现2,4,12来间接评估运动输出，但这些方法缺乏足够的时间分辨率，无法检测神经活动及其干预对肌肉产生的毫秒级影响。因此，对于关注肌肉神经直接控制的研究人员而言，记录肌电图（EMG）具有重要意义。
肌电图（EMG）涉及测量两点之间的电压，这两点通常相距较短，大致与被记录肌肉的肌纤维平行。EMG电极包括表面（或 &#34;贴片&#34;）以及肌肉内（或 &#34;针&#34;）品种。表面电极放置在皮肤表面或肌肉组织上方，并用粘合剂或缝合方式固定。因此，表面电极比肌内电极更具微创性，因其使用相对简便，广泛应用于人类、猫和灵长类动物。表面电极在大鼠和小鼠中也已成功应用13,14然而，由于啮齿类动物在梳理毛发时倾向于移除异物，这些电极必须手工制作并经手术植入皮下。相比之下，肌内肌电图（EMG）电极则通过手术植入肌肉组织内部。由于电极被肌肉组织包裹，能够提供高空间分辨率，并可长期保持固定位置。因此，在啮齿类动物的长期实验中，植入式肌内EMG电极优于表面电极。为在小鼠中可靠记录肌内EMG信号，研究人员已开发出一种手工制作并植入电极的方法，可将电极植入成年小鼠前臂等微小肌肉中。这些电极可在数周时间内实现啮齿类动物运动行为期间的慢性肌肉记录。
本文所述方案是在对已有方法15,16,17,18长达十年的不断优化基础上发展而来的，建立了一种可在行为学小鼠的肘部和腕部屈肌/伸肌肌群中手工制作、植入并长期记录丝状电极肌电图（EMG）信号的技术。第一部分介绍了手工制作包含四对电极和一个8针连接器&#160;（用于头端接口）的电极组件的方法。第二部分详细描述了在同一台手术中将电极植入上臂和前臂肌肉内的外科操作流程，同时完成头固定板的植入。最后，展示了小鼠在执行多种行为任务时的代表性记录结果。总体而言，该方法是一种经济高效且可定制的手段，适用于在头固定行为实验中加入肌肉活动测量，特别适合具备一定电极制作经验的实验室采用。

