构建纳米和微米级囊泡中非平衡代谢网络

在荷兰，基础联盟旨在从分子组分构建合成细胞。该联盟由来自分子生物学、化学、物理学和计算科学等领域的研究团队组成。该联盟的目标是创建一种能够自主生长、传递信息并进行分裂的自复制系统。

目前，我们的研究重点是构建分子网络，并将其整合为更复杂的分子系统。合成生物学的最新进展包括设计用于细胞功能的模块，并将其整合成复杂的网络，应用于诊断、治疗、合成免疫学以及自适应材料等领域。这一进展涵盖了欧洲、美洲和亚洲的多个研究团队，他们正在采用自上而下和自下而上的方法，共同推动合成细胞的构建。

本领域的现有技术包括用于构建和优化代谢网络的工程学与进化方法。我们利用人工智能进行分子筛选，并采用先进的生物化学与生物物理技术进行组分分离和网络组装。此外，我们还运用膜重组、物理包埋，以及荧光光谱和显微技术进行可视化分析。

随着模块的整合，膜蛋白和酶的数量大幅增加，这对我们的重建和封装技术提出了更高的要求。在亚微米级囊泡中，随机封装成为一个问题，而当在脂质膜中重建多种膜蛋白时，形成微米级囊泡的效率也会降低。在Corium中，我们已开发出用于ATP生成的代谢网络，并通过底物供给和产物输出维持非平衡状态。

此外，我们将ATP循环与脂质前体的合成和分泌相偶联，使次级囊泡能够产生脂质，这在我们的研究领域中是一项重要进展。开始实验时，将一份脂质体置于室温水浴中，以解冻囊泡。随后用缓冲液A预平衡装有滤器的挤出器。将解冻后的脂质体通过挤出器挤出13次。

将挤出的脂质体收集到塑料管中，尽量减少死体积。随后，用移液器吸取1 mL稀释后的脂质体溶液，加入透明比色皿中。使用分光光度计在540纳米处测量其初始光密度。

向脂质体中加入 50 微升 10% Triton X-100。当溶液达到最大光密度后，用 Triton X-100 滴定，直至光密度达到 60% 饱和度。将去垢剂 destabilized 的囊泡倒回塑料管中。

接下来，将纯化的膜蛋白加入去稳定的脂质体中，直至达到所需的400:1比例。在4°C条件下孵育样品15分钟。然后加入200毫克洗涤并去水的聚苯乙烯珠，以去除去垢剂。

现在将一个空的10毫升重力流层析柱固定在置于冰上的空的6.5毫升超滤离心管上方。将样品倒入重力流层析柱中，并在超滤离心管中收集蛋白脂质体。向珠中加入0.5毫升缓冲液A。

将滤液收集到超速离心管中。接下来将蛋白脂质体放入超速离心机中进行浓缩。弃去上清液后，将沉淀的蛋白脂质体重新悬浮于200 µL缓冲液A中，总体积为200 µL。将最终的蛋白脂质体体积分为三等份。

低浓度的Triton X-100最初导致在540纳米处的吸光度增加。进一步添加则引起囊泡的部分溶解。在我们观察时，脂质体已完全溶解。

首先，将92.7 µL缓冲液A移液至一个空的1.5 mL离心管中。然后依次加入DTT、ADP钠盐、氯化镁、L-鸟氨酸以及酶。轻轻混匀溶液后，将其加入66.6 µL预先制备好的蛋白脂质体上层。

将混合物在液氮中快速冷冻，然后在约10摄氏度的冰水浴中解冻。将包封混合物通过预平衡的滤膜（平衡缓冲液为缓冲液A、DTT、钠盐ADP和L-鸟氨酸）在挤出器中挤出13次，并将挤出液收集至1.5毫升离心管中。为测定ATP的合成，用移液器将缓冲液K、蛋白脂质体和离子载体加入带有小窗口的黑色石英比色皿中。

在荧光分光光度计中将样品预热至30摄氏度。随后获取Percival HR的激发光谱。当探针信号稳定后，加入过量L-精氨酸和甘油以启动代谢网络，并随时间追踪反应进程。向蛋白脂质体中加入L-精氨酸后，Percival HR在500纳米和430纳米激发波长下的荧光强度比值迅速升高。

首先，将剪切过的200微升移液枪头底部插入预制的微流控捕获装置中。使用配备0.2微米滤器的注射器，向芯片的进样储液池中加入400微升β-酪蛋白溶液。将芯片在900 ×g条件下离心6分钟。此时，进样端和出样端的液面高度应保持一致。

在两张载玻片上画出垫片的轮廓。用高氧等离子体清洁载玻片一分钟，使其具有亲水性。将低凝胶温度琼脂糖加至载玻片表面，直至完全覆盖。

然后将载玻片倾斜至90度角，使多余的琼脂糖流到纸巾上。将载玻片置于50摄氏度下30分钟。使用配备一毫米探头的手持探针式超声仪，对制备好的蛋白脂质体进行超声处理。

在重复超声处理五次前，将蛋白脂质体SUV置于冰上保持30秒。使用100微升注射器，将0.5微升的蛋白脂质体SUV液滴加到预先制备的琼脂糖凝胶上。用氮气吹扫约10分钟，使液滴干燥。

使用注射器和针头移液器通过侧面的小孔将溶胀液注入已准备好的腔室中，使囊泡在22摄氏度下溶胀至少30分钟。将腔室在固体表面轻敲，以从凝胶上收集GUVs。为在显微镜下捕获GUVs，将经过钝化处理的微流控芯片安装在显微镜上。

检查无缺陷后，将带弯针的管路连接至储液罐出口。将另一端连接至一个1毫升注射器，然后将注射器安装到最大流速为10 µL/min的泵上。用新鲜培养基替换储液罐中的洗涤缓冲液。

用至少 80 微升缓冲液 P 洗涤。去除多余缓冲液后，将蛋白脂质体 GUVs 加入储液池中。持续观察芯片，直至有足够数量的 GUVs 被捕获在芯片内。用移液器吸出多余的 GUV 溶液。

然后以每分钟0.1至1微升的流速加入洗涤缓冲液P。最后，用足量的囊泡对捕获点进行定位。在将显微镜参数设置完成后，以每分钟0.5微升的流速向储液池中加入缓冲液R。

将干燥的蛋白脂质大单层囊泡（proteo LUVs）在低凝胶化温度的琼脂糖凝胶上重水化，可形成微米级囊泡。收集所得的大单层囊泡（GUVs），并捕获于经β-酪蛋白钝化的微流控装置中。