对赫斯特的分离与表征^低 CD45^负小鼠肺间质干细胞

该视频演示了分离宿主低 CD 45 阴性肺间充质干细胞的方案。组织共振间充质干细胞或 MSC 是组织修复或再生、纤维化、炎症和血管生成的重要调节因子。首先，从处死的小鼠身上解剖肺部。

消化肺组织以获得单细胞悬液。用恶作剧模具和 CD 45 对细胞进行染色，并通过流式细胞术分选以获得低宿主 CD 45 阴性肺 MSC。然后在培养物中扩增肺 MSC，并进行集落形成测定以评估 MSC 分化能力。

然后可以进行进一步的研究以检查 MSC 在组织稳态和疾病中的作用。我们在这里展示的方法可用于分离小鼠或人肺间充质干细胞，并可应用于肺纤维化、肺动脉高压和 COPD 等肺部疾病的研究。通常，由于可用于组织制备的方法多种多样，以及流式细胞仪设置适当的对照和分析，不熟悉这种方法的人会遇到困难。

这种方法的视觉演示至关重要，因为仅用文字很难描述切碎和消化肺组织以实现细胞最佳活力的正确技术。此外，流式细胞术仪器的设置和分析最好通过演示进行交流。通过去除将用于从处死的成年小鼠获得间充质干细胞的肺来开始此协议。

使用一把小锋利的剪刀横向剪断鼠标两侧的胸腔。打开胸腔，然后取出隔膜。将带有 20.1 号半针头的 10 毫升注射器插入右心室，轻轻按下柱塞，使其注入 3 至 5 毫升 PBS，冲洗肺部血液。

接下来，用剪刀剪掉气管和大支气管并丢弃它们。然后使用镊子。拿起小的白色肺叶，将它们放入装满汉克缓冲盐水或 HBSS 的培养皿中。

然后切除心脏并分离肺叶。对研究中的所有小鼠重复此过程。将肺叶转移到培养皿的盖子上。

用足够的 HBSS 润湿组织，以防止它们变干。然后使用一次性手术刀，将肺叶切碎以获得骨髓，以使用维持对照进行流式细胞术。用一把锋利的剪刀剪断脚踝和股骨顶部。

将肢体放入新的培养皿中。然后切掉膝盖，留下一条线性股骨和另一块包含胫骨和腓骨。使用镊子拉出肌肉，露出胫骨、腓骨和股骨。

现在取一个带有 26 号半针头的 5 毫升注射器，将针头插入骨髓开口。在胫骨的一端，握住骨头，另一端指向装满 50 毫升 HBSS 的 15 毫升锥形管中，然后按压柱塞以分配 HBSS 并将骨髓冲洗到管中。对腓骨和股骨重复此过程。

在补充的高葡萄糖 DMEM 中，用宿主 3 3 3 4 2 死亡，终浓度为 5 μg/mL。接下来，将从分离的组织生成肺组织的单细胞悬液。将每个肺放入含有 prewarm.0.2%Worthington 的试管中。

2 型胶原酶 在无菌 HBSS 中制备，然后将试管浸入 37 摄氏度的水浴中并孵育 30 分钟。孵育后，使用 10 mL 移液器研磨样品，直到消化液轻松流过移液器。大约 10 次重复再孵育 15 分钟，在 37 摄氏度下完成组织消化。

消化完成后，用 HBSS 稀释细胞悬液，并使用 5 毫升移液器再次 tri 以分散任何残留的组织碎片。接下来，为了去除未消化的组织碎片，将悬浮液通过 70 微摩尔的细胞过滤器倒入 50 毫升锥形管中。一次加入一点悬浮液，让样品流过细胞过滤器。

如果未消化的组织片段完全阻塞细胞悬液的流动。通过新的细胞过滤器倒入新试管中。在 450 RCF 下将细胞悬液沉淀 10 分钟。

离心后，倒出上清液，并在室温下轻轻重悬细胞沉淀。红细胞裂解缓冲液，在室温下孵育 5 分钟。然后加入等体积的 HBSS 以灭活裂解缓冲液。

将细胞悬液倒入 40 微摩尔细胞过滤器中，以去除碎片和细胞聚集体，将流过的液流收集在新的 50 毫升锥形管中。接下来，使用血细胞仪确定肺和骨髓样本的细胞数量。记录细胞悬液的浓度和总体积。

然后通过在 450 RCF 下离心 10 分钟来沉淀单肺细胞悬液。为了维持细胞，一次重悬肺细胞和骨髓细胞。10 到每毫升 6 个细胞在预热补充的高葡萄糖 DMEM 中。

为了对 DNA 进行染色，添加 HOAXED 3 3 3 4 2 染料至终浓度为 5 μg/L。接下来，通过温和倒置混合细胞，并在 37 摄氏度的水浴中孵育正好 90 分钟。离心后，在 4 摄氏度下以 450 Gs 离心 10 分钟。

继续用抗 CD 45 和碘化丙啶对肺和骨髓组织进行染色，以准备通过流式细胞术进行分析。细胞染色后，将试管存放在避光的冰上，直到进行流式细胞术分析。通过确保仪器激光器对齐并设置为细胞分选来准备流式细胞术。

使用的仪器必须配备蓝色 488 纳米、红色 635 纳米和紫外 350 至 355 纳米激光器，紫外激光路径上有两个检测器，蓝色 45 超过 65 和红色 6 75 超过 50 滤光片。此外，紫外红检测器必须对红光信号具有高灵敏度，并且仪器必须配备制冷装置，以将样品保持在 10 摄氏度。在仪器软件中设置直方图以显示线性前向散射与侧向散射，这是适合仪器的双峰鉴别图。