<table><tbody><tr><td>#11 手术刀片</td><td>World Precision Instruments</td><td>504170</td><td>用于肌电图电极制作</td></tr><tr><td>#3 手术刀柄</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>用于肌电图电极制作</td></tr><tr><td>1 mL 皮下注射器（100 个装）&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>309597</td><td>用于注射药物给药</td></tr><tr><td>12 针连接器</td><td>Newark</td><td>33AC2371</td><td>带黄铜接头的 12 针连接器；用于肌电图电极制作</td></tr><tr><td>18 G 针头</td><td>Exel International</td><td>26419</td><td>用于肌电图电极制作</td></tr><tr><td>27 G 针头&amp;nbsp;</td><td>Exel International</td><td>26426</td><td>用于肌电图电极制作</td></tr><tr><td>3M Transpore 外科胶带</td><td>3M</td><td>1527-0</td><td>用于手术期间固定动物四肢</td></tr><tr><td>6-0 丝线缝合线</td><td>Henry Schein</td><td>101-2636</td><td>适用于腕部周围娇嫩皮肤的缝合&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>C&amp;B Metabond 完整套装</td><td>Pearson Dental</td><td>P16-0126</td><td>牙科水泥，用于将连接器固定在头板上</td></tr><tr><td>C57BL6/J 小鼠&amp;nbsp;</td><td>Jackson Laboratories</td><td>#000664</td><td>野生型小鼠&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Carbofib 5-CF 镊子（2 把）</td><td>Aven tools&amp;nbsp;</td><td>18762</td><td>碳纤维尖端镊子，用于操作电极的精细部分（剥除或插入段）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Carprodyl（卡洛芬）50 mg/mL 注射液</td><td>Ceva Animal Health, LLC</td><td>G43010B</td><td>可注射镇痛药，用于术中及术后疼痛管理</td></tr><tr><td>Castroviejo 微型持针器</td><td>Fine science tools</td><td>12060-01</td><td>用于缝合</td></tr><tr><td>Castroviejo 持针器（大号）</td><td>Fine science tools</td><td>12565-14</td><td>用于将针插入肌肉&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>精细骨刮匙</td><td>Fine science tools</td><td>10075-16</td><td>用于分离皮肤与下方组织&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dietgel 76A 饮食补充剂</td><td>Clear H2O</td><td>72-07-5022</td><td>用于术后护理</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 镊子</td><td>Fine science tools</td><td>11251-35</td><td>用于去除覆盖肌肉的筋膜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>小鼠伊丽莎白圈</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>EC201V-10</td><td>用于术后护理</td></tr><tr><td>恩诺沙星 2.27%</td><td>Covetrus</td><td>#074743</td><td>可注射抗生素，用于术中及术后</td></tr><tr><td>环氧凝胶</td><td>Devcon</td><td>14265</td><td>用于肌电图电极制作</td></tr><tr><td>Hopkins 蛙嘴钳（4 把）</td><td>Stoelting</td><td>10-000-481</td><td>用于头板植入的组织夹</td></tr><tr><td>异氟烷溶液</td><td>Covetrus</td><td>11695067771</td><td>吸入性麻醉剂</td></tr><tr><td>盐酸利多卡因注射液 - 2%</td><td>Covetrus</td><td>#002468</td><td>局部镇痛药，用于术中疼痛管理</td></tr><tr><td>医用级氧气</td><td>Airgas</td><td>OX USP200</td><td>用于手术期间输送异氟烷</td></tr><tr><td>MetriCide 1 加仑装</td><td>Metrex</td><td>10-1400</td><td>戊二醛溶液，用于头板和电极的冷灭菌&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MetriTest 试纸 1.5%</td><td>Metrex</td><td>10-303</td><td>用于监测戊二醛溶液的试纸（推荐使用）</td></tr><tr><td>Model 900LS 小动物立体定位仪</td><td>Kopf Instruments&amp;nbsp;</td><td>900LS</td><td>带旋转平台功能的立体定位仪，可在手术期间旋转平台&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带 PFA 涂层的 0.0055&quot; 编织不锈钢丝&amp;nbsp;</td><td>A-M systems&amp;nbsp;</td><td>793200</td><td>用于肌电图电极制作</td></tr><tr><td>聚维酮碘消毒片</td><td>Dynarex</td><td>1108</td><td>用于皮肤清洁&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Puralube Vet 软膏&amp;nbsp;</td><td>Dechra</td><td>37327</td><td>手术用眼膏&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>无菌酒精消毒片</td><td>Dynarex</td><td>1113</td><td>用于皮肤清洁&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>直头精细 #5 镊子</td><td>Fine science tools</td><td>11295-10</td><td>用于插入后弯曲导线&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>直头精细剪刀</td><td>Fine science tools</td><td>14060-11</td><td>用于剪切导线&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>学生型 Vannas 弹簧剪刀</td><td>Fine science tools</td><td>91500-09</td><td>用于切口、修剪脂肪和筋膜以及缝合&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Technik 7B-SA 镊子（2 把）</td><td>Aven tools</td><td>18074USA</td><td>弯头钝头镊子，用于手术中的一般操作</td></tr><tr><td>三重抗生素软膏</td><td>Walgreens</td><td>975863</td><td>手术用局部抗生素</td></tr><tr><td>V-1 台式实验室动物麻醉系统</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td>包含麻醉诱导和废气清除所需全部设备，包括蒸发器、诱导室、可移动塑料鼻罩和管路&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

使用慢性植入式肌电图电极记录头部固定小鼠前肢肌肉活动

Recording Forelimb Muscle Activity in Head&#45;Fixed Mice with Chronically Implanted EMG Electrodes

