使用R、Seurat和CellChat分析小鼠皮肤伤口愈合的单细胞转录组学数据集
August 1st, 2025
在这里，我们提出了一个分步的可视化工作流程，用于使用 R 分析小鼠皮肤伤口愈合的单细胞时程转录组学数据集。该协议包括一个标准管道，用于使用 Seurat 进行数据集下载、质量控制、可视化和细胞类型注释，以及使用 CellChat 进行细胞间相互作用分析。
在我们的实验室中，我们使用单细胞和空间转录组学等新兴工具以及系统生物学和生物信息学方法来研究差异愈合结果的空间时间细胞动力学。近年来，我们看到单细胞转录组学迅速被用于研究人类和模式生物（如小鼠）的伤口愈合。对于几乎没有生物信息学经验的实验室科学家来说，对单细胞数据集的全面分析是望而却步的。这意味着伤口愈合领域的科学家经常没有充分利用单细胞数据集。这是第一个假设之前没有生物信息学经验的综合协议，它让用户从数据集下载到伤口愈合研究背景下相关分析的输出。我们的协议应该作为伤口愈合研究人员的模板，以更全面地分析他们自己的单细胞数据集，并能够从公开可用的数据集中提取新的见解。
[沙琳]首先，使用登录号GSE204777从基因表达综合存储库导航到数据集文件。单击标题为 GSM6190913 的第一个数据集。滚动到GSM6190913页面底部，然后使用 FTP 或 HTML 链接下载列出的三个文件。使用计算机的文件资源管理器，将下载的文件移动到名为 b1 的目录中，确保它位于工作目录中。检索已下载的单细胞测序文件的目录路径信息。现在，将单细胞测序文件加载到工作环境中。然后，将基因表达和多路复用HTO数据与工作数据集分离。使用基因表达数据创建 Seurat 对象，同时过滤掉在少于 5 个细胞中检测到的基因和少于 200 个基因的细胞。对于缺少HTO数据的数据集，创建具有相同过滤参数的Seurat对象，并切换到基因表达测定。计算每个细胞中的线粒体基因百分比，并将该值分配为元数据变量。可视化所有细胞的基因计数、总 RNA 和线粒体基因百分比的分布。使用阈值去除线粒体含量超过 25% 的细胞，并在过滤掉这些低质量细胞后可视化更新的分布。使用 SC 双峰查找器方法检测可能的双峰。使用命令运行 SC 双峰查找器管道，并将生成的双峰分数分配为新的元数据变量。现在，可视化所有单元格中双峰分数的分布。删除所有双峰分数高于 0.25 的单元格，并将清理后的 Seurat 对象作为 RDS 文件保存在工作目录中。执行数据归一化、缩放和主成分分析。可视化前 50 个主要成分的方差贡献。使用前 13 个主要成分和 0.1 的聚类分辨率对细胞进行聚类。使用前 13 个主成分执行均匀流形近似和投影，或在邻域分析中进行 UMAP 缩减，并将种子数设置为 123。现在，在 UMAP 图上可视化细胞聚类，然后在 UMAP 图上可视化伤口时间和空间注释。然后，生成一个表，将细胞簇与缠绕时间和空间注释相关联。在计算所有簇之间的差异表达基因后确定主要细胞类型身份，并将生成的 DEG 列表分配给变量，然后将它们作为分隔文本文件保存在工作目录中。现在，在电子表格应用程序中打开数据集聚类标记文件。使用文本导入向导将逗号设置为分隔符，并将基因名列格式化为文本，以防止将基因名自动转换为日期。在电子表格中，将平均对数 2 FC 列从大到小进行排名，通过减少对数两倍变化值来对行进行排序，然后是聚类列从最小到最大。要通过增加 Seurat 聚类编号对行进行排序，请过滤平均对数 2 FC 列以仅包含大于或等于 2.5 的值，然后过滤 PCT 1 列以包含大于或等于 0.4 的值。接下来，过滤 PCT 2 列以包含小于或等于 0.2 的值。最后，筛选 P 值调整后的列以包括小于或等于 0.01 的值。现在，打开 Enrichr 基于 Web 的富集分析工具。对于每个簇，将差异表达基因列表复制到单独的富集窗口中，然后单击分析。然后，单击分析输出上方的细胞类型选项卡，并关注三个精选细胞标记数据库中的前五个富集。根据 Enrichr 分析中的顶级扩充，将可能的标识分配给八个聚类。将聚类 2 和 6 组合成一个标记成纤维细胞的注释，并将这些注释分配为名为细胞类型的新元数据变量。 然后，在 UMAP 图上可视化带注释的细胞类型，并在一系列 UMAP 图上显示粗体顶部簇标记基因的定位。在按原始簇数分组的点图上可视化顶部簇标记差异表达的基因，然后在点图中再次可视化顶部标记基因，这次按注释细胞类型分组。要准备时间序列分析，请删除空间注释并简化数据集。将伤口时间和空间元数据重新分配给一个名为 DPW for Days Post Wounding 的新变量。在 UMAP 图上可视化新的 DPW 时程分组，并生成显示每个 DPW 组中每种类型的单元格数量的表格。接下来，将细胞计数转换为比例，以评估愈合过程中细胞类型组成的相对变化，并可视化每种细胞类型中每个 DPW 类别的比例。最后，可视化每个 DPW 组中每种细胞类型的比例，并将包含所有注释和过滤器的最终 Seurat 对象作为 RDS 文件保存到工作目录中。数据集中的所有细胞在 UMAP 图上明显聚集为主要颜色编码的细胞类型，确认基于富集细胞类型特征的注释成功。在 UMAP 图上，顶级簇标记基因的高表达定位于其各自的细胞类型簇内。点图可视化证实，簇标记基因的最高表达水平仅限于其注释的主要细胞类型。堆叠条形图显示，中性粒细胞和巨噬细胞在伤口后第一天占主导地位，而成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞在后期时间点变得更加普遍，反映了已知的伤口愈合细胞级联反应。
概述
本文介绍了使用 R 分析与小鼠皮肤伤口愈合相关的单细胞时间序列转录组学数据的综合协议。该工作流指导研究人员完成数据集下载、质量控制、可视化和细胞类型注释。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物信息学
- 伤口愈合研究
背景
- 单细胞转录组学越来越多地用于研究伤口愈合。
- 许多研究人员缺乏生物信息学经验，导致数据集利用不足。
- 该协议是为没有先前生物信息学知识的用户设计的。
- 它旨在促进伤口愈合研究中单细胞数据集的分析。
研究目的
- 提供分析单细胞转录组学数据的逐步指南。
- 使研究人员能够从自己的数据集和公开可用的数据集中提取见解。
- 标准化伤口愈合研究的分析过程。
使用的方法
- 从基因表达综合数据库下载数据集。
- 单细胞测序数据的质量控制和过滤。
- 创建 Seurat 对象以进行数据分析。
- 细胞聚类和差异基因表达的可视化。
主要结果
- 识别参与伤口愈合的主要细胞类型。
- 可视化细胞类型随时间的分布。
- 生成显示伤口愈合阶段细胞计数和比例的表格。
- 对愈合过程中的细胞动态的见解。
结论
- 该协议为伤口愈合研究人员提供了宝贵的资源。
- 它促进了单细胞转录组学在生物学研究中的应用。
- 研究人员可以利用此工作流来增强对复杂数据集的分析。
常见问题
Executive Industry Relevance
