Name: 在纳米和微米大小的囊泡中构建失衡代谢网络 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 探索在脂质囊泡中重建膜蛋白与封装酶的方法，用于构建合成细胞并实现自主生长与信息传递。该技术为合成生物学、诊断治疗及自适应材料研究提供新途径。

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作者感谢 Aditya Iyer 在 pBAD-PercevalHR 基因克隆方面的工作，以及 Gea Schuurman-Wolters 在蛋白质表达与纯化方面的协助。本研究由荷兰科学研究组织（NWO）引力计划&#34;构建合成细胞&#34;（BaSyC）资助。

Lipid Vesicle Encapsulation Protocol for Complex Protein Networks

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作者声明不存在竞争性财务利益。

我们提出了一种合成含有（膜）蛋白的亚微米级脂质囊泡（proteoLUVs）以及将proteoLUVs转化为巨大单层囊泡（proteoGUVs）的实验方案。该方案适用于其他膜蛋白13,19,30,40的重建，以及除本文所述L-精氨酸降解和甘油-3-磷酸合成途径以外的其他代谢网络的封装。
膜蛋白在脂质体中的重组通常会导致蛋白质在脂质膜中随机取向。对于 ArcD 和 Glpt 而言，取向无关紧要，因为这些蛋白质具有双向功能，溶质的移动方向取决于总电化学势的符号。但对于单向功能的蛋白质来说，当其取向为50/50时，将有一半的分子无法参与活性作用。
通过聚碳酸酯滤膜挤出囊泡可缩小其尺寸分布，且滤膜孔径越小，囊泡的均一性越高。然而，囊泡尺寸越小，其体积也越小，导致每个囊泡所含的蛋白质（如酶、膜蛋白）数量极少。为尽量减少大单层囊泡（LUVs）中缺失一种或多种组分的比例，可通过调节蛋白质浓度来实现，如图3A、B所示；但对于非常小的囊泡，随机效应不可避免。
凝胶辅助溶胀法依赖于将超声处理后的囊泡（SUVs）沉积在干燥的琼脂糖表面。在干燥过程中，囊泡会形成浓度梯度，其中脂质浓度在斑点边缘处最高。这是由于一种被称为“咖啡环&#160;效应”的现象所致41,42。因此，只有斑点内部很小的区域含有适合形成GUV的脂质浓度。这种呈圆形且脂质分布不均的斑点导致大量区域无法用于囊泡融合，从而使得该方法中GUV的生成效率较低。为了提高GUV的产率，应力求实现脂质的均匀沉积，这可以通过旋涂法42或利用咖啡环效应41来实现。
关于该实验方案的进一步说明：
应注意，每个囊泡上平均重组的膜蛋白数量应为多个（&#62;10），以避免随机效应。因此，脂质与蛋白的质量比（w/w）不应高于400:1。大多数蛋白的取向假设为随机分布。
理想情况下，总膜蛋白的体积应尽可能小，且无论如何不应超过脂质体体积的10-20%。加入较大体积的蛋白溶液会引入更多去垢剂，可能导致大部分已形成的脂质体破裂，从而对重组效率产生不利影响。
在包封过程中，为避免组分被稀释，使用适当的溶液预先平衡挤出机非常重要。理想情况下，预平衡溶液中也应包含可溶性酶，但由于预平衡挤出机所需的溶液体积相对较大，加入酶的成本可能过高。因此，我们通常省略这些组分，并接受酶被稀释5%的结果。
应将离子载体添加到含有蛋白脂质体的混合物中，因为这些分子具有高度疏水性，在缺乏囊泡的情况下可能吸附于各种表面。添加的溶剂体积应尽量小（&#60;总体积的1%）。需设置对照实验，以确认溶剂不会影响囊泡中的代谢网络。对于总脂质浓度约为3 mg/mL的情况，一般使用约1 µM的离子载体浓度是安全的。
应确保将液滴彻底干燥。如果液滴干燥不充分，在加入溶胀溶液时，脂质会形成脂质聚集体，降低GUV的形成效率，并可能导致多层囊泡（MLVs）的形成。
葡萄糖用于使外部环境与内部介质的渗透压相匹配；内部介质中则使用蔗糖替代葡萄糖，以增加囊泡的密度，从而促进大单层囊泡（GUVs）的沉降。此外，外部环境中的葡萄糖可增强相位对比度，使囊泡更易于观察。
随机效应在GUVs中问题较小；但此处，表面积与体积之比可能变得过低，导致膜蛋白（如转运蛋白）的数量不足以支持内部代谢网络的需求。本方案中描述的方法无法精确控制蛋白脂质体（proteoGUVs）的大小，但大多数其尺寸落在5-50 µm范围内。
综上所述，本文所展示的工作为膜蛋白的重建以及酶在不同大小脂质囊泡中的封装提供了全面的概述。我们展示了功能性囊泡的构建，该囊泡能够利用氨基酸和甘油等简单前体合成ATP和生命基本组分。尽管在巨大单层囊泡（GUVs）中重建膜蛋白仍具挑战性，但本文所介绍的实验方案为自下而上的合成生物学研究的进一步发展奠定了基础。

