使用R、Seurat和CellChat分析小鼠皮肤伤口愈合的单细胞转录组学数据集

在我们的实验室中，我们使用单细胞和空间转录组学等新兴工具以及系统生物学和生物信息学方法来研究差异愈合结果的空间时间细胞动力学。近年来，我们看到单细胞转录组学迅速被用于研究人类和模式生物（如小鼠）的伤口愈合。对于几乎没有生物信息学经验的实验室科学家来说，对单细胞数据集的全面分析是望而却步的。这意味着伤口愈合领域的科学家经常没有充分利用单细胞数据集。这是第一个假设之前没有生物信息学经验的综合协议，它让用户从数据集下载到伤口愈合研究背景下相关分析的输出。我们的协议应该作为伤口愈合研究人员的模板，以更全面地分析他们自己的单细胞数据集，并能够从公开可用的数据集中提取新的见解。

[沙琳]首先，使用登录号GSE204777从基因表达综合存储库导航到数据集文件。单击标题为 GSM6190913 的第一个数据集。滚动到GSM6190913页面底部，然后使用 FTP 或 HTML 链接下载列出的三个文件。使用计算机的文件资源管理器，将下载的文件移动到名为 b1 的目录中，确保它位于工作目录中。检索已下载的单细胞测序文件的目录路径信息。现在，将单细胞测序文件加载到工作环境中。然后，将基因表达和多路复用HTO数据与工作数据集分离。使用基因表达数据创建 Seurat 对象，同时过滤掉在少于 5 个细胞中检测到的基因和少于 200 个基因的细胞。对于缺少HTO数据的数据集，创建具有相同过滤参数的Seurat对象，并切换到基因表达测定。计算每个细胞中的线粒体基因百分比，并将该值分配为元数据变量。可视化所有细胞的基因计数、总 RNA 和线粒体基因百分比的分布。使用阈值去除线粒体含量超过 25% 的细胞，并在过滤掉这些低质量细胞后可视化更新的分布。使用 SC 双峰查找器方法检测可能的双峰。使用命令运行 SC 双峰查找器管道，并将生成的双峰分数分配为新的元数据变量。现在，可视化所有单元格中双峰分数的分布。删除所有双峰分数高于 0.25 的单元格，并将清理后的 Seurat 对象作为 RDS 文件保存在工作目录中。执行数据归一化、缩放和主成分分析。可视化前 50 个主要成分的方差贡献。使用前 13 个主要成分和 0.1 的聚类分辨率对细胞进行聚类。使用前 13 个主成分执行均匀流形近似和投影，或在邻域分析中进行 UMAP 缩减，并将种子数设置为 123。现在，在 UMAP 图上可视化细胞聚类，然后在 UMAP 图上可视化伤口时间和空间注释。然后，生成一个表，将细胞簇与缠绕时间和空间注释相关联。在计算所有簇之间的差异表达基因后确定主要细胞类型身份，并将生成的 DEG 列表分配给变量，然后将它们作为分隔文本文件保存在工作目录中。现在，在电子表格应用程序中打开数据集聚类标记文件。使用文本导入向导将逗号设置为分隔符，并将基因名列格式化为文本，以防止将基因名自动转换为日期。在电子表格中，将平均对数 2 FC 列从大到小进行排名，通过减少对数两倍变化值来对行进行排序，然后是聚类列从最小到最大。要通过增加 Seurat 聚类编号对行进行排序，请过滤平均对数 2 FC 列以仅包含大于或等于 2.5 的值，然后过滤 PCT 1 列以包含大于或等于 0.4 的值。接下来，过滤 PCT 2 列以包含小于或等于 0.2 的值。最后，筛选 P 值调整后的列以包括小于或等于 0.01 的值。现在，打开 Enrichr 基于 Web 的富集分析工具。对于每个簇，将差异表达基因列表复制到单独的富集窗口中，然后单击分析。然后，单击分析输出上方的细胞类型选项卡，并关注三个精选细胞标记数据库中的前五个富集。根据 Enrichr 分析中的顶级扩充，将可能的标识分配给八个聚类。将聚类 2 和 6 组合成一个标记成纤维细胞的注释，并将这些注释分配为名为细胞类型的新元数据变量。 然后，在 UMAP 图上可视化带注释的细胞类型，并在一系列 UMAP 图上显示粗体顶部簇标记基因的定位。在按原始簇数分组的点图上可视化顶部簇标记差异表达的基因，然后在点图中再次可视化顶部标记基因，这次按注释细胞类型分组。要准备时间序列分析，请删除空间注释并简化数据集。将伤口时间和空间元数据重新分配给一个名为 DPW for Days Post Wounding 的新变量。在 UMAP 图上可视化新的 DPW 时程分组，并生成显示每个 DPW 组中每种类型的单元格数量的表格。接下来，将细胞计数转换为比例，以评估愈合过程中细胞类型组成的相对变化，并可视化每种细胞类型中每个 DPW 类别的比例。最后，可视化每个 DPW 组中每种细胞类型的比例，并将包含所有注释和过滤器的最终 Seurat 对象作为 RDS 文件保存到工作目录中。数据集中的所有细胞在 UMAP 图上明显聚集为主要颜色编码的细胞类型，确认基于富集细胞类型特征的注释成功。在 UMAP 图上，顶级簇标记基因的高表达定位于其各自的细胞类型簇内。点图可视化证实，簇标记基因的最高表达水平仅限于其注释的主要细胞类型。堆叠条形图显示，中性粒细胞和巨噬细胞在伤口后第一天占主导地位，而成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞在后期时间点变得更加普遍，反映了已知的伤口愈合细胞级联反应。