使用对数信号的 PI 直方图、使用线性信号的红色海岸与蓝色海岸以及使用对数信号的 CD 45 A PC 直方图。仪器准备好后，将染色的骨髓样品放入仪器的装载口。该样品用作染色和仪器设置对照。

开始收集事件并调整 forward inside scatter 线性信号。为了清楚地可视化细胞群，细胞应大致位于前向散射图的下部中心，作为 x 轴。由于核染色 PI 具有膜 IMP 渗透性，因此它将被排除在活细胞之外。

在 PI 直方图中的 PI 阳性死细胞上绘制步态区域。指示仪器软件为死细胞着色。在这个门里是红色的。

使用彩色通风死细胞作为导航器来识别宿主 G 零 G 一群体是有帮助的。PI 染色剂也被紫外激光激发，大多数死细胞应该超出比例。在红色与蓝色恶作剧荧光图的右侧，骨髓的 G zero G 1 群体应被视为红色与蓝色恶作剧图中的紧密事件簇。

调整检测器电压，将 G 零 G 一簇放在图中右上角的右上角。细胞周期的一部分 S 期和整个 G 2 期可能超出比例。在红色与蓝色恶作剧图的右上方，可以看到低种群宿主从 G 零 G 一簇的左侧一直拖到图的左下角。

现在在 FSC 与 SSC 中的单元簇周围绘制一个门。绘制在双峰图中鉴定的单重态群体和 PI 直方图中的活细胞。然后分配 hoax 图以仅显示这些门控群体。

对主图进行门控后，在侧总体周围绘制一个区域。将此区域与 CD 45 A PC 直方图以及光散射单线态和活细胞门一起指定为门。系统设置完毕后，从上样口取出样品，并将肺部样品放入上样口。

此样本，不需要再次调整乐器设置。开始收集红色与蓝色恶作剧图上的事件。肺部样本的 G 零 G 一簇通常在 x 轴方向上显得更细长，类似于键盘上的波浪符号。

侧向种群步态恶作剧低的位置应与骨髓样本的设置位置相似。可能需要进行这些轻微的向上或向下调整，以确保对侧面总体的紧密分辨率。在分选过程中，通过确保样品流阀不要打开得太大，保持低压差。

接下来，为了分离 MSC，将 96 孔收集板放入分选室中，并在 CD 45 A PC 直方图上设置分选门以分离阳性和阴性群体。最后，将细胞作为混合群体收集到试管或单个细胞中，以将克隆分离到 96 孔板中，在收集肺 MSC 后，通过细胞分选将细胞接种在 30 毫米培养皿中，使用补充有 20% FBS 的 A MEM。首先，分选的细胞在大约 2 到 3 周后出现小、圆和亮。

具有间充质表型的集落变得明显，并且每种细胞制备的增殖更加明显。评估肺 MSC 分化成成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的传统间充质谱系的能力及其公认的间充质标志物的细胞表面表达。进行细胞遗传学禁用分析以确认不存在大体染色体异常。

通过流式细胞术分离并生成单细胞克隆后，进行集落形成测定以表征 MSC 细胞和分化能力。从稀释至每毫升 4 个细胞的 10 倍的 3 倍的细胞开始。在 100 毫米培养皿中，进行谷物稀释 2、6 倍 10 的 4、3 倍 10、10 的 3 倍 4、1.5 倍 10 到 4 和 0.75 倍 10 到四个细胞，在 10 毫升培养基中一式三份。

培养 10 天后，将板放入培养箱中，倒出培养基并用 PBS 冲洗细胞。然后在室温下加入 100% 甲醇 5 分钟来固定它们。五分钟后，倒出甲醇。

然后，为了检测菌落形成，加入 0.4% 重量的 gza 稀释 1 至 20 与离子水一起孵育 10 至 15 分钟。然后倒掉污渍并用离子水冲洗。让样品风干，并使用倒置显微镜或可视化定量每个菌落含有超过 25 个细胞的菌落数量。

集落很大，由几百个细胞组成，如图所示，并显示出间充质表型。如本视频所示分离 MSC 并接种在 96 孔板中模拟生长。然后将停滞的 CFSE 标记的抗原呈递细胞添加到肺 MSC 中。

然后将分离的 MSC 的增殖测量为 CFSE 的平均荧光强度与背景相比的降低，背景是单独的 CFSE 标记的 T 细胞，如图所示，在没有肺 SC 和抗原呈递细胞存在的情况下，A PC 加负 O 白蛋白 CD 40 阳性有效 T 细胞显示 CFSE 强度降低， ，表示以红色圈出的增殖。T 细胞膜的 CFSE 荧光强度在计量经济学上降低，每次细胞分裂 IE 在肺 M-S-C-A-P-C 加减去 OVA CD 40 阳性受影响的 T 细胞表现出 CFSE 强度没有显着变化，这表明发育后缺乏增殖。这项技术为肺干细胞生物学领域的研究人员探索间充质干细胞在肺动脉高压和肺纤维化等肺部疾病中的作用铺平了道路。

一旦掌握，这项技术可以在大约五个小时内完成。可以进行其他方法（如分化测定）来回答其他问题，包括推定的肺间充质干细胞是否表现出适当的多谱系分化、对骨脂肪和软骨的潜力。