用于评估组织样本中皮肤细胞表型和增殖状态的高通量成像和分析工作流程

迭代漂白扩展多重性 （IBEX） 和商业核苷酸标记测定 （Click-iT EdU） 的组合能够在固定冷冻小鼠组织切片中高度动态的过程中检测和分类分裂细胞类型。此外，一种新颖的开源图像处理管道提供了高通量图像采集和分析。

该协议结合了多重光学成像方法，IBEX和Click-iT EDU标记，以检测和分类高度动态过程（例如皮肤修复）中的分裂细胞类型。此外，我们还为高通量图像采集和分析提供了一种新颖的开源成像处理管道。在 24 孔板上涂上 200 微升铬铝明胶，并在摇床摇床上孵育板 15 分钟。

然后完全取出明胶，将涂层孔在 60 度的烤箱中干燥 40 分钟。在低温恒温器上切割 OCT 包埋的组织，厚度为 15 至 30 微米，并将其快速转移到含有 2 毫升 PBS 的包被孔中。使用一毫升移液器小心地取出PBS，旨在使组织切片保持在孔的中心。

为了有效地做到这一点，请从孔的边缘缓慢吸出 PBS，根据需要调整移液器位置以防止组织移动。将组织切片在 37 摄氏度的烤箱中干燥一小时。用一毫升PBS再水化五分钟。

在室温下用 500 微升 0.5% Triton 透化组织 30 分钟。用PBS短暂洗涤组织两次，并在室温下进行Click-iT反应30分钟。保持样品避光。

用PBS短暂洗涤组织两次。在室温下用封闭缓冲液封闭一小时。添加第一个周期的一抗。

并将板在四摄氏度下孵育过夜。用PBS洗涤3次。进行二抗染色。

对于第一个周期，将二抗应用于未偶联的一抗以及核复染剂。将避光样品在室温下孵育 60 分钟。在室温下用一毫升PBS洗涤组织三次，持续五分钟。

在每个孔中留下约 500 微升 PBS，并将板带到显微镜下。在 Meta Express 软件中，点击筛选，然后点击获取设置。单击弹出按钮。

用70%乙醇清洁板底部，然后将板插入显微镜中。单击“加载板”按钮。在物镜和相机选项卡中，选择所需的放大倍率。

作为采集模式，选择共聚焦 51 微米狭缝模式。在“板”选项卡中，选择板模型。转到 Plates Sites Visit 选项卡。

在站点选项下，单击固定数量的站点。设置列数和行数，以便大致覆盖整个孔。单击重叠位点 10%通过右键单击板图上的相应孔仅选择要采集的第一孔。

转到采集自动对焦选项卡。对于孔间自动对焦，请选择板和孔底选项。对于站点自动对焦，请选择“所有站点”选项。

转到“波长”选项卡，然后选择当前周期中要成像的染料数量。转到第一个波长选项卡。选择具有 Z 偏移的激光作为 Z 定位，然后单击“计算偏移”按钮以设置正确的成像高度。

选择样品最清晰对焦的图像。按焦点按钮。显示组织的聚焦图像。

将照明功率设置为 50%将目标最大强度设置为 2000，然后按自动曝光。对于 Z 系列，选择 Z 系列和 2D 投影图像，对于阴影校正，选择仅 FL 阴影。对其他波长重复上述步骤，但不要使用具有 Z 偏移的激光，而是从 W1 选择 Z 偏移并选择零。

转到 Z 系列步骤并输入所需的步骤大小。单击“焦点”按钮。拖动当前位置箭头，直到到达组织底部，然后单击“设置 B”按钮。

将位置箭头拖动到组织顶部，然后单击“设置 T”按钮。单击 F2，停止，再次按 Start Live。左键单击该平台，确保该平台位于第一口井处。

找到组织的边界，并通过右键单击标记所有包含组织的部位进行采集。转到运行选项卡并键入板的名称。单击保存协议。

为所有其他井设置采集区域。运行 Control、Journal、开始录制，然后立即 Control、Journal、停止录制。保存创建的日记帐，然后通过“控制”、“日记”、“编辑日记帐”再次打开它。

在左侧面板中，转到“板采集”，从文件中加载方案，然后单击“板采集”以将这些步骤添加到日志中。双击编辑板采集，从文件加载方案，然后选择为第一个孔保存的方案。对要采集的每个孔重复这些步骤，确保始终加载相应的方案。

单击运行日记帐以开始采集。在日志结束前30分钟，开始准备漂白试剂。将 10 毫克硼氢化锂溶解在 10 毫升双蒸 H2O 中，并通过 0.22 微米过滤器。

静置 10 分钟。溶液应该开始形成气泡。为确保高效漂白，请在制备后四小时内使用漂白试剂。

将漂白溶液加入样品中并孵育 15 分钟，同时将样品暴露在环境光下。组织上应该出现小气泡。用一毫升PBS洗涤漂白的样品三次，每次在室温下洗涤五分钟。

添加下一周期的一抗，并在4摄氏度下孵育过夜。多重 IBEX 成像结合 Click-iT EDU 标记可揭示受伤皮肤中不同的结构和增殖的细胞类型。在石蜡包埋的组织切片上对 KI-67 进行抗体免疫荧光标记，以及使用流式细胞术用 KI 67 标记细胞时，冷冻保存样品上的 EDU 标记显示相似。

使用该协议可以准确检测复杂生物过程中的细胞增殖。而且，开源的映像处理流水线不需要任何编程经验，生成的文件可以用非商业软件处理，比如斐济、quPath等。此外，该协议不需要任何昂贵的设备，因此可以在大多数研究环境中执行。