骨骼肌成纤维细胞外泌体的分离和表征

该方案使用差速离心的优点是它很容易扩展到升，因此非常适合从原代成纤维细胞中分离外泌体。纯化的外泌体可以从从各种疾病模型中分离的不同细胞类型和组织中获得。外泌体可用作诊断生物标志物。

演示该程序将是 d'Azzo 实验室的科学家 Diantha van de Vlekkert首先，称量小鼠肌肉，然后将它们转移到一个 10 厘米的培养皿中。在生物安全罩下工作，用手术刀将肌肉切碎，制成细腻的糊状物。将切碎的肌肉糊转移到 50 毫升的试管中，并使用每毫克组织体积的 3.5 倍加入消化液。

在 45 摄氏度下孵育 37 分钟。为了帮助完全解离，每 10 分钟用 5 毫升移液器充分混合悬浮液。要灭活消化溶液，请向细胞悬液中加入 20 毫升 DMEM Complete。

移液通过放置在 50 mL 试管上的 70 微米尼龙细胞过滤器，然后用另外 5 mL DMEM Complete 清洗细胞过滤器。在室温下以 300 g 离心细胞悬液 10 分钟。小心去除上清液，并将沉淀重新悬浮在 10 ml DMEM Complete 中。

将细胞接种到 10 厘米的培养皿中，然后将培养皿放入 37 摄氏度、5% 二氧化碳和 3% 氧气的培养箱中。骨骼肌成纤维细胞培养物需要保持在低氧水平，以确保生理光照条件。骨骼肌中的氧含量约为 2.5%细胞达到 100% 汇合后，再培养一天，然后用 PBS 冲洗并加入 1 毫升胰蛋白酶消化液。

将细胞孵育 10 分钟后，加入 10 mL DMEM Complete 以终止胰蛋白酶消化。将细胞悬液转移至 50 mL 试管中，然后在室温下以 300 g 离心细胞 10 分钟。然后将沉淀重悬于 20 mL DMEM complete 中，并将细胞接种到 15 厘米的培养皿中。

从 15 毫升试管中培养的成纤维细胞中收集条件培养基。将条件培养基以 300 g 离心 10 分钟，以沉淀活细胞。将上清液转移到新的 50 mL 试管中，并以 2， 000 g 离心试管 10 分钟，使死细胞沉淀。

接下来，将上清液转移到 38.5 毫升聚丙烯管中，并以 10， 000g 离心管 30 分钟，以去除细胞器、凋亡小体和膜碎片。为了沉淀外泌体，将上清液转移到 38.5 毫升超清管中，并以 100， 000g 超速离心 1.5 小时。小心丢弃上清液，留下大约 1 毫升的条件培养基。

洗涤外泌体沉淀并将其重新悬浮在最多 30 毫升冰冷的 PBS 中。再次以 100， 000g 离心外泌体 1.5 小时。为了完成纯化，通过移液去除上清液，注意不要干扰外泌体沉淀。

外泌体沉淀步骤可以是松散的，很容易分离。因此，应在 200 微升移液器的帮助下非常小心地去除 PBS 上清液。将沉淀重悬于冰冷的 PBS 中，每 15 厘米成纤维细胞培养皿使用 25 微升。

最后，使用 BCA 蛋白检测试剂盒和酶标仪在 562 纳米处测量蛋白质浓度。该方案是一种高度可重复且一致的外泌体纯化方法。透射电子显微镜显示这些外泌体的大小相对均匀。

外泌体裂解物的免疫印迹显示蛋白质表达的经典模式，并且不存在 LDH 和钙联蛋白污染物。通过蔗糖密度梯度分离外泌体，并在蛋白质印迹上用抗 Alix、CD9 和 CD81 的抗体探测各个组分。外泌体始终以 3 到 6 级分沉淀。

分离和浓缩的生物活性外泌体可用于电子显微镜和质谱分析，以及用于功能研究的体外和体内摄取实验。该方案适用于从低分泌细胞中分离外泌体，可用于探索外泌体在人类纤维化疾病中的参与。