自下而上的合成生物学领域致力于构建（最小）细胞1,2 用于生物技术的代谢生物反应器3,4 或用于生物医学目的5,6,7,8合成细胞的构建为研究人员提供了一个独特平台，使其能够在模拟天然环境的明确定义条件下研究（膜）蛋白, 从而实现对蛋白质和反应网络的涌现特性及隐蔽生化功能的发现9作为实现自主运作的合成细胞的中间步骤，研究人员开发出能够捕捉生命细胞基本特征的模块，例如代谢能量的保存、蛋白质与脂质的合成以及稳态维持。这些模块不仅加深了我们对生命的理解，还在医学领域具有潜在应用价值8 和生物技术10.
跨膜蛋白几乎存在于所有代谢网络的核心，它们负责将分子转运进或出细胞，传递信号并响应环境变化，同时还发挥多种生物合成作用。因此，在合成细胞中构建代谢模块通常需要将整合膜蛋白和/或外周膜蛋白重构到由特定脂质组成且具有高完整性的（低通透性）双层膜中。这些膜蛋白的操作具有挑战性，需要专门的知识和实验技能。
已开发出多种方法用于在磷脂囊泡中重建膜蛋白，其主要目的通常是研究特定蛋白的功能11,12、调控机制13、动力学特性14,15、脂质依赖性15,16和/或稳定性17。这些方法包括：将去垢剂溶解的蛋白在脂质存在下迅速稀释至水相介质中18；通过将去垢剂溶解的蛋白与去垢剂不稳定的脂质囊泡共孵育，并利用聚苯乙烯珠吸附去除去垢剂19；或通过透析或尺寸排阻色谱法去除去垢剂20。有机溶剂也曾被用于形成脂质囊泡，例如通过油-水界面的形成21，但大多数整合膜蛋白在接触此类溶剂时会失活。
在我们的实验室中，我们主要采用去垢剂吸附法重构膜蛋白，以形成大单层囊泡（LUVs）19。该方法可实现多种膜蛋白的共重构，并能将酶、代谢物和探针封装于囊泡腔内22,23。含有膜蛋白的LUVs可通过电场成形法24或凝胶辅助溶胀法25，在特定条件下转化为巨大单层囊泡（GUVs），且可选择性地包封水溶性组分，同时保持膜蛋白的完整性26。
本文介绍了一种在大单层脂质体（LUVs）中重建非平衡代谢网络的实验方案，该网络通过将L-精氨酸分解为L-鸟氨酸来再生ATP27。ATP的生成与甘油-3-磷酸（G3P）的产生相偶联，而G3P是磷脂合成的重要前体分子22,28。该代谢途径包含两种整合膜蛋白：精氨酸/鸟氨酸反向转运蛋白（ArcD）和G3P/无机磷酸盐（Pi）反向转运蛋白（GlpT）。此外，还需要三种可溶性酶（ArcA、ArcB、ArcC）以实现ATP的循环利用，并利用L-精氨酸分解产生的ATP，通过甘油激酶（GlpK）将甘油转化为甘油-3-磷酸。代谢途径的示意图见图1。本方案为未来构建更复杂的反应网络（如脂质或蛋白质合成、细胞分裂等）提供了良好的起点。该脂质体的脂质组成支持多种整合膜蛋白的活性，并已针对多种分子进出脂质体的运输过程进行了优化27,29,30。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig01v2.jpg" /> 
图1：ATP生成及甘油-3-磷酸合成与分泌途径概览。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
简而言之，将纯化的膜蛋白（溶于十二烷基-β-D-麦芽糖苷，DDM）加入已用Triton X-100去稳定的预制脂质体中，使蛋白插入脂膜。随后通过缓慢添加活化的聚苯乙烯珠去除去垢剂分子，从而形成封闭性良好的蛋白脂质体。可将可溶性组分加入脂质体，并通过冻融循环将其包裹在膜融合过程中形成的内部空间。所得脂质体高度异质，且多数为多层结构。随后通过孔径为400、200或100 nm的聚碳酸酯滤膜挤出，获得尺寸更均一的脂质体；孔径越小，所得脂质体越均一且更倾向于单层结构，但内部容积相应减小。未嵌入的蛋白和小分子可通过尺寸排阻色谱法从外部溶液中去除。蛋白脂质体（proteoLUVs）可通过凝胶辅助溶胀法转化为微米级脂质体，这些微米级蛋白大脂质体（proteoGUVs）随后被收集并捕获于微流控芯片中，用于显微表征与操作。图2展示了该完整实验流程的示意图。
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig02v2.jpg" /> 
图2：重建膜蛋白并将酶及水溶性组分包封于亚微米级（LUVs）和微米级（GUVs）脂质体中的实验方案概览。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
重组和包封方案效果良好，且蛋白质的功能得以保留，但蛋白脂质体（proteoLUVs）和大单层囊泡（proteoGUVs）在尺寸上具有异质性。微流控方法31,32 可形成尺寸更均一的微米级囊泡，但通常无法实现膜蛋白的功能性重组，原因是双分子层中残留的溶剂会使蛋白质失活。蛋白脂质体的尺寸范围为100至400 nm，在酶浓度较低时，包封可能导致囊泡内代谢通路不完整（随机效应；见图3）。大单层脂质体（LUVs）适用于构建特定的代谢模块，本文展示了其用于生成ATP以及如G3P等基本构建单元的应用。此类蛋白脂质体有望被进一步包封于大单层囊泡（GUVs）中，作为宿主囊泡内的类细胞器区室。
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig03v2.jpg" /> 