小鼠系统神经科学研究中强大的遗传学和分子工具使研究人员能够在固定头部的小鼠执行多种任务时，以前所未有的精度探究运动系统的功能。由于小鼠体型较小，难以准确测量其运动输出，因为传统的肌电图（EMG）记录肌肉活动的方法原本是为猫和灵长类等体型较大的动物设计的。目前市面上尚无商用的小鼠专用EMG电极，因此当前记录小鼠肌肉活动的金标准方法是在实验室内部自行制作电极。本文介绍了一种改进的电极组手工制作流程，包括与头部固定板植入术同步进行的电极植入、将连接器固定在头部固定板上，以及术后恢复护理。经过恢复期后，可在数周内对固定头部的小鼠在行为过程中进行毫秒级分辨率的EMG记录，且信号质量无明显下降。这些记录可实现对前肢肌肉活动的精确测量，同时结合in vivo神经活动记录和/或干预，以深入探究小鼠运动控制的神经机制。

图2, 图3，以及 图4 显示从小鼠前肢肌肉记录到的标准化肌肉活动，这些小鼠正在进行不同行为：在跑台上行走且未固定头部（图2），在头部固定条件下攀爬旋转轮图3），以及在头部固定条件下伸手获取水滴（图4). 图2 显示了跑步机上行走1.5秒的过程，步态周期约为连续两次肘屈肌激活之间的时间间隔。 图3 显示了某动物植入后6周腕伸肌电极失效时的5秒EMG数据。在 图3A四个电极均产生清晰的肌电图信号，该信号与转轮动作（表明攀爬行为）相一致。 图3B 显示电极失效后的相同电极信号：腕伸肌电极产生噪声信号，且不随动物运动而变化。 图4 显示小鼠从静止状态转变为伸手获取水滴任务过程中，前肢四组肌肉群持续1秒的肌电图（EMG）信号。
在 图2, 图3，以及 图4电压信号经差分放大器进行放大和带通滤波（250-20,000 Hz）. 原始电压信号随后被下采样至 1 kHz，并进行 z 分数标准化，以便在不同数据集间进行比较。需再次注意，尽管电极按照方案植入指定的四块肌肉（肱二头肌、肱三头肌、桡侧腕长伸肌和掌长肌），但无法完全排除邻近协同肌对肌电（EMG）信号的干扰；因此，为确保准确性，每段记录均根据其所属的协同作用组（如肘屈肌等）进行归类。若要验证单块肌肉的独立记录，需同时对多个协同肌进行记录以检测信号串扰，但这种方法可能极为困难，尤其是在小鼠前肢部位。
<img alt="电极组件示意图，包含连接器；显示用于神经生理学装置的焊线和热缩管。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66584/66584fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：电极组制备示意图。（A）单个电极对的示意图。灰色区域表示需要剥除绝缘层的位置。（B）连接器组件示意图，其中已插入一个完成的电极对。图（B）未按比例绘制。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66584/66584fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="肌电图信号示意图；行走步态周期中肘部/腕部屈肌-伸肌的肌肉活动。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66584/66584fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：自由活动（非头部固定）小鼠在跑步机上行走时四个肌肉的代表性肌电图（EMG）记录。 总时长为 1.5 秒。步态周期通过连续的肘部伸肌激活之间的时间间隔进行估算。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66584/66584fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示肘部、腕屈肌和伸肌在电极失效前/后肌电图信号的图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66584/66584fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：头固定小鼠执行自然攀爬行为时，四个肌肉的代表性肌电图记录。 5th 行显示了由旋转编码器读取的攀爬轮位置；该数值的变化表明轮子正在转动，动物正处于主动攀爬状态。总持续时间为5 s。A植入后第36天在攀爬过程中进行记录。B植入后72天，在同一小鼠中记录，此时腕伸肌电极已失效。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66584/66584fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示肌肉在静止和伸手动作期间活动的肌电图；肘部、腕部肌肉。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66584/66584fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：头部固定的 小鼠从静止状态过渡到执行伸手动作时，四块肌肉的典型肌电图记录。 总持续时间为 1 s。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66584/66584fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了在小鼠前肢肌肉中手工制作并外科植入肌电图（EMG）电极的方法，用于在头部固定行为实验期间记录肌肉活动。

