Name: 使用R、Seurat和CellChat分析小鼠皮肤伤口愈合的单细胞转录组学数据集 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学习使用R、Seurat和CellChat分析小鼠皮肤伤口愈合的单细胞转录组学数据。本方案涵盖数据下载、质量控制、细胞聚类与注释，帮助研究人员识别参与伤口愈合的主要细胞类型及其动态变化。

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M.S. Wietecha 实验室获得了美国国立卫生研究院/国家普通医学科学研究所（NIH/NIGMS）R35-GM154921 项目基金、伤口愈合学会研究基金以及伊利诺伊大学芝加哥分校牙科学院口腔生物学系的资助。

<ol><li>Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%3A+mechanisms%2C+signaling%2C+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation.</a> Sci Transl Med. 6 (265), 265sr6(2014).</li>
<li>Wietecha, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase-specific+signatures+of+wound+fibroblasts+and+matrix+patterns+define+cancer-associated+fibroblast+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Phase-specific signatures of wound fibroblasts and matrix patterns define cancer-associated fibroblast subtypes.</a> Matrix Biol. 119, 19-56 (2023).</li>
<li>Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing%3A+a+cellular+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Wound healing: a cellular perspective.</a> Physiol Rev. 99 (1), 665-706 (2019).</li>
<li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+excisional+wound+model%3A+contraction+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">The murine excisional wound model: contraction revisited.</a> Wound Repair Regen. 23 (6), 874-877 (2015).</li>
<li>Rhea, L., Dunnwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+excisional+wound+healing+model+and+histological+morphometric+wound+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis.</a> J Vis Exp. (162), e61616(2020).</li>
<li>Fischer, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+splinted%2C+human-like+excisional+wound+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Protocol for the splinted, human-like excisional wound model in mice.</a> Bio-Protocol. 13 (3), e4606(2023).</li>
<li>Iglesias-Bartolome, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+signature+primes+human+oral+mucosa+for+rapid+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Transcriptional signature primes human oral mucosa for rapid wound healing.</a> Sci Transl Med. 10 (451), aap8798(2018).</li>
<li>Chen, L., Arbieva, Z. H., Guo, S., Marucha, P. T., Mustoe, T. A., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+differences+in+the+wound+transcriptome+of+skin+and+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Positional differences in the wound transcriptome of skin and oral mucosa.</a> BMC Genomics. 11, 471(2010).</li>
<li>Leonardo, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+changes+in+human+palate+and+skin+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair%22%5BJournal%5D)">Transcriptional changes in human palate and skin healing.</a> Wound Repair. 31 (2), 156-170 (2023).</li>
<li>Rognoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+state+switching+orchestrates+dermal+maturation+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast state switching orchestrates dermal maturation and wound healing.</a> Mol Syst Biol. 14 (8), e8174(2018).</li>
<li>Bergmeier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+myofibroblast-specific+expression+signature+in+skin+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a myofibroblast-specific expression signature in skin wounds.</a> Matrix Biol. 65, 59-74 (2018).</li>
<li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+fat+cells+from+myofibroblasts+during+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regeneration of fat cells from myofibroblasts during wound healing.</a> Science. 355 (6326), 748-752 (2017).</li>
<li>Shook, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblast+proliferation+and+heterogeneity+are+supported+by+macrophages+during+skin+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair.</a> Science. 362 (6417), aar2971(2018).</li>
<li>Rinkevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+fibrosis.+Identification+and+isolation+of+a+dermal+lineage+with+intrinsic+fibrogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Skin fibrosis. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential.</a> Science. 348 (6232), aaa2151(2015).</li>
<li>Guerrero-Juarez, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+reveals+fibroblast+heterogeneity+and+myeloid-derived+adipocyte+progenitors+in+murine+skin+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds.</a> Nat Commun. 10 (1), 650(2019).</li>
<li>Gay, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+Wnt+inhibitor+SFRP4+by+late+wound+macrophages+drives+chronic+Wnt+activity+for+fibrotic+skin+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of Wnt inhibitor SFRP4 by late wound macrophages drives chronic Wnt activity for fibrotic skin healing.</a> Sci Adv. 6 (12), eaay3704(2020).</li>
<li>Haensel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+epidermal+basal+cell+states+during+skin+homeostasis+and+wound+healing+using+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Defining epidermal basal cell states during skin homeostasis and wound healing using single-cell transcriptomics.</a> Cell Rep. 30 (11), 3932-3947.e6 (2020).</li>
<li>Phan, Q. M., Sinha, S., Biernaskie, J., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+analysis+of+small+and+large+wounds+reveals+the+distinct+spatial+organization+of+regenerative+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic analysis of small and large wounds reveals the distinct spatial organization of regenerative fibroblasts.</a> Exp Dermatol. 30 (1), 92-101 (2021).</li>