图3：直径为100、200或400 nm的囊泡中每囊泡分子数。（A）当包封的蛋白质（酶、探针）浓度在1–10 µM范围内时。（B）膜蛋白与脂质（mol/mol）的重组比例分别为1:1,000、1:10,000和1:100,000。我们假设分子以所示浓度被包封，并以这些蛋白-脂质比例整合到膜中。对于某些酶，我们观察到它们会结合到膜上，这可能会增加其在囊泡中的表观浓度。缩写：LPR = 脂质-蛋白比例 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414-25g</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 截留滤膜</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Millipore 离心滤过装置 Amicon Ultra&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BioBeads</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MFCD00000826</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-葡萄糖</td><td>Formedium</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-蔗糖</td><td>福麦迪姆</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DDM</td><td>糖原</td><td>D97002 -C</td><td></td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Biosolve</td><td>52805</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ml</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPE</td><td>Avanti</td><td>850725P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti</td><td>840475P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Formedium&amp;nbsp;</td><td>DTT005</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>J.T.Baker Avantor</td><td>MFCD00003568</td><td></td></tr><tr><td>挤出器</td><td>Avestin Inc</td><td>LF-1</td><td></td></tr><tr><td>荧光计</td><td>Jasco</td><td>Spectrofluorometer FP-8300</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>BOOM</td><td>51171608</td><td></td></tr><tr><td>重力流柱</td><td>Bio-Rad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 注射器 100 &amp;micro;L</td><td>Hamilton</td><td>7656-01</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 注射器 1000 &amp;micro;L</td><td>Hamilton</td><td>81320</td><td></td></tr><tr><td>手持式LCP分配器</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>620-411-00</td><td></td></tr><tr><td>手持式超声波破碎仪</td><td>Hielscher 超声波技术</td><td>UP50H</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>BOOM</td><td>x76021889.1000</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Roth</td><td>X998.4-250g</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Supelco</td><td>1.05099.1000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>BOOM</td><td>76028270.1</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Supelco</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech Science</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>大容量Falcon管离心机</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>L-精氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5006-100G</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Leica</td><td>DM LS2</td><td></td></tr><tr><td>L-鸟氨酸</td><td>Roth</td><td>T204.1</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710 ConfoCor 3</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-1KG</td><td></td></tr><tr><td>微流控芯片</td><td>自制&amp;nbsp;</td><td>基于 PDMS 