小鼠脾脏组织来源的外泌体的分离和表征
2024年9月20日
在这里，我们提出了一种使用消化与 I 型胶原酶和超速离心相结合来分离小鼠脾脏衍生的外泌体的方案。
组织来源的外泌体因其能够准确反映组织特异性和微环境而受到越来越多的关注。我们的研究重点是弄清楚脾源性外泌体在心血管疾病中的基本和转化作用。在这项研究中，我们开发了一种从小鼠脾组织中分离外泌体的实用方案，为随后的鉴定分析和功能研究提供了一种可重复的技术。
我们使用 I 型胶原酶进行消化，然后通过差速超速离心过滤，以产生高质量的脾外泌体。与以前的报道相比，使用组织匀浆获得组织悬浮液，我们的方法保留了组织中细胞的膜完整性。这项技术在研究外泌体在免疫反应中的作用可能特别有用。
鉴于脾脏在免疫系统中的关键功能，未来的研究可以将该方案应用于人体组织，从而能够提取临床相关的外泌体用于诊断和治疗目的。首先，将高速和超高速离心机预冷至 4 摄氏度，并将台式摇床的温度设置为 37 摄氏度。准备直径为 100 毫米的细胞培养皿。
然后，布置 50 毫升无菌离心管、冰和直径为 70 微米的无菌细胞过滤器。喷洒 75% 酒精对剪刀和镊子进行消毒，并在高温下加热以进一步消毒。然后，将脾脏组织置于冰上的无菌 100 毫米培养皿中，并用冷的 1X PBS 洗去表面血液。
在称量组织之前，用无菌纱布彻底擦干脾脏。接下来，使用无菌移液管，将 1 毫升 PBS 添加到 70 微米的细胞过滤器中以润湿。最后，用涡旋混合器在 1X PBS 中制备 0.1% I 型胶原酶，以获得消化缓冲液。
首先，准备用于组织处理的试剂和无菌工具。用剪刀将脾组织在冰上的培养皿中切成小块，均匀的小块，然后使用无菌移液管将它们转移到 50 毫升离心管中。然后，根据脾组织的重量将消化缓冲液加入试管中，并在设置为 45 摄氏度的水平振荡器上以 37 度角摇动试管。
当组织块分散并且大部分碎片失去形状时，停止消化。在室温下通过 70 微米的细胞过滤器转移消化的混合物，以去除纤维状和较大的组织碎片。将滤液收集在新的 50 ml 离心管中。
将滤液在 4 摄氏度下以 500 G 离心 10 分钟。然后，将上清液转移到新管中，并以适当的速度重复离心步骤。超速离心后，弃去上清液，用 PBS 洗涤沉淀。
在 4 摄氏度下再次以 120， 000 G 超速离心 2 小时以分离外泌体。最后，将分离的外泌体溶解在每个脾脏 200 微升无菌 PBS 中，并将它们储存在零下 80 摄氏度的 2 毫升离心管中。透射电子显微镜图像显示存在具有脂质双层的杯状囊泡，这是外泌体的特征。
外泌体大小范围为 30 至 150 纳米，峰值浓度为 60 纳米，如尺寸分布图所示。Western blot 分析证实存在外泌体标志物 TSG101 和 CD9，而未检测到 GM130 和阴性对照。
概述
本研究提出了一种从小鼠脾脏组织中分离外泌体的实用协议，这对于理解它们在心血管疾病中的作用至关重要。该方法结合了Ⅰ型胶原酶消化和超速离心，确保了高质量的外泌体产量，同时保持了细胞膜的完整性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 心血管研究
背景
- 组织源外泌体反映了组织特异性和微环境。
- 脾脏源外泌体在免疫反应中发挥作用。
- 理解外泌体功能对心血管疾病研究至关重要。
- 先前的方法可能会损害膜的完整性。
研究目的
- 开发一个可重复的脾脏源外泌体分离协议。
- 促进后续的鉴定分析和功能研究。
- 改善对外泌体在心血管疾病中的作用的理解。
使用的方法
- 使用Ⅰ型胶原酶消化脾脏组织。
- 通过差速超速离心进行过滤。
- 分离高质量外泌体。
- 在整个过程中保持细胞膜的完整性。
主要结果
- 成功分离了脾脏源外泌体。
- 获得适合进一步分析的高质量外泌体。
- 该方法展示了改进的膜完整性保护。
- 在研究免疫反应中的潜在应用。
结论
- 开发的协议对于从小鼠脾脏分离外泌体是有效的。
- 这种技术可以增强对外泌体在心血管疾病中功能的研究。
- 未来的研究可以利用这种方法进行免疫学中的各种应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and characterization of spleen-derived exosomes enables mechanistic de-risking and target validation in immune and cardiovascular disease research. This protocol supports predictive confidence by preserving exosome integrity and ensuring reproducibility across discovery and translational workflows. The method positions tissue-specific exosome analysis as a reusable capability for biomarker and functional studies in biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of exosome-mediated signaling pathways in disease-relevant immune tissues.
- Supports biological de-risking by providing tissue-specific extracellular vesicle profiles.
- Facilitates functional target validation through reproducible exosome isolation and marker confirmation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated exosome samples for downstream quantitative and qualitative assays.
- Standardizes exosome isolation for reproducible biomarker and mechanistic screening.
- Enables scalable workflows for comparative analysis of exosome populations across conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns exosome characterization with disease-relevant immune and cardiovascular models.
- Supports translational biomarker discovery by reflecting tissue microenvironment and specificity.
- Provides continuity from early discovery to preclinical validation of exosome-based hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust exosome isolation for hypothesis testing, biomarker identification, and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on exosome-mediated intercellular communication and immune modulation.
- Screening: Delivers reproducible, marker-validated exosome preparations for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative size distribution and marker expression data for comparative analytics.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by enabling tissue-specific exosome studies relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol adaptable to other tissue types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in exosome research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable exosome isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust biomarker and mechanistic studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of exosome-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue processing, ultracentrifugation, and exosome analytics.
- Needs access to high-speed and ultra-high-speed centrifuges, electron microscopy, and western blot infrastructure.
- Demands cross-team standardization of tissue handling and analytical protocols.
- Adaptation to other tissues may require optimization of digestion and isolation parameters.
- Yield and purity depend on tissue quality and precise execution of protocol steps.