<li>Foster, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+spatial+multiomics+reveals+fibroblast+fate+during+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Integrated spatial multiomics reveals fibroblast fate during tissue repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (41), e2110025118(2021).</li>
<li>Hu, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+space-time+mapping+identifies+concerted+immune+and+stromal+cell+patterns+and+gene+programs+in+wound+healing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional space-time mapping identifies concerted immune and stromal cell patterns and gene programs in wound healing and cancer.</a> Cell Stem Cell. 30 (6), 885-903.e10 (2023).</li>
<li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dictionary+learning+for+integrative%2C+multimodal+and+scalable+single-cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis.</a> Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2024).</li>
<li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+and+analysis+of+cell-cell+communication+using+CellChat%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat.</a> Nat Commun. 12 (1), 1088(2021).</li>
<li>Germain, P. -L., Lun, A., Garcia Meixide, C., Macnair, W., Robinson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doublet+identification+in+single-cell+sequencing+data+using+scDblFinder%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Doublet identification in single-cell sequencing data using scDblFinder.</a> F1000Research. 10, 979(2021).</li>
<li>Jin, S., Plikus, M. V., Nie, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellChat+for+systematic+analysis+of+cell-cell+communication+from+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">CellChat for systematic analysis of cell-cell communication from single-cell transcriptomics.</a> Nat Protoc. 20 (1), 180-219 (2024).</li>
<li>Luecken, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+atlas-level+data+integration+in+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Benchmarking atlas-level data integration in single-cell genomics.</a> Nat Methods. 19 (1), 41-50 (2022).</li>
<li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+analysis+of+multimodal+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrated analysis of multimodal single-cell data.</a> Cell. 184 (13), 3573-3587.e29 (2021).</li>
<li>Lun, A. T. L., McCarthy, D. J., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+step-by-step+workflow+for+low-level+analysis+of+single-cell+RNA-seq+data+with+Bioconductor%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">A step-by-step workflow for low-level analysis of single-cell RNA-seq data with Bioconductor.</a> F1000Research. 5, 2122(2016).</li>
<li>McCarthy, D. J., Campbell, K. R., Lun, A. T. L., Wills, Q. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scater%3A+pre-processing%2C+quality+control%2C+normalization+and+visualization+of+single-cell+RNA-seq+data+in+R%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics+%28Oxford%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Scater: pre-processing, quality control, normalization and visualization of single-cell RNA-seq data in R.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 33 (8), 1179-1186 (2017).</li>
<li>Wolf, F. A., Angerer, P., Theis, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCANPY%3A+large-scale+single-cell+gene+expression+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis.</a> Genome Biol. 19 (1), 15(2018).</li>
<li>Aran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference-based+analysis+of+lung+single-cell+sequencing+reveals+a+transitional+profibrotic+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reference-based analysis of lung single-cell sequencing reveals a transitional profibrotic macrophage.</a> Nat Immunol. 20 (2), 163-172 (2019).</li>
<li>Andreatta, M., Berenstein, A. J., Carmona, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scGate%3A+marker-based+purification+of+cell+types+from+heterogeneous+single-cell+RNA-seq+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">scGate: marker-based purification of cell types from heterogeneous single-cell RNA-seq datasets.</a> Bioinformatics. 38 (9), 2642-2644 (2022).</li>
<li>Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A., Vento-Tormo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellPhoneDB%3A+inferring+cell-cell+communication+from+combined+expression+of+multi-subunit+ligand-receptor+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes.</a> Nat Protoc. 15 (4), 1484-1506 (2020).</li>
<li>Hu, Y., Peng, T., Gao, L., Tan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CytoTalk%3A+de+novo+construction+of+signal+transduction+networks+using+single-cell+transcriptomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell transcriptomic data.</a> Sci Adv. 7 (16), eabf1356(2021).</li>
<li>Dimitrov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+and+resources+for+cell-cell+communication+inference+from+single-cell+RNA-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods and resources for cell-cell communication inference from single-cell RNA-Seq data.</a> Nat Commun. 13 (1), 3224(2022).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