的</td><td>DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J</td></tr><tr><td>Na-ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754-1G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Supelco</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 分光光度计</td><td>Isogen生命科学</td><td>ND-1000 分光光度计 NanoDrop</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Supelco</td><td>1.06498.1000</td><td></td></tr><tr><td>用于GUV的针头</td><td>Henke-Ject</td><td>14-14575</td><td>27 G x 3/4&#039;&#039; 0.4 × 20 mm</td></tr><tr><td>微流控用针头</td><td>Henke-Ject</td><td>14-15538</td><td>18 G × 1 1/2&#039;&#039; 1.2 × 40 毫米</td></tr><tr><td>Ni&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Sepharose</td><td>Cytiva</td><td>17526802</td><td></td></tr><tr><td>尼日里菌素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143-5MG</td><td></td></tr><tr><td>摆动器</td><td>VWR</td><td>83007-210</td><td></td></tr><tr><td>渗透压仪</td><td>Gonotec Salmenkipp</td><td>Osmomat 3000 basic 冰点渗透压仪</td><td></td></tr><tr><td>Plasmacleaner</td><td>等离子体刻蚀</td><td>PE-Avenger</td><td></td></tr><tr><td>聚碳酸酯滤膜</td><td>Cytiva Whatman</td><td>Nuclepor 微孔蚀刻膜 产品编号：10417104</td><td>0.4 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>聚碳酸酯超速离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>355647</td><td></td></tr><tr><td>吡喃宁</td><td>Acros Organics</td><td>H1529-1G</td><td></td></tr><tr><td>石英比色皿（黑色）</td><td>Hellma Analytics</td><td>108B-10-40</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-75 树脂&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0050-01</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Sonics Sonics &amp;amp; 材料公司 INC</td><td>Sonics Vibra Cell</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Sarstedt</td><td>Filtropur S plus 0.2</td><td>0.2 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>哈佛仪器</td><td>A-42467</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>离心机 5418</td><td></td></tr><tr><td>聚四氟乙烯垫片</td><td>自制&amp;nbsp;</td><td>基于聚四氟乙烯</td><td>45 × 26 × 1.5 或 45 × 26 × 3 或 20 × 20 × 3 mm</td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1086.1000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>贝克曼库尔特</td><td>Optima Max-E</td><td></td></tr><tr><td>紫外灯</td><td>Spectroline</td><td>ENB-280C/FE</td><td></td></tr><tr><td>紫外/可见光分光光度计</td><td>Jasco</td><td>V730 分光光度计</td><td></td></tr><tr><td>缬氨霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0627-10MG</td><td></td></tr><tr><td>宽场荧光显微镜</td><td>蔡司</td><td>AxioObserver</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-酪蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5890-500g</td><td></td></tr></tbody></table>

