小鼠脾脏组织来源的外泌体的分离和表征

在这里，我们提出了一种使用消化与 I 型胶原酶和超速离心相结合来分离小鼠脾脏衍生的外泌体的方案。

组织来源的外泌体因其能够准确反映组织特异性和微环境而受到越来越多的关注。我们的研究重点是弄清楚脾源性外泌体在心血管疾病中的基本和转化作用。在这项研究中，我们开发了一种从小鼠脾组织中分离外泌体的实用方案，为随后的鉴定分析和功能研究提供了一种可重复的技术。

我们使用 I 型胶原酶进行消化，然后通过差速超速离心过滤，以产生高质量的脾外泌体。与以前的报道相比，使用组织匀浆获得组织悬浮液，我们的方法保留了组织中细胞的膜完整性。这项技术在研究外泌体在免疫反应中的作用可能特别有用。

鉴于脾脏在免疫系统中的关键功能，未来的研究可以将该方案应用于人体组织，从而能够提取临床相关的外泌体用于诊断和治疗目的。首先，将高速和超高速离心机预冷至 4 摄氏度，并将台式摇床的温度设置为 37 摄氏度。准备直径为 100 毫米的细胞培养皿。

然后，布置 50 毫升无菌离心管、冰和直径为 70 微米的无菌细胞过滤器。喷洒 75% 酒精对剪刀和镊子进行消毒，并在高温下加热以进一步消毒。然后，将脾脏组织置于冰上的无菌 100 毫米培养皿中，并用冷的 1X PBS 洗去表面血液。

在称量组织之前，用无菌纱布彻底擦干脾脏。接下来，使用无菌移液管，将 1 毫升 PBS 添加到 70 微米的细胞过滤器中以润湿。最后，用涡旋混合器在 1X PBS 中制备 0.1% I 型胶原酶，以获得消化缓冲液。

首先，准备用于组织处理的试剂和无菌工具。用剪刀将脾组织在冰上的培养皿中切成小块，均匀的小块，然后使用无菌移液管将它们转移到 50 毫升离心管中。然后，根据脾组织的重量将消化缓冲液加入试管中，并在设置为 45 摄氏度的水平振荡器上以 37 度角摇动试管。

当组织块分散并且大部分碎片失去形状时，停止消化。在室温下通过 70 微米的细胞过滤器转移消化的混合物，以去除纤维状和较大的组织碎片。将滤液收集在新的 50 ml 离心管中。

将滤液在 4 摄氏度下以 500 G 离心 10 分钟。然后，将上清液转移到新管中，并以适当的速度重复离心步骤。超速离心后，弃去上清液，用 PBS 洗涤沉淀。

在 4 摄氏度下再次以 120， 000 G 超速离心 2 小时以分离外泌体。最后，将分离的外泌体溶解在每个脾脏 200 微升无菌 PBS 中，并将它们储存在零下 80 摄氏度的 2 毫升离心管中。透射电子显微镜图像显示存在具有脂质双层的杯状囊泡，这是外泌体的特征。

外泌体大小范围为 30 至 150 纳米，峰值浓度为 60 纳米，如尺寸分布图所示。Western blot 分析证实存在外泌体标志物 TSG101 和 CD9，而未检测到 GM130 和阴性对照。