在本实验方案中，使用 RStudio 运行指定的代码行，以利用 Seurat 对复杂的单细胞数据集进行基础分析。介绍了多种与伤口愈合研究相关的方法，包括 R 编程环境的安装、下载已发表的单细胞伤口愈合数据集、执行关键的质量控制步骤以及标准的单细胞分析工作流程（包括可视化、主要细胞类型注释、细胞亚型分析和基于 Seurat 的整合分析），并使用 CellChat 进行细胞间相互作用分析。
本文介绍的方法是使用 R 及其流行的开源科学软件包 Seurat21 和 CellChat22 进行单细胞分析的典型工作流程的简化示例。实际上，该工作流程仅展示了利用复杂的单细胞伤口愈合数据集所能完成的分析类型之一。对该方法可能进行的修改几乎是无限的，唯一的限制在于用户特定的科学问题。例如，用户可根据希望从该数据集中提出的研究问题，调整某些关键参数，如细胞类型和时间点。作者还希望用户能够自如地将此工作流程适配于自身感兴趣的单细胞数据集；然而，在使用该工作流程分析其他数据集时必须谨慎，因为每个实验都可能将技术性问题和样本制备问题带入数据本身。因此，在解读任何已发表并被重新分析的单细胞数据集结果之前，用户必须仔细阅读并充分理解所有实验细节。需要牢记的是，生物信息学工具是探索生物学过程和提出假设的有力手段，但对结果所作的任何关键性生物学解释都必须通过后续实验加以验证。
在整个实验流程中，需注意可根据具体需求对工作流程的特定环节进行重大修改，以实现其他目标。然而，所有可能的流程修改组合的详细说明已超出本文的范围。例如，用于细胞聚类的分辨率以及UMAP分析所采用的维度本质上具有主观性，本文介绍的工具既支持大规模分析（如本研究中对广义主要细胞类型的分析），也支持更精细的特定分析，后者可能涉及将细胞进一步划分为更大数据集中更稀有的亚群。关于单细胞分析方法的这一方面，以及单细胞分析流程中其他可调整参数的详细信息，作者建议读者参考Seurat的相关出版物21,26及官方网站（<a href="https://satijalab.org/seurat/">https://satijalab.org/seurat/</a>），该工具的开发者在网站上提供了深入的解释、示例分析（vignettes）和操作教程。
本文介绍了单细胞转录组学文献中引用和使用最广泛的几种工具，分别是用于单细胞分析的 Seurat21 和用于细胞间相互作用分析的 CellChat22。然而，也存在其他以略微不同方式实现类似功能的工具。在单细胞数据集分析方面，有 Scran27、Scater28 以及基于 Python 的 ScanPy29，这些工具采用多种方法进行数据集整合25。本实验方案展示了细胞类型的 manual 注释方法，该方法依赖用户对聚类细胞标志物富集结果的判断；但目前已有多种可实现细胞类型自动分类的工具，例如 SingleR30 和 scGate31 等。在细胞间通讯分析方面，本方案演示了 CellChat 的使用，但还存在其他用于推断细胞间通讯的工具，包括 CellPhoneDB32、Cytotalk33，以及集成在 LIANA（LIgand-receptor ANalysis framework）共识框架中的其他配体-受体数据库34。所有生物信息学工具均具有独特性，各自带有特定的特性与可调节参数。因此，用户必须仔细阅读每种工具的相关文档，以充分理解其细微差异，再对分析结果进行解释。最后，无论使用何种生物信息学工具，都必须牢记这些工具在持续发展，不同版本的软件包可能产生不同的分析结果。
在 R 中，语法至关重要，标点符号、引号、括号的位置错误，甚至字母大小写错误，都会导致报错。因此，用户在输入代码时必须注意细节，尤其是在复制代码行并将其修改以适应新的科学问题和数据集时更应格外谨慎。针对可能遇到的具体错误，作者建议将错误信息直接复制粘贴到用户常用的网络搜索引擎中，并浏览来自生物信息学论坛（如 GitHub 和 Stack Overflow）的搜索结果，因为大多数常见错误很可能已被经验丰富的高级用户解答。在某些论坛中，其他用户会通过“点赞”方式标记出他们认为最有效的解决方案。用户必须注意，切勿直接将从互联网上找到的代码行复制粘贴到自己的计算机中（特别是当解决方案要求更改 R 编程环境之外的系统设置时），因为这些程序可能存在恶意风险。一种新兴且有效的排错方法是使用强大的生成式大型语言人工智能模型，例如 OpenAI 的 ChatGPT、微软的 Copilot 或谷歌的 Gemini。这些模型已被证明在软件工程领域，尤其是问题排查方面具有显著帮助。使用时，用户可在向聊天机器人简要说明代码意图后，将其代码整行复制粘贴给模型。需要注意的是，这些模型并非万无一失，用户可能需要尝试多个提示词（prompt），才能获得适用于解决当前问题的正确答案。