构建纳米和微米级囊泡中非平衡代谢网络

Construction of Out&#45;of&#45;Equilibrium Metabolic Networks in Nano&#45; and Micrometer&#45;Sized Vesicles

我们介绍一种使用纯化组分将包含整合膜蛋白、酶和基于荧光的传感器在内的复杂蛋白质网络整合到囊泡中的方法。该方法适用于生物反应器的设计与构建，以及复杂非平衡代谢反应网络的研究。首先，我们根据先前建立的方案，将（多个）膜蛋白重构至大单层囊泡（LUVs）中。随后，通过冻融-挤出法将纯化的酶、代谢物和基于荧光的传感器（荧光蛋白或染料）混合物封装入囊泡，并通过离心和/或尺寸排阻色谱去除未封装的组分。通过荧光检测实时监测ATP/ADP比值、代谢物浓度、内部pH值或其他参数，以评估代谢网络的性能。我们所制备的直径为100–400 nm并含有膜蛋白的囊泡，可通过现有但经过优化的程序转化为巨大单层囊泡（GUVs）。该方法可将可溶性组分（酶、代谢物、传感器）引入微米级囊泡，从而使生物反应器的体积扩大数个数量级。含有代谢网络的GUVs被&#160;捕获在微流控装置中，以便通过光学显微镜进行分析。

将溶解的膜蛋白重建入脂质体中，需要对预先形成的囊泡进行去稳定化处理。加入少量Triton X-100最初会导致540 nm处吸光度（A540）升高，这是由于囊泡膨胀引起光散射增强所致（图4）。A540达到最大值时，表明脂质体已达到去垢剂饱和点（Rsat）；此后继续添加Triton X-100将导致囊泡部分溶解。在Rsol时，脂质体完全溶解（图4）。在膜蛋白重建实验中，我们通常使用去垢剂处理至超过Rsat 60%的去稳定化囊泡（以箭头指示）。
重组膜蛋白 ArcD 用于将 L-精氨酸转运进囊泡，同时将 L-鸟氨酸转运出囊泡，并与包封的酶 ArcA、ArcB 和 ArcC 共同作用，利用 ADP 和无机磷酸盐再生 ATP。GlpT 是一种甘油-3-磷酸/磷酸盐反向转运蛋白，需与 GlpK 共同作用，以利用 L-精氨酸降解产生的甘油和 ATP 合成（并排出）甘油-3-磷酸。在 t = 0 时向蛋白脂质体中加入 5 mM L-精氨酸，导致 PercevalHR 荧光在 500 nm 与 430 nm 激发下的比值急剧上升39，该比值反映囊泡内的 ATP/ADP 比例（图 5）。加入甘油后，ATP 被用于合成甘油-3-磷酸，导致 ATP/ADP 比值下降28。L-精氨酸的降解还会引起 pH 变化，可通过吡喃宁（pyranine）或 pHluorin 进行定量检测27。
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig05v2.jpg" /> 
图5：通过L-精氨酸分解途径实现ATP的循环利用。 将脂质浓度为2.7 mg/mL的LUVs置于比色皿中，记录500 nm与430 nm处荧光强度的比值。在t = 0时加入5 mM L-精氨酸。F500/F430比值反映囊泡内ATP/ADP的比值。缩写：LUVs = 大型单层囊泡。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
产生ATP的LUV也可用于形成GUV。将干燥的蛋白脂质体LUV在LGT琼脂糖凝胶上重新水化，可形成微米级囊泡（图6）。在干燥的LUV斑点内形成蛋白脂质体GUV的效率在很大程度上取决于局部脂质浓度和脱水程度。某些区域可形成大片的GUV聚集体，而在同一液滴的其他位置则可能无法形成或仅形成少量GUV。通过LGT琼脂糖辅助溶胀法形成的GUV尺寸范围较广，通常从几微米&#160;到超过50 μm。
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig06v2.jpg" /> 
图6：通过凝胶辅助溶胀法形成的蛋白脂质巨囊泡的微分干涉差显微图像。 比例尺 = 25 µm。缩写：DIC = 微分干涉差；GUVs = 巨单层脂质囊泡。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
GUVs 被收集并捕获在经 β-酪蛋白钝化的基于 PDMS 的微流控装置中（图7）。该装置的设计使得可在单次实验中同时捕获并分析多个囊泡，并可用于控制外部环境（如流速、缓冲液组成等）34。即使蛋白- GUVs 的产率较低，GUVs 在微流控芯片中的持续流动仍可实现大量囊泡的收集。当捕获足够数量的 GUVs 后，系统使用渗透压平衡的缓冲液进行洗涤，以去除可溶性蛋白、小分子和荧光探针等外部组分。随后，将洗涤缓冲液替换为渗透压相等的底物溶液，其中包含 50 mM KPi（pH 7.0）、不同量的葡萄糖（用于调节渗透压）以及如 10 mM L-精氨酸等底物。在微流控芯片的多个捕获位点上进行时间序列实验，每隔 90 秒采集一次图像（当使用 PercevalHR 时，激发波长为 405 nm 和 488 nm）。此外，在每个时间点均采集明场图像。在 488 nm 和 405 nm 激发后测得的发射光强度比值可反映囊泡内 ADP/ATP 的比值。
<img alt="图7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig07.jpg" /> 
图7微流控芯片对囊泡的捕获 (A)&#160;囊泡的捕获，同时能够控制外部环境和流速。B) 微流控装置中捕获的ProteoGUVs，使用405 nm激光（绿色）和488 nm激光（红色）激发，两个通道的发射光均在 &#62;500 nm。明场图像可实现对囊泡的非荧光可视化观察。比例尺 = 25 &#181;m缩写：GUVs = 巨型单层囊泡。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

