骨骼肌成纤维细胞外泌体的分离与表征

采用差速离心法进行本实验方案的优势在于，该方法易于扩展至升量级，因此非常适合从原代成纤维细胞中分离外泌体。可从多种疾病模型中分离的不同细胞类型和组织中获取纯化的外泌体。这些外泌体可用作诊断性生物标志物。

示范该操作的是来自d'Azzo实验室的科学家Diantha van de Vlekkert。首先，称量小鼠肌肉，然后将其转移至一个10厘米的培养皿中。在生物安全柜中，使用手术刀将肌肉切碎，制成细小的糊状物。将切碎的肌肉糊状物转移至一个50毫升离心管中，并加入消化液，消化液的体积为每毫克组织的3.5倍。

在37摄氏度下孵育45分钟。为促进完全解离，每隔10分钟用5毫升移液器充分混匀悬液。为灭活消化液，向细胞悬液中加入20毫升完全DMEM培养基。

将细胞悬液通过置于50毫升离心管上的70微米尼龙细胞筛网进行移液，然后用额外的5毫升完全DMEM培养基冲洗细胞筛网。在室温下以300×g离心10分钟，收集细胞。小心吸去上清液，并将沉淀物重悬于10毫升完全DMEM培养基中。

将细胞接种至10厘米培养皿中，然后将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳和3%氧气的培养箱中。骨骼肌成纤维细胞培养需维持在低氧水平，以确保生理性的低氧条件。骨骼肌中的氧浓度约为2.5%。待细胞达到100%汇合后，继续培养一天，随后用PBS洗涤细胞，并加入1毫升胰蛋白酶消化液。

孵育细胞10分钟后，加入10毫升完全DMEM培养基以终止消化。将细胞悬液转移至50毫升离心管中，于室温下以300×g离心10分钟。随后将沉淀重悬于20毫升完全DMEM培养基中，并将细胞接种至15厘米培养皿中。

从培养的成纤维细胞中收集条件培养基至15毫升离心管中。将条件培养基在300g下离心10分钟，以沉淀活细胞。将上清液转移至新的50毫升离心管中，并在2,000g下离心10分钟，沉淀死细胞。

接下来，将上清液转移至一个38.5毫升的聚丙烯管中，在10,000g离心30分钟，以去除细胞器、凋亡小体和膜碎片。为沉淀外泌体，将上清液转移至一个38.5毫升的超净管中，在100,000g下进行超速离心1.5小时。小心弃去上清液，保留约1毫升的条件培养基。

用最多30毫升预冷的PBS洗涤外泌体沉淀并重新悬浮。再次在100,000g离心1.5小时。为完成纯化，用移液器小心吸除上清液，注意不要扰动外泌体沉淀。

外泌体沉淀步骤可能较为松散且容易脱落。因此，应使用200微升移液器小心地去除PBS上清液。每15厘米培养皿的成纤维细胞使用25微升冰冻PBS重悬沉淀。

最后，使用BCA蛋白检测试剂盒和酶标仪在562纳米波长下测定蛋白浓度。该方案是一种高度可重复且稳定的外泌体纯化方法。透射电子显微镜显示这些外泌体具有相对均一的粒径大小。

外泌体裂解物的免疫印迹显示了特征性的蛋白表达模式，并且不存在LDH和钙网蛋白的污染。外泌体通过蔗糖密度梯度离心分离，各个组分经Western印迹检测，使用抗Alix、CD9和CD81的抗体进行探查。外泌体始终沉降于第3至第6组分中。

分离并浓缩的生物活性外泌体可用于电子显微镜和质谱分析，以及体外和体内摄取实验，以进行功能研究。该方案适用于低分泌性细胞中外泌体的分离，可应用于探索外泌体在人类纤维化疾病中的作用。