小鼠系统神经科学研究中可用的强大遗传学和分子工具使研究人员能够探究运动系统功能，以……

我感兴趣的是小鼠运动皮层中被称为原发性运动皮层和次级运动皮层的区域，如何在不同类型运动过程中相互作用并影响肌肉活动。我们知道，原发性运动皮层和次级运动皮层均投射至脊髓，但它们对运动的影响方式尚不明确。因此，我使用本方案，通过比较失活原发性运动皮层和次级运动皮层对前肢肌肉活动在整个运动过程中的影响，来理解它们在运动控制中的差异性作用。前肢肌肉肌电图（EMG）的应用使我们能够测量对运动系统不同区域进行光遗传学失活后对运动输出的影响。例如，我们已能够证明，运动皮层对肌肉的直接作用仅特异性地出现在某些运动行为中，以及这些行为中特定的肌肉活动状态期间。如今，新型的大规模多电极阵列（如神经像素探针，neuro-pixels）使我们能够同时记录跨越多个运动系统区域的大量神经元群体的活动。在进行这些神经记录的同时进行肌电图（EMG）记录，将使我们能够表征这些运动系统区域之间的相互作用如何依赖于肌肉活动状态。开始制作电极组件时，首先用一个单结将两根PFA涂层编织不锈钢丝绑在一起。将一根18号针头插入一块瓦楞纸板中。将结打在距离针头插入端6厘米处。然后将电极丝拉向纸板，使其在针头周围收紧。小心取出针头，以保持结的完整性，并再次拉紧结两次，以进一步加固。接下来，将电极紧贴在一块平整的纸板上并用胶带固定。确保两个连接端的导线并拢在一起，而插入端的导线则分开。使用手术刀在绝缘层上精确地划出小切口，标记出需要去除绝缘层的末端位置。在每个标记位置进行约六次切割，其中在导线的顶部、两侧和底部各切割两次。将手术刀片倾斜，沿已松动的绝缘层纵向切割，并用镊子小心地将其从导线上移除。在连接端，剥离导线末端1毫米的绝缘层；在插入端，则剥离5毫米的绝缘层。将导线插入端的线段拧在一起，并将裸露的端部压接在一支0.5英寸27号针头的针管内。接着，使用一对直头镊子小心地将每个焊接好的黄铜接头重新插入连接器中。确保每对电极的导线彼此相邻且无缠绕。用环氧树脂涂覆针脚插槽，以使连接器附近的所有金属或导线与组织绝缘。首先，延长已植入头板的麻醉小鼠颈部背面的切口。使用钝性骨刮匙将颈部切口下方的皮肤与深层组织分离。将刮匙插入皮肤下方并穿过颈部切口，以疏通电极的通路。将大号持针钳的尖端从肱三头肌切口插入，并从颈部切口穿出。沿电极针的长轴方向，用持针钳夹紧电极针。然后将其穿过至肱三头肌切口处。接着，将一根27号针头弯成轻微的弧形。用持针器夹住针头，然后将其压在一把镊子的手柄上，使其再产生5至10度的弯曲。在针头长度方向上的不同位置共添加三个弯曲。接下来，确定肌肉上的进针点和出针点。使用精细镊子清除遮挡进针点和出针点处的筋膜脂肪组织。将导线平行于肌纤维方向浸入肌肉3至5毫米后，使用持针器将针头插入肌肉的近端。然后推动针头穿过肌肉至穿出部位。当针头穿出肌肉后，用钝头镊子夹住针尖，并将针头完全拉出。用镊子在出口处打一个松散的远端结。将结收紧至形成一个一厘米的环。用镊子推动该环，并将其置于出口处上方。 确定远端结的位置后，用一对精细弯头镊子轻轻夹住线环，将线环在镊子上拉紧。将精细镊子从结上移开。用精细弯头镊子将结推向出口处，同时用手指牵拉针端，完成结的收紧。使用直头精细镊子夹住出线结。然后将远端导线紧密缠绕在镊子上，使导线绕过线结并朝向肌肉。最后，在远端线结远侧约 0.5 毫米处剪断导线，留下一小段导线卷曲在线结周围。所有植入的电极在植入后36天均产生了清晰的肌电图信号。然而，在72天后，腕伸肌电极失效。

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