伤口愈合是哺乳动物生物学中最复杂的过程之一，包含三个阶段：炎症期、增殖期和修复完成期1,2。这些愈合阶段大致概括了数十种细胞类型及其数百种分子产物在空间和时间上的协调作用，贯穿整个伤口修复过程3。过去几十年中，基于在愈合时间进程中采集伤口组织样本所开展的组织学和分子研究，已阐明了组织修复的整体细胞模式3，尤其是在可重复的皮肤缺损小鼠模型中4,5,6。直到最近二十年，随着高通量转录组分析技术的发展，人们才得以更全面地认识伤口愈合的复杂性，最初应用于伤口整体组织水平7,8,9，随后扩展至单细胞水平10,11,12,13,14。最近，多项研究在单细胞层面描绘了皮肤伤口的转录图谱，鉴定出新的伤口相关细胞亚型，并揭示了它们在愈合过程中可能的相互作用方式15,16,17,18,19,20。Hu 等人采用一种创新的空间单细胞 RNA 测序方法，对愈合过程中从伤口中心不同径向距离处的皮肤伤口进行了分析，揭示了细胞间及分子层面在时空上的新“动态”变化20。此类研究以前所未有的细节解析了伤口愈合的复杂性，开始呈现出高度的细胞与分子异质性图景。
近年来，生物信息学分析方法的重大进展使得研究人员能够深入理解伤口愈合研究领域中产生的复杂多组学数据集。诸如 Seurat 等单细胞分析工具包提供了对数据集进行稳健分析与整合的手段，包括对伤口等复杂组织中的细胞类型进行分类21。在单细胞数据的下游解释方面，研究人员常使用 CellChat 等工具来识别潜在的细胞间相互作用程序，从而揭示细胞如何协调以实现伤口修复22。尽管这些工具具有完善的文档记录并被广泛引用，但它们必须在计算机编程环境中运行，例如 R 语言——一种统计与图形化编程语言，广泛应用于基因组学和转录组学等生物信息学领域。尽管伤口愈合领域的生物学家和临床医生正越来越多地采用单细胞技术研究组织修复，但极少有人具备在各自实验室中直接使用 Seurat 和 CellChat 等工具所需的生物信息学训练背景。这种技术门槛不仅阻碍了科研人员在无需生物信息学专家协助的情况下深入分析自身数据集，也限制了他们对其他研究团队已发表的大量单细胞数据进行可靠地重复分析的能力。
因此，本文提供了一个逐步操作的工作流程，旨在帮助没有生物信息学背景的科研人员分析一个已发表且公开可用的单细胞伤口愈合数据集20。该方案采用广泛使用且免费的图形化 R 编程环境 RStudio，演示了如何在该环境中运行指定代码行，利用 Seurat 和 CellChat 对复杂的单细胞数据集进行基础分析。本方案涵盖了伤口愈合研究中相关的七项主要方法，包括：1）编程环境的安装，2）数据集的下载及关键的质量控制步骤，3）单细胞分析工作流程（包括可视化和细胞类型注释），4）细胞亚型分析，5）模块评分分析，6）细胞间相互作用分析，以及 7）多个数据集的整合分析。在每种方法中，均提供了可实际运行的代码，供用户在执行方案时同步操作，同时展示了每一行代码生成的实际图形结果，以引导用户完成整个工作流程。本指南性且可视化地介绍 RStudio 及基础单细胞分析流程的主要目标，是使更多伤口愈合领域的科研人员能够直接使用这些强大工具，从而推动该研究领域更快发展。