我们介绍一种用于重建膜蛋白并将酶及其他水溶性组分包裹于亚微米及微米级脂质囊泡中的实验方案。

我们提出一种将包含整合膜蛋白、酶和基于荧光的传感器等复杂蛋白质网络整合入囊泡的方法，……

在荷兰，基础联盟旨在从分子组分构建合成细胞。该联盟由来自分子生物学、化学、物理学和计算科学等领域的研究团队组成。该联盟的目标是创建一种能够自主生长、传递信息并进行分裂的自复制系统。目前，我们的研究重点是构建分子网络，并将其整合为更复杂的分子系统。合成生物学的最新进展包括设计用于细胞功能的模块，并将其整合成复杂的网络，应用于诊断、治疗、合成免疫学以及自适应材料等领域。这一进展涵盖了欧洲、美洲和亚洲的多个研究团队，他们正在采用自上而下和自下而上的方法，共同推动合成细胞的构建。本领域的现有技术包括用于构建和优化代谢网络的工程学与进化方法。我们利用人工智能进行分子筛选，并采用先进的生物化学与生物物理技术进行组分分离和网络组装。此外，我们还运用膜重组、物理包埋，以及荧光光谱和显微技术进行可视化分析。随着模块的整合，膜蛋白和酶的数量大幅增加，这对我们的重建和封装技术提出了更高的要求。在亚微米级囊泡中，随机封装成为一个问题，而当在脂质膜中重建多种膜蛋白时，形成微米级囊泡的效率也会降低。在Corium中，我们已开发出用于ATP生成的代谢网络，并通过底物供给和产物输出维持非平衡状态。此外，我们将ATP循环与脂质前体的合成和分泌相偶联，使次级囊泡能够产生脂质，这在我们的研究领域中是一项重要进展。开始实验时，将一份脂质体置于室温水浴中，以解冻囊泡。随后用缓冲液A预平衡装有滤器的挤出器。将解冻后的脂质体通过挤出器挤出13次。将挤出的脂质体收集到塑料管中，尽量减少死体积。随后，用移液器吸取1 mL稀释后的脂质体溶液，加入透明比色皿中。使用分光光度计在540纳米处测量其初始光密度。向脂质体中加入 50 微升 10% Triton X-100。当溶液达到最大光密度后，用 Triton X-100 滴定，直至光密度达到 60% 饱和度。将去垢剂 destabilized 的囊泡倒回塑料管中。接下来，将纯化的膜蛋白加入去稳定的脂质体中，直至达到所需的400:1比例。在4°C条件下孵育样品15分钟。然后加入200毫克洗涤并去水的聚苯乙烯珠，以去除去垢剂。现在将一个空的10毫升重力流层析柱固定在置于冰上的空的6.5毫升超滤离心管上方。将样品倒入重力流层析柱中，并在超滤离心管中收集蛋白脂质体。向珠中加入0.5毫升缓冲液A。将滤液收集到超速离心管中。接下来将蛋白脂质体放入超速离心机中进行浓缩。弃去上清液后，将沉淀的蛋白脂质体重新悬浮于200 µL缓冲液A中，总体积为200 µL。将最终的蛋白脂质体体积分为三等份。低浓度的Triton X-100最初导致在540纳米处的吸光度增加。进一步添加则引起囊泡的部分溶解。在我们观察时，脂质体已完全溶解。首先，将92.7 µL缓冲液A移液至一个空的1.5 mL离心管中。然后依次加入DTT、ADP钠盐、氯化镁、L-鸟氨酸以及酶。轻轻混匀溶液后，将其加入66.6 µL预先制备好的蛋白脂质体上层。将混合物在液氮中快速冷冻，然后在约10摄氏度的冰水浴中解冻。将包封混合物通过预平衡的滤膜（平衡缓冲液为缓冲液A、DTT、钠盐ADP和L-鸟氨酸）在挤出器中挤出13次，并将挤出液收集至1.5毫升离心管中。