Name: 对赫斯特的分离与表征低 CD45负小鼠肺间质干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 55 s
Description: 了解小鼠肺间充质干细胞的分离与表征方法，利用流式细胞术分选CD45阴性细胞群体。该技术可应用于肺纤维化、肺动脉高压及慢性阻塞性肺疾病等肺部疾病的研究，为组织修复与再生医学提供重要实验基础。

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本研究获得了对 SMM 的资助：AHA GIA0855953G，NIH 1R01 HL091105-01。额外支持来自：DW：NIH RO1DK075013、DDK 以及 Kleberg 基金会；UCCC 流式细胞术核心（NIH 5 P30 CA 46934-15），UCCC 基因芯片核心（NCI P30 CA 46934-14）。

1. 肺组织分离
<ol>
<li>使用过量异氟烷处死成年小鼠（8-10 周龄；18-20 g；C57Bl6J），随后采用无菌技术放血致死。不同品系间表型略有差异。</li>
<li>手术取出膈肌，通过在小鼠两侧肋骨侧面剪开以暴露胸腔。经右心室轻柔灌注 3–5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS），以冲洗肺部血液。</li>
<li>解剖分离肺叶，去除气管和大支气管，置于盛有Hanks平衡盐溶液（HBSS）的培养皿中。收集全部肺叶后，使用镊子将组织转移至培养皿盖上。用一次性手术刀片将组织切碎成细小碎片，加入适量液体以保持湿润，但避免过多导致组织漂浮移动。</li>
<li>解剖其中一只小鼠的后肢，分离骨髓，作为染色对照用于设定流式细胞术的设门参数。骨髓（BM）染色操作按先前所述方法进行1。</li>
</ol>
2. 从肺组织制备单细胞悬液
<ol>
<li>每个肺组织使用优化的组织重量与体积比（0.2 g : 5 ml）进行消化，即在无菌HBSS中溶解预热的0.2% Worthington II型胶原酶（Worthington Biochemicals, Lakewood, NJ; 货号 # LS004202）。将混合物置于37°C水浴中孵育30分钟2,3。</li>
<li>充分吹打样本，直至肺组织消化液能轻松通过10 ml移液器（约重复10次）。随后在37°C下继续孵育15分钟，以完成组织消化，并获得更均匀的单细胞悬液。</li>
<li>用HBSS稀释肺细胞悬液，并使用5 ml移液器吹打，以分散残留的组织碎片。</li>
<li>使用70 μm细胞筛过滤悬液，去除未消化的组织碎片。此时可将样本分装至多个锥形管中，以避免单个细胞筛过载，并缩短过滤时间。</li>
<li>在1500 rpm下离心10分钟，沉淀细胞悬液，并弃去上清液。</li>
<li>用室温红细胞裂解缓冲液（eBiosciences, San Diego, CA; 货号 # 00-4333-57）轻柔重悬细胞沉淀，在室温下孵育5分钟。加入等体积的HBSS以终止裂解反应，并使用40 μm细胞筛过滤细胞悬液，去除碎片和细胞聚集体。</li>
<li>取10 μl待染色的各样本，使用血细胞计数板对肺组织和骨髓（BM）样本的细胞数量进行计数。注意：记录细胞的总体积。</li>
<li>将肺组织单细胞悬液在1500 rpm下离心10分钟，沉淀细胞。</li>
<li>将肺组织和骨髓细胞均以1×106 个细胞/ml的浓度重悬于预热（37°C）的DMEM+培养基中（DMEM高糖培养基，含2%胎牛血清（FBS）和10 mM HEPES；Gibco, Carlsbad, CA; 货号 # 11965-092）。</li>
<li>将Hoechst 33342染料（Sigma Chemical Company, St. Louis, MO; 货号 # B2261）以水配制为1 mg/ml的储存液，并过滤除菌1,4。Hoechst染料可分装后保存于-80°C。</li>
<li>将Hoechst 33342染料加入单细胞悬液中，使其终浓度为5 μg/ml（即1 mg/ml储存液的200倍稀释）。</li>
<li>轻柔颠倒混匀细胞，置于37°C水浴中准确孵育90分钟。</li>
</ol>
3. 肺细胞悬液的染色与流式细胞术分析前处理
<ol>
<li>90 分钟后，所有使用 Hoechst 染色肺细胞的操作步骤必须在 4°C 或冰上进行，以防止染料外排。在 4°C 条件下以 1500 rpm 离心 10 分钟收集细胞，并用预冷的染色缓冲液（PBS + 2% FBS）重悬细胞。</li>
<li>将细胞重悬于含 2% FBS 和 10 mM HEPES 的 PBS 中，浓度不超过 1×107 个细胞/管，每管体积为 300–600 μl。</li>
<li>向肺组织和骨髓样本中加入适当滴定浓度的 CD45 抗体（通常为 CD45-APC（BD Pharmingen, San Diego, CA; cat # 559864）按 1:200 稀释）。冰上孵育 10–15 分钟。实验过程中设置未染色对照有助于设定分析门控。</li>
<li>在 4°C 条件下以 1500 rpm 离心 5 分钟收集细胞。弃去上清液，将细胞重悬于 500 μl 预冷的染色缓冲液（PBS + 2% FBS）中，转移至预冷的 snap cap 聚丙烯管（Fisherbrand, Schaumburg, IL; cat # 14-956-1D）中。</li>