<table><tbody><tr><td>笔记本电脑或台式计算机</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>运行 Windows 或 MacOS&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>R</td><td>N/A</td><td>版本 4.4.1</td><td>可从 https://cran.rstudio.com/ 免费下载</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>Posit 软件，PBC</td><td>版本 2024.09.0</td><td>可从 https://posit.co/download/rstudio-desktop/ 免费下载</td></tr><tr><td>Office Excel</td><td>微软</td><td>任意版本</td><td>用于表格数据的分析</td></tr><tr><td>互联网浏览器</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于访问网站</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;R 软件包&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;知识库&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;版本&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>开发工具</td><td>CRAN</td><td>2.4.5</td><td></td></tr><tr><td>readxl</td><td>CRAN</td><td>1.4.3</td><td></td></tr><tr><td>openxlsx</td><td>CRAN</td><td>4.2.7.1</td><td></td></tr><tr><td>tidyverse</td><td>CRAN</td><td>2.0.0</td><td></td></tr><tr><td>scCustomize</td><td>CRAN</td><td>2.1.2</td><td></td></tr><tr><td>BiocManager</td><td>Bioconductor</td><td>1.30.25</td><td></td></tr><tr><td>NMF</td><td>Bioconductor</td><td>0.28</td><td></td></tr><tr><td>ComplexHeatmap</td><td>Bioconductor</td><td>2.20.0</td><td></td></tr><tr><td>BiocNeighbors</td><td>Bioconductor</td><td>1.22.0</td><td></td></tr><tr><td>SingleCellExperiment</td><td>Bioconductor</td><td>1.26.0</td><td></td></tr><tr><td>circlize</td><td>Bioconductor</td><td>0.4.16</td><td></td></tr><tr><td>edgeR</td><td>Bioconductor</td><td>4.2.1</td><td></td></tr><tr><td>scDblFinder</td><td>Bioconductor</td><td>1.18.0</td><td></td></tr><tr><td>Seurat</td><td>CRAN</td><td>5.1.0</td><td></td></tr><tr><td>CellChat</td><td>Github</td><td>2.1.2</td><td></td></tr></tbody></table>

使用 r、seurat 和 cellchat 分析小鼠皮肤伤口愈合的单细胞转录组数据集

Using R, Seurat, and CellChat to Analyze a Single-Cell Transcriptomics Dataset of Mouse Skin Wound Healing

伤口愈合过程受到不同细胞类型在时空上复杂相互作用的调控。通过对复杂微环境中单个细胞进行分析，单细胞转录组学方法能够研究参与伤口愈合过程的细胞异质性、细胞间通讯网络以及细胞-细胞相互作用。然而，许多单细胞分析工具需要在计算机编程环境中运行，而伤口愈合领域科研人员普遍缺乏生物信息学专业知识，这限制了这些工具的广泛应用。因此，本文提供了一套逐步操作流程，展示如何使用名为 RStudio 的图形化编程环境，对小鼠皮肤全层切口伤口愈合的时间序列数据集进行基础的单细胞分析。这一可视化且具有引导性的实验方案将帮助无生物信息学背景的科研人员下载已发表的伤口愈合数据集，执行关键的质量控制步骤，利用 Seurat 完成标准的单细胞分析流程（包括数据集可视化和细胞类型注释），开展细胞亚群分析、模块评分分析，使用 CellChat 进行细胞间相互作用分析，并利用 Seurat 实现多个数据集的整合分析。本方案为每一步操作提供了详细的叙述性说明，并展示了每一行代码对应的图形化结果，以安全、准确地引导用户完成整个分析流程。本可视化单细胞分析流程的目的是使更多伤口愈合领域的科研人员能够在自己的实验室中直接应用生物信息学工具，从而更深入地分析自身产生的单细胞数据集，并广泛地对已发表的单细胞数据集进行再分析。

本文以小鼠皮肤伤口愈合的单细胞时间序列转录组数据集为例，利用 R 语言展示了一套逐步、可视化的分析工作流程。该方案包括使用 Seurat 进行数据集下载、质量控制、可视化和细胞类型注释的标准流程，以及使用 CellChat 进行细胞间相互作用分析。