为测定ATP的合成，用移液器将缓冲液K、蛋白脂质体和离子载体加入带有小窗口的黑色石英比色皿中。在荧光分光光度计中将样品预热至30摄氏度。随后获取Percival HR的激发光谱。当探针信号稳定后，加入过量L-精氨酸和甘油以启动代谢网络，并随时间追踪反应进程。向蛋白脂质体中加入L-精氨酸后，Percival HR在500纳米和430纳米激发波长下的荧光强度比值迅速升高。首先，将剪切过的200微升移液枪头底部插入预制的微流控捕获装置中。使用配备0.2微米滤器的注射器，向芯片的进样储液池中加入400微升β-酪蛋白溶液。将芯片在900 ×g条件下离心6分钟。此时，进样端和出样端的液面高度应保持一致。在两张载玻片上画出垫片的轮廓。用高氧等离子体清洁载玻片一分钟，使其具有亲水性。将低凝胶温度琼脂糖加至载玻片表面，直至完全覆盖。然后将载玻片倾斜至90度角，使多余的琼脂糖流到纸巾上。将载玻片置于50摄氏度下30分钟。使用配备一毫米探头的手持探针式超声仪，对制备好的蛋白脂质体进行超声处理。在重复超声处理五次前，将蛋白脂质体SUV置于冰上保持30秒。使用100微升注射器，将0.5微升的蛋白脂质体SUV液滴加到预先制备的琼脂糖凝胶上。用氮气吹扫约10分钟，使液滴干燥。使用注射器和针头移液器通过侧面的小孔将溶胀液注入已准备好的腔室中，使囊泡在22摄氏度下溶胀至少30分钟。将腔室在固体表面轻敲，以从凝胶上收集GUVs。为在显微镜下捕获GUVs，将经过钝化处理的微流控芯片安装在显微镜上。检查无缺陷后，将带弯针的管路连接至储液罐出口。将另一端连接至一个1毫升注射器，然后将注射器安装到最大流速为10 µL/min的泵上。用新鲜培养基替换储液罐中的洗涤缓冲液。用至少 80 微升缓冲液 P 洗涤。去除多余缓冲液后，将蛋白脂质体 GUVs 加入储液池中。持续观察芯片，直至有足够数量的 GUVs 被捕获在芯片内。用移液器吸出多余的 GUV 溶液。然后以每分钟0.1至1微升的流速加入洗涤缓冲液P。最后，用足量的囊泡对捕获点进行定位。在将显微镜参数设置完成后，以每分钟0.5微升的流速向储液池中加入缓冲液R。将干燥的蛋白脂质大单层囊泡（proteo LUVs）在低凝胶化温度的琼脂糖凝胶上重水化，可形成微米级囊泡。收集所得的大单层囊泡（GUVs），并捕获于经β-酪蛋白钝化的微流控装置中。

construction-out-equilibrium-metabolic-networks-nano-micrometer-sized

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

在纳米和微米大小的囊泡中构建失衡代谢网络

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体外在相分离的巨大单层囊泡（GUVs）内重建细胞骨架网络

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构建纳米和微米级囊泡中非平衡代谢网络

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