<li>向样本中加入碘化丙啶（PI，PBS 中 200 μg/ml 储存液），使其终浓度为 2 μg/ml，用于排除死细胞。PI 必须与 Hoechst 33342 染料联合使用，才能在流式细胞术分析中获得正确的荧光图谱。</li>
<li>将样品管置于冰上避光保存，直至进行流式细胞术分析。</li>
</ol>
4. 利用Hoechst染料外排检测侧群细胞（SP）通过流式细胞术分析定义并分离肺部间充质干细胞（lung MSC）群体
<ol>
<li>本实验对仪器有以下要求：
 <ul>
 <li>488 nm 和紫外光（350-355 nm）激光器</li>
 <li>紫外激光光路配备两个检测器，分别带有蓝色（450/65）和红色（675/50）滤光片</li>
 <li>紫外光红色检测器必须对红色信号具有高灵敏度。这一点在较老型号的细胞分选仪上可能存在问题</li>
 <li>配备制冷装置，以维持样本温度在 5-10°C</li>
 </ul>
</li>
<li>根据制造商的操作说明，校准激光并设置细胞分选参数</li>
<li>使用线性刻度采集红（x轴）和蓝（y轴）Hoechst 荧光信号</li>
<li>调节光电倍增管电压，使 G0/G1 期细胞峰位于图中右上方中心位置，以便充分显示拖尾的细胞亚群。细胞周期中的部分 S 期及全部 G2 期细胞可能超出图右上方范围。蓝色信号相对较亮，而红色信号较弱。以 MoFlo XDP（Beckman Coulter, Miami, FL）为例，蓝色通道典型电压为 425，红色通道为 650</li>
<li>使用碘化丙啶（PI）设门排除死细胞。可采用标准 PI 检测通路（激发波长 488 nm，发射波长 630 nm）。或者，PI 也可由紫外激光激发，此时死细胞群体会出现在侧群（SP）图右侧超出量程的位置。这种方法避免了对其他荧光染料（如 FITC 和 PE）进行 PI 信号补偿的需要。原始 Goodell 方法即采用后者方案5-7</li>
<li>在分析和分选过程中保持相对较低的压力差，以确保侧群细胞的分辨清晰</li>
<li>侧群表现为肺细胞主群体之外的一个侧向亚群，该群体被称为 Hoechstlow</li>
<li>通过直方图分析 Hoechstlow/SP 群体，以区分 CD45 阳性和阴性细胞群2,3（图 1）</li>
<li>在选定并设门 HoechstlowCD45neg 肺间充质干细胞（MSC）群体后，可通过分选将细胞收集至离心管中作为混合群体，或分选至 96 孔板中以分离单细胞克隆3</li>
<li>进行板式分选时，应将分选液流偏转角度调整为 25%，以获得比常规管式分选更垂直的液流</li>
<li>通过向 96 孔板的左上角和右下角孔发送测试液流脉冲，校准分选液流位置</li>
<li>设置分选仪软件中的板图，以将目标数量的细胞沉积至各孔中</li>
<li>为分离单细胞克隆，将单个肺间充质干细胞分选至含有 150 μL 培养基（α-MEM 添加 20% FBS）的 96 孔板孔中。分选完成后，再向每孔添加 100 μL 培养基</li>
</ol>
5. 肺部间充质干细胞及其克隆的分离、培养与表征
<ol>
<li>采用标准培养条件（37°C、5% CO2 和 >95% 湿度），对分选后获得的混合肺间充质基质细胞（MSC）群体及其单细胞克隆进行培养与扩增。细胞分离后需孵育16小时以促进贴壁。每48小时更换一次培养基（α-MEM 添加 20% 胎牛血清）。当细胞增殖加快并达到75–80%融合度时进行传代（图2）。</li>
<li>用预热的HBSS洗涤细胞，并在37°C下用0.5%胰蛋白酶/EDTA（Cellgro, Manassas, VA; 货号 # 25-053-Cl）孵育少于2分钟。通过倒置显微镜观察，确认形成单细胞悬液。</li>
<li>根据当前培养物的增殖速率，将肺MSC以1:2或1:3的比例进行分瓶传代。</li>
<li>对每一批细胞制备物，评估其向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞等经典间充质谱系分化的能力，以及其细胞表面是否表达公认的间充质细胞标志物。同时进行细胞遗传学带型分析，以确认不存在明显的染色体异常2,3,8-11。</li>
</ol>
6. 采用集落形成实验（CFU-F）对肺部间充质干细胞进行计数
<ol>
<li>将细胞用完全 MesenCult 培养基（Stem Cell Technologies，温哥华，BC）稀释至终浓度为 1×106 个细胞/mL。</li>
<li>进行系列稀释，使 10 mL 培养基中 100 mm 培养皿的终细胞浓度分别为 6×104 个细胞、3×104 个细胞、1.5×104 个细胞和 0.75×104 个细胞。每种细胞浓度设两个或三个重复，可根据培养表面积按比例调整。</li>
<li>在标准条件下培养细胞 10 天。第 10 天用 PBS 洗涤细胞，并在室温下用 100% 甲醇固定 5 分钟。</li>
<li>用 0.4% w/v 吉姆萨染色液（Sigma Chemical Co，圣路易斯，MO）以去离子水 1:20 稀释后染色，以检测 CFU-F 克隆。样品自然晾干后，计数每个克隆中细胞数大于 25 的克隆数量（图 3）。</li>