使用 R、Seurat 和 CellChat 分析小鼠皮肤伤口愈合的单细胞转录组数据集

伤口愈合过程受到不同细胞类型在时空上的复杂相互作用调控。通过对单个……进行分析

在我们的实验室中，我们结合单细胞转录组学、空间转录组学以及系统生物学和生物信息学方法，研究不同愈合结局中的时空细胞动态。近年来，单细胞转录组学在人类及模式生物（如小鼠）伤口愈合研究中的应用迅速增加。然而，对于缺乏或仅有少量生物信息学经验的实验科学家而言，单细胞数据集的完整分析具有较高门槛。这意味着在伤口愈合领域，科学家们往往未能充分利用单细胞数据集。本方案是首个无需任何生物信息学先验知识的综合性实验流程，可引导用户从数据集下载开始，逐步完成与伤口愈合研究相关的各类分析并获得结果输出。本方案可作为伤口愈合研究人员深入分析自身单细胞数据集的模板，同时帮助他们从公开可用的数据集中挖掘新的科学见解。[Shalyn] 首先，使用编号 GSE204777 从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus）中访问数据集文件。点击标题为 GSM6190913 的第一个数据集。滚动至 GSM6190913 页面底部，通过 FTP 或 HTML 链接下载列出的三个文件。使用计算机的文件资源管理器，将下载的文件移至名为 b1 的目录中，并确保该目录位于工作目录内。获取已下载的单细胞测序文件的目录路径信息。接下来，将单细胞测序文件加载到工作环境中。然后，从工作数据集中分离基因表达数据和多重检测 HTO 数据。使用基因表达数据创建 Seurat 对象，同时过滤掉在少于五个细胞中被检测到的基因，以及基因数少于 200 的细胞。对于缺乏 HTO 数据的数据集，使用相同的过滤参数创建 Seurat 对象，并切换至基因表达检测。计算每个细胞中线粒体基因所占百分比，并将该值作为元数据变量进行赋值。可视化所有细胞中基因计数、总 RNA 量以及线粒体基因百分比的分布情况。使用阈值去除线粒体含量超过 25% 的细胞，并在剔除这些低质量细胞后重新可视化更新后的分布。使用 SC doublet finder 方法检测可能的双细胞（doublets）。运行 SC doublet finder 分析流程，将生成的双细胞评分作为新的元数据变量进行赋值。现在，可视化所有细胞中双细胞评分的分布情况。剔除双细胞评分高于 0.25 的所有细胞，并将清洗后的 Seurat 对象以 RDS 文件格式保存至工作目录中。执行数据归一化、标准化及主成分分析（PCA）。可视化前 50 个主成分的方差贡献情况。使用前 13 个主成分和聚类分辨率为 0.1 的参数对细胞进行聚类。在邻近性分析中执行均匀流形近似与投影（UMAP）降维，使用前 13 个主成分，并将随机种子数设为 123。现在，在 UMAP 图上可视化细胞聚类结果，随后在另一张 UMAP 图上展示伤口时间和空间注释。接着，生成一个表格，将细胞聚类与伤口时间和空间注释相关联。在计算所有聚类之间的差异表达基因后确定主要细胞类型身份，并将得到的差异表达基因（DEG）列表赋值给变量，随后以分隔符文本文件格式保存至工作目录。现在，在电子表格应用程序中打开数据集聚类标志物文件。使用文本导入向导将逗号设置为分隔符，并将基因名称列格式化为文本，以防止基因名称被自动转换为日期。在电子表格中，将“平均 log2 FC”列按从大到小排序，使行按 log2 倍数变化值递减顺序排列，接着将“cluster”列按从小到大排序。为使行按 Seurat 聚类编号升序排列，首先筛选“平均 log2 FC”列，仅保留大于或等于 2.5 的值，然后筛选“PCT 1”列，仅保留大于或等于 0.4 的值。接下来，筛选“PCT 2”列，仅保留小于或等于 0.2 的值。最后，筛选“P-value adjusted”列，仅保留小于或等于 0.01 的值。现在，打开基于网页的富集分析工具 Enrichr。针对每个聚类，将差异表达基因列表分别复制到独立的 Enrichr 窗口中并点击“analyze”。然后，点击分析结果上方的“cell types”标签，重点关注三个精选细胞标志物数据库中排名前五的富集结果。根据 Enrichr 分析中获得的最高富集结果，为八个聚类分配可能的细胞身份。将聚类 2 和聚类 6 合并为一个标注为“成纤维细胞（fibroblasts）”的类别，并将这些标注作为名为“cell types”的新元数据变量进行赋值。随后，在 UMAP 图上可视化标注后的细胞类型，并在一系列 UMAP 图上展示加粗显示的顶级聚类标志基因的定位情况。在点图（dot plot）中按原始聚类编号分组展示顶级聚类标志差异表达基因，然后再次在点图中展示这些顶级标志基因，但此次按标注的细胞类型分组。为进行时间序列分析做准备，移除空间注释并对数据集进行简化。将伤口时间和空间元数据重新赋值为一个名为 DPW（Days Post Wounding，伤后天数）的新变量。在 UMAP 图上可视化新的 DPW 时间序列分组，并生成表格，展示每个 DPW 组中各类细胞的数量。接下来，将细胞计数转换为比例，以评估愈合过程中细胞类型组成相对变化情况，并可视化每种细胞类型内各 DPW 类别的比例分布。最后，可视化每个 DPW 组中各类细胞的比例，并将包含所有注释和过滤信息的最终 Seurat 对象以 RDS 文件格式保存至工作目录。数据集中所有细胞在 UMAP 图上均清晰聚类为不同颜色编码的主要细胞类型，证实了基于富集细胞类型特征的成功注释。顶级聚类标志基因的高表达在 UMAP 图上定位于其对应的细胞类型聚类区域内。点图可视化结果进一步确认，聚类标志基因的最高表达水平仅局限于其标注的主要细胞类型中。堆叠柱状图显示，在伤后第 1 天，中性粒细胞和巨噬细胞占主导地位，而在后期时间点，成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞的比例逐渐升高，反映了已知的伤口愈合细胞级联过程。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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癌症发生是一个涉及癌细胞与肿瘤微环境之间相互作用的过程。为了剖析其中的分子事件，需要在癌症发展的不同阶段分离出不同的细胞群体。利用基底细胞癌的小鼠模型，我们描述了一种在癌症发生过程中进行细胞分析的实验方案。...