Single-cell transcriptomics enables high-resolution mapping of cellular heterogeneity and dynamic cell-cell interactions during tissue repair, directly informing target validation and mechanistic de-risking in regenerative medicine. This protocol operationalizes robust, reproducible workflows for analyzing wound healing datasets, lowering barriers for cross-functional teams to extract actionable insights from complex single-cell data. By standardizing quality control, annotation, and interaction analysis, the workflow enhances predictive confidence and supports risk-adjusted portfolio decisions in early discovery and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of cellular heterogeneity and pathway activity in wound healing models.
- Supports functional target validation by mapping cell type-specific gene expression and interactions.
- Facilitates mechanistic de-risking through quantitative annotation of cell populations and their dynamics.
- Improves predictive confidence for target selection and triage in regenerative and inflammatory disease portfolios.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell datasets for downstream screening and phenotypic assay development.
- Standardizes quality control and filtering to ensure reproducibility and comparability across experiments.
- Generates quantitative outputs for benchmarking assay performance and cell type annotation fidelity.
- Enables scalable reuse of annotated datasets for compound evaluation and mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cellular signatures and interaction networks with disease-relevant wound healing stages.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by tracking cell type dynamics over time.
- Provides a framework for integrating new and legacy datasets to inform translational biomarker strategies.
- De-risks advancement decisions by quantifying cellular responses to perturbations in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow bridges early discovery, screening, and translational research by enabling standardized single-cell analysis from dataset acquisition to cell-cell interaction mapping.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving cell type-specific gene expression and interactions.
- Screening: Delivers reproducible, quality-controlled datasets ready for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides quantitative measurements, differential expression outputs, and interaction networks for robust comparison across conditions.
- Translational Research: Connects cellular dynamics to wound healing stages, supporting biomarker alignment and preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical pipeline for ongoing and future single-cell studies in tissue repair and regeneration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes workflows, enhances reproducibility, and enables scalable analysis across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency by de-risking early-stage programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of regenerative and inflammatory disease assets.
Implementation Considerations
- Requires foundational expertise in R and familiarity with single-cell analysis tools such as Seurat and CellChat.
- Demands access to computational infrastructure capable of handling large single-cell datasets.
- Benefits from standardized quality control and annotation protocols for cross-team comparability.
- Adaptable to diverse tissue models and time-course datasets with appropriate parameter adjustments.
- Dependent on the availability of well-annotated reference datasets for robust cell type identification.