</ol>
7. 肺间充质干细胞对T细胞增殖和凋亡的免疫调节特性分析
<ol>
<li>6.25×104 每孔接种肺间充质干细胞至96孔板，过夜静置培养 2.</li>
<li>CD4+ 从识别卵清蛋白323-339肽段的OT-II T细胞受体（TCR）转基因小鼠的脾脏中分离细胞，通过去除CD8细胞进行纯化+，CD19+，MHC-II+ 和 CD25+ 使用 Miltenyi AutoMACS 细胞分选仪（Miltenyi，Auburn，CA）对细胞进行分选。通过正向分选 MHC-II 分子富集抗原提呈细胞（APC）。+ 细胞 12.</li>
<li>APC 用 4% 多聚甲醛固定，在 PBS/5% BSA/2 mM EDTA 中洗涤 3 次，并加载 0.5μg/ml 或 5μg/ml OVA323 肽段</li>
<li>将模拟的、生长停滞的 APC 加入96孔板中的肺部 MSC。</li>
<li>纯度大于 95% 的 CD4+ 1x105 细胞用……进行标记 5μM 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE；Sigma，St. Louis MO）溶于PBS中，避光孵育5分钟，用PBS-5% BSA洗涤，然后加入含DMEM 5% FBS培养基的APC和肺MSC细胞中。细胞随后孵育96小时。</li>
<li>T细胞随后用抗CD40（Cy5）、CD4（APC-Cy7）、CD8（ViolBlue）和Vbeta 5（PE）抗体染色，并使用Miltenyi MacsQuant 7色流式细胞仪（Miltenyi，Aurburn，CA）及FloJo分析软件（Treestar，Ashland，OR）进行检测。增殖情况通过CFSE平均荧光强度相对于未暴露于抗原呈递细胞（APC）的CFSE标记T细胞背景值的下降程度来衡量（图4）。同时计数T细胞，并通过台盼蓝排斥法评估细胞活力。 </li>
</ol>
8. 代表性结果：
<img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig1.jpg" alt="流式细胞术分析图表，展示细胞群体分化及CD45表达水平。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 流式细胞术分析与肺源MSC的定义。肺组织消化后的单细胞悬液用Hoechst 33342染色，并通过流式细胞术分析其在A. 前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）以及B. Hoechst蓝色与红色荧光上的差异。图中门控区域可见侧群（SP）细胞的存在。进一步对Hoechstlow的SP细胞进行分析，以分离出C. CD45阴性的肺源MSC群体。肺SP中CD45阳性与阴性细胞的比例通常为70:30 / 60:40。
<img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig2.jpg" alt="显微镜图像中的细胞培养比较；A：分离的细胞，B：成纤维细胞网络形成。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 肺间充质干细胞的分离与培养。通过细胞分选获得肺间充质干细胞后，将细胞接种于30 mm培养皿中，使用添加20% FBS的α-MEM培养基进行培养。A. 新分选的细胞呈小而圆且透亮。 B. 培养约2-3周后，出现具有间充质样表型的克隆集落，增殖现象更加明显。
<img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig3.jpg" alt="细胞培养分析；显微镜图像；培养皿，细胞克隆生长，用于测量的比例尺。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 通过成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）实验对间充质干细胞（MSC）进行计数。 扩增后的肺源性MSC按照所述CFU-F实验方案接种。 A. 培养10天后，经吉姆萨染色可见明显克隆。 B. 克隆较大，由数百个细胞组成。 C. 细胞呈现间充质表型。 A &amp; B，比例尺 = 0.5 cm；C，比例尺 = 0.14 cm。
<img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig4.jpg" alt="流式细胞术分析、散点图、T细胞、抗原呈递细胞、肺间充质干细胞影响、CFSE与CD40表达示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 4"> 图4. 基于CFSE的T细胞增殖实验。在无肺间充质干细胞存在、但有抗原呈递细胞（APC）存在且添加或不添加卵清蛋白（OVA）的条件下，CD40阳性效应T细胞的CFSE荧光强度降低，表明细胞发生增殖（红色圆圈）。T细胞膜上的CFSE荧光强度在每次细胞分裂时均按化学计量比例下降，即每次分裂后荧光强度减半。而在存在肺间充质干细胞、抗原呈递细胞（APC）及添加或不添加OVA的条件下，CD40阳性效应T细胞的CFSE荧光强度无明显变化，表明细胞未发生显著增殖（红色圆圈）。