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本方案描述了为基于微滴的高通量单细胞RNA测序制备健康的成年哺乳动物单细胞所需的常规操作步骤及质量控制检测。同时提供了测序参数、序列比对以及下游单细胞生物信息学分析方法。...

基于液滴条形码的成年哺乳动物组织单细胞转录组学

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体外与体内伤口愈合分析的划痕迁移实验与背侧皮肤折叠腔技术

本文介绍了一种两步细胞消化方案，用于制备小鼠颈动脉的单细胞悬液。...

小鼠颈动脉单细胞悬液制备用于单细胞测序

本研究介绍了两种关键的实验技术：构建小鼠伤口模型以评估伤口闭合情况，以及从小鼠皮肤制备单细胞悬液以保持细胞活性。...

小鼠伤口模型的建立与单细胞悬液的制备

迭代漂白扩展多重性（IBEX）技术与商用核苷酸标记试剂盒（Click-iT...

高通量成像与分析工作流程用于评估组织样本中皮肤细胞表型及增殖状态

本方案结合流式细胞术和单细胞RNA测序技术，用于分离和表征出生后早期小鼠脑小脑中的小胶质细胞状态。该方法通过酶解消化、Percoll离心及免疫染色，揭示小胶质细胞的异质性，从而加深对其在小脑发育与疾病中作用的理解。...

流式细胞术与单细胞分析用于表征小鼠出生后早期脑发育过程中小胶质细胞的活化

本研究提出了一种空间Trekker–CUT&amp;#38;Tag多组学方案，将组织切片的直接空间条形码技术与单细胞多组学分析相结合。该方法能够同时实现基因表达和组蛋白H3K27ac修饰的空间解析单细胞谱型分析，为在组织微解剖背景下理解基因调控机制提供了深入见解。...

空间分辨的、整合式单细胞多组学分析：在冷冻组织切片中对转录组与表观基因组靶标进行联合检测

本文介绍了一种利用热休克蛋白27（HSP27）特异性小干扰RNA评估HSP27在角膜上皮伤口愈合过程中功能的实验方案。RNA干扰是研究多种细胞类型中蛋白质功能时，有效敲低基因表达的最佳方法。...

基于RNA干扰的热休克蛋白27在角膜上皮伤口愈合过程中功能的研究

本文描述了非靶向代谢组学、转录组学及多变量统计分析在葡萄果实转录本和代谢物研究中的应用，旨在深入理解风土（terroir）概念。...

风土概念通过葡萄果实代谢组学与转录组学的解析

学习使用R、Seurat和CellChat分析小鼠皮肤伤口愈合的单细胞转录组学数据。本方案涵盖数据下载、质量控制、细胞聚类与注释，帮助研究人员识别参与伤口愈合的主要细胞类型及其动态变化。

使用 R、Seurat 和 CellChat 分析小鼠皮肤伤口愈合的单细胞转录组数据集

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