<ol><li>Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).</li>
<li>Jun, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pathology+of+Bleomycin+Induced+Fibrosis+is+Associated+with+Loss+of+Resident+Lung+Mesenchymal+Stem+Cells+Which+Regulate+Effector+T-Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS%22%5BJournal%5D)">The Pathology of Bleomycin Induced Fibrosis is Associated with Loss of Resident Lung Mesenchymal Stem Cells Which Regulate Effector T-Cell Proliferation.</a> STEM CELLS. , (2011).</li>
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<li>Majka, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+progenitor+populations+in+skeletal+muscle+are+bone+marrow+derived+and+exhibit+different+cell+fates+during+vascular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Distinct progenitor populations in skeletal muscle are bone marrow derived and exhibit different cell fates during vascular regeneration.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111, 71-79 (2003).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突。

我们改进了一种最初用于鉴定骨髓造血细胞的方法，以分离小鼠肺组织中特定的常驻肺间充质干细胞（MSC）群体。由于该分离方法具有良好的可重复性，所获细胞被充分鉴定为MSC。这些细胞的来源被确定为成年小鼠肺组织常驻细胞（而非骨髓来源），并已对其表型和分子特征进行了系统描述。 2能够反复分离出这一特征明确的细胞群体，使得进一步研究肺部间充质干细胞在组织稳态与疾病中的生物学意义和作用成为可能。该细胞群体的最新定义 体内 在小鼠和人类肺组织中，促进内源性细胞的修复策略有助于在肺损伤和疾病期间实现肺组织修复。

<table><tbody><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>Hanks 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30588.01</td><td></td></tr><tr><td>0.2% Worthington II 型胶原酶</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004202</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342 染料</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>CD45-APC</td><td>BD Biosciences</td><td>559864</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81845</td><td></td></tr><tr><td>a-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30265.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-069</td><td></td></tr><tr><td>0.5% 胰蛋白酶/EDTA</td><td>Cellgro</td><td>25-053-Cl</td><td></td></tr><tr><td>完全 MesenCult 培养基</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05511</td><td></td></tr><tr><td>0.4% w/v 吉姆萨染色液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GS1L</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>将16%多聚甲醛用PBS稀释至4%</td></tr><tr><td>羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21888</td><td></td></tr></tbody></table>

分离 &amp;#38; hoechst 染料的表征低 cd45阴性 小鼠肺间充质干细胞

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

组织驻留的间充质干细胞（MSC）是组织修复或再生、纤维化、炎症、血管生成以及肿瘤形成的重要调节因子。综合这些研究结果表明，肺组织驻留的MSC在肺组织稳态、损伤及修复过程中发挥作用，例如在肺纤维化（PF）和肺动脉高压（PAH）等疾病中。本文描述了一种用于定义肺组织驻留MSC群体的技术。该群体的界定 体内 利用一组明确的标记物对肺组织进行分析，可通过流式细胞术重复分离出特征明确的干细胞群体，并用于特定细胞类型及其功能的研究。

本文中，我们展示了从小鼠肺组织中分离常驻肺间充质干细胞（肺MSC）、扩增、鉴定及其免疫调节特性的分析方法。

分离 &amp;#38; Hoechst 染料的表征低 CD45阴性 小鼠肺间充质干细胞

组织驻留型间充质干细胞（MSC）是组织修复或再生、纤维化、炎症、血管生成和肿瘤发生等过程的重要调控因子。

本视频演示了一种分离宿主低 CD45 阴性肺间充质干细胞的实验方案。组织驻留间充质干细胞（MSCs）是组织修复或再生、纤维化、炎症以及血管生成的重要调控细胞。首先，从处死的小鼠中解剖取出肺组织。肺组织经消化处理以获得单细胞悬液。细胞使用鬼笔环肽（hoax dye）和CD45进行染色，并通过流式细胞术分选，以获得宿主CD45阴性的肺间充质干细胞（MSCs）。随后在体外培养扩增肺MSCs，并进行集落形成实验，以评估MSC的分化能力。随后可开展进一步研究，以探讨间充质干细胞（MSCs）在组织稳态及疾病中的作用。本文所示方法可用于分离小鼠或人肺来源的间充质干细胞，并可应用于肺纤维化、肺动脉高压和慢性阻塞性肺疾病（COPD）等肺部疾病的研究。通常，初次接触该方法的研究者可能会面临困难，原因在于组织制备方法多样，且流式细胞仪的设置、适当对照的建立以及数据分析均具有挑战性。由于仅用文字难以准确描述用于获取高细胞活力的肺组织的切碎与消化的正确技术，因此本方法的可视化演示至关重要。此外，流式细胞仪的仪器设置与数据分析也以演示方式传达最为有效。本实验方案首先取出已处死的成年小鼠用于获取间充质干细胞的肺组织。使用一把小型锋利的剪刀，在小鼠两侧肋骨外侧横向剪开肋骨。打开胸腔，然后移除膈肌。将一支10毫升注射器（配20.5号针头）插入右心室，轻轻推动针栓，用3至5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）灌注，以冲洗肺部中的血液。接下来，使用剪刀剪断气管和大的支气管并弃去。然后用镊子夹起白色的小肺叶，放入盛有Hank's平衡盐溶液（Hank's buffered saline）或HBSS的培养皿中。然后取出心脏并分离肺叶。对研究中的所有小鼠重复此操作。将肺叶转移至培养皿的盖子中。用适量的HBSS润湿组织，以防止其干燥。然后使用一次性手术刀切碎肺叶，以获得骨髓，用于流式细胞术的维持对照。使用一把锋利的剪刀在股骨的踝关节和顶端处进行剪切。将肢体放入一个新的培养皿中。然后切除膝关节，保留一段股骨，以及另一段包含胫骨和腓骨的组织。使用镊子剥离肌肉，暴露出胫骨、腓骨和股骨。现在取一个5 mL注射器，配26½号针头，将针头插入骨髓腔开口处。握住胫骨的一端，使另一端朝向一个装有15 mL HBSS的50 mL锥形管，推动注射器活塞，注入HBSS以冲洗骨髓至管中。用腓骨和股骨重复此操作。用终浓度为每毫升五微克的宿主3 3 3 4 2染料，在添加了高糖的DMEM中对骨髓进行染色。接下来，将从分离的肺组织制备单细胞悬液。将每份肺组织置于含有预热的0.2% Worthington的离心管中。在无菌 HBSS 中配制 II 型胶原酶，然后将试管浸入 37 °C 水浴中孵育 30 分钟。孵育结束后，用 10 毫升移液管反复吹打样本，直至消化液能顺畅通过移液管。重复吹打约 10 次后，于 37 °C 再继续孵育 15 分钟，以完成组织消化。消化完成后，用HBSS稀释细胞悬液，并使用5毫升移液管再次反复吹打以分散任何残留的组织碎片。接下来，为去除未消化的组织碎片，将悬液通过70 µm细胞滤网倒入50 mL锥形管中。每次加入少量悬液，以便样品顺利通过细胞滤网。如果未消化的组织碎片完全阻塞了细胞悬液的流动，将其倒入新的细胞滤网中，过滤至新的离心管内。在450 RCF条件下离心10分钟，收集细胞沉淀。离心后，弃去上清液，并在室温下用红细胞裂解缓冲液轻轻重悬细胞沉淀，室温孵育5分钟。然后加入等体积的HBSS以中和裂解缓冲液。将细胞悬液倒入40微米细胞滤器中，以去除碎片和细胞聚集体，并用新的50毫升锥形管收集滤过液。接着，使用血细胞计数板对肺和骨髓样本的细胞数量进行测定。记录细胞悬液的浓度及总体积。然后以450 RCF离心10分钟，沉淀单肺细胞悬液。为维持细胞活性，需同时重悬肺组织和骨髓细胞，以每毫升含10⁶个细胞的浓度置于预温的高糖DMEM完全培养基中。为了染色DNA，将HOAXED 3 3 3 4 2染料加入至终浓度为每升5微克。接着，通过轻柔颠倒混匀细胞，并在37摄氏度水浴中准确孵育90分钟。孵育结束后，在4摄氏度条件下以450 ×g离心10分钟。使用抗CD45抗体和碘化丙啶对肺组织和骨髓组织进行染色，为流式细胞术分析做准备。细胞染色完成后，将样品管置于冰上避光保存，直至进行流式细胞术分析。进行流式细胞术前，需确保仪器激光已校准，并已设置为细胞分选模式。所使用的仪器必须配备蓝色488纳米、红色635纳米以及紫外350至355纳米激光器，并在紫外激光光路中配置两个检测器，分别带有蓝色45/65和红色675/50滤光片。此外，紫外-红色检测器必须对红色信号具有高灵敏度，且仪器须配备制冷装置，以将样品温度维持在10摄氏度。在仪器软件中，设置直方图以显示线性前向散射与侧向散射的关系，以及适用于该仪器的双联体 discrimination 图。使用对数信号的 PI 直方图，使用线性信号的红色对蓝色散点图，以及使用对数信号的 CD45 APC 直方图。仪器准备就绪后，将染色的骨髓样本放入仪器的上样口。该样本用作染色和仪器设置的对照。开始采集事件并调整前向散射的线性信号。为了清晰地观察细胞群体，细胞应大致位于以散射光为x轴的散点图的下中心区域。由于核染料PI具有膜不通透性，因此会被活细胞排除在外。在PI直方图中PI阳性死细胞上绘制一个门控区域。指示仪器软件对死细胞进行着色，在此门控中将其设为红色。使用颜色标记的死细胞作为导航工具，有助于识别宿主的G₀/G₁期细胞群。PI染色也可被紫外激光激发，大多数死细胞的信号应超出量程。在红色与蓝色鬼红荧光散点图的右侧，骨髓细胞的G₀/G₁期细胞群应在红色与蓝色鬼红荧光图中呈现为一个紧密的事件聚集簇。调节检测器电压，使细胞周期的G零G一期细胞簇位于图中右上方中央位置。S期的一部分以及整个G二期可能超出量程。在红色对蓝色的假象图右上方，可见侧群细胞（side population）的低信号从G零G一期细胞簇的左侧向下延伸至图的左下角。现在在FSC与SSC图中对细胞簇绘制门控。绘制在双峰图中识别出的单细胞群体以及PI直方图中的活细胞。然后设置伪图仅显示这些已设门的群体。在圈选宿主细胞群后，围绕侧群细胞绘制一个区域。将此区域作为门控设在CD45 APC直方图上，并结合光散射单细胞门和活细胞门。系统设置完成后，从上样口取出样本，将肺组织样本放入上样口。该样本无需再次调整仪器设置。开始在红色与蓝色假象图上收集事件。肺组织样本的G零G一簇通常在x轴方向上显得更为细长，类似于键盘上的波浪符（~）。侧群细胞的门控位置应与骨髓样本设定的位置相似。可能需要进行微调上下位置，以确保侧群细胞得到清晰的分辨。分选过程中应保持较低的压力差，确保样品流速阀门不要开启过大。接下来，为了分离间充质干细胞（MSC），将一个96孔收集板放入分选室中，并在CD45 APC直方图上设置分选门，以区分阳性与阴性细胞群。最后，将细胞收集为混合细胞群至离心管中，或以单细胞方式收集至96孔板中用于克隆分离。在通过细胞分选获得肺部MSC后，将细胞接种于30毫米培养皿中，使用添加20%胎牛血清（FBS）的α-MEM培养基进行培养。首先，分选后的细胞在培养约两到三周后呈现体积小、圆形且折光性强的形态。具有间充质表型的克隆变得明显，且每种细胞制备物的增殖更为显著。评估肺部间充质干细胞（MSC）向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞等传统间充质谱系分化的能力，以及其对公认间充质标志物的细胞表面表达。进行细胞遗传学核型分析，以确认不存在明显的染色体异常。通过流式细胞术分离并获得单细胞克隆后，进行集落形成实验以表征间充质干细胞（MSC）及其分化能力。实验起始时，将细胞稀释至每毫升3 × 10⁴个细胞。在100毫米培养皿中加入不完全培养基，进行系列稀释，分别为每皿2 × 6 × 10⁴、3 × 10⁴、1.5 × 10⁴和0.75 × 10⁴个细胞，每种条件设三个重复，每皿加入10毫升培养基。培养10天后，将培养板放入培养箱中，倒掉培养基，并用PBS冲洗细胞。然后在室温下加入100%甲醇固定5分钟。5分钟后，倒掉甲醇。然后，为了检测集落形成，将0.4%（重量/体积）的gza用去离子水按1:20稀释后加入，孵育10至15分钟。随后倒去染色液，用去离子水冲洗。让样品自然风干，并使用倒置显微镜或可视化方法对每个集落中细胞数超过25个的集落进行计数。菌落较大，由数百个细胞组成，如图所示，并呈现间充质样表型。间充质干细胞（MSC）的分离方法如本视频所示，并接种于96孔板中进行模拟生长。随后将CFSE标记并处于生长阻滞状态的抗原呈递细胞加入肺来源的MSC中。通过比较CFSE平均荧光强度相对于背景的下降程度来测定分离的MSCs的增殖情况，其中背景为仅标记CFSE的T细胞（如本图所示），在无肺部干细胞、但存在抗原呈递细胞的情况下，A PC加减O型白蛋白CD40阳性效应T细胞显示出CFSE荧光强度降低（以红色圈出），表明发生了增殖。T细胞膜上的CFSE荧光强度在每次细胞分裂时均等减半；在存在肺部M-S-C-A-P-C加减OVA的情况下，CD40阳性效应T细胞的CFSE荧光强度未发生显著变化，表明缺乏增殖。该技术为肺干细胞生物学领域的研究人员探索间充质干细胞在肺动脉高压和肺纤维化等肺部疾病中的作用奠定了基础。掌握此技术后，按照本方案操作，大约可在五小时内完成。还可进行其他方法，如分化检测，以回答更多问题，包括推测的肺间充质干细胞是否具有向骨、脂肪和软骨等多谱系分化的潜能。

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