Name: 黑 腹果蝇 梳理行为的量化以评估过度梳理表型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T13:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: 了解黑腹果蝇梳理行为量化方法，通过RNAi介导的Atg8a基因敲低评估过度梳理表型。该技术适用于神经发育障碍研究，为理解强迫症相关行为机制提供重要模型。

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感谢 John Young 对实验设计的反馈意见，Eric Luth 对手稿的修改，以及 Madeleine Hatfield 在图示设计方面的协助。本工作由西蒙斯大学和生物学系资助。

注意：该实验方案的概述见图1。
1. 拍摄前准备
<ol>
	<li>将四个三孔培养皿并排置于白色表面上，并在每个培养皿上覆盖一块玻璃盖片。</li>
	<li>在培养皿上方放置一台相机（此处使用树莓派系统，但任何能够拍摄高清视频的相机均可）。
	<ol>
		<li>检查确保所有培养皿均处于取景范围内且对焦清晰。</li>
		<li>检查确保盖片上无反光，以免影响对培养皿中果蝇的观察；可通过调整培养皿位置或调暗录制区域的灯光来消除反光。</li>
		<li>使用高分辨率（最低 1920 x 1080 像素）以准确观察果蝇的肢体活动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在进行录制的实验台上标记培养皿和相机的位置。 
	注意：此步骤可减少今后使用该装置时重复进行第 2 步所需的时间。在相同时间、相同空间内进行实验，可减少非预期干预因素引起的果蝇行为变异性。</li>
	<li>将 4–9 日龄的果蝇置于覆盖有 Parafilm 和纸巾的冰块上，进行轻度低温麻醉（使用 CO2 麻醉将显著影响果蝇行为）。
	<ol>
		<li>轻敲果蝇使其落入冰块上，待其麻醉后，立即用画笔将果蝇转移至观察室。 
		注意：转移过程应尽可能迅速，因为长时间暴露于任何形式的麻醉均可能对果蝇产生不利影响。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在每个孔中放入一只果蝇。</li>
	<li>让果蝇在麻醉后适应新环境 30 分钟。此后不得触碰或干扰含有果蝇的培养孔，以免额外应激因素影响其行为。</li>
</ol>
2. 记录果蝇行为
<ol>
	<li>30 分钟适应期后，使用相机记录果蝇行为。</li>
	<li>使用通过 PiSpy11 运行的树莓派相机进行行为数据采集。 
	注意：该软件免费，可在 GitHub 上获取（https://github.com/gpask/PiSpy），&#160;且一套树莓派系统的搭建成本可轻松控制在 300 美元以内。若已有其他相机，也可用于视频录制。</li>
	<li>通过以下命令流程在树莓派上启动录制。
	<ol>
		<li>打开终端，输入 cd PiSpy，然后输入 python3 PiSpy.py，输入所需的录制时长和帧率，选择所需分辨率，点击 Quick Capture。</li>
		<li>使用 Preview Camera 功能确保果蝇处于焦点且清晰可见。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以推荐的 24 fps 帧率录制果蝇行为 10 分钟，并保存文件（PiSpy 会自动将文件保存至 videos 文件夹）。</li>
</ol>
3. 视频分析（图2）
<ol>
	<li>为分析视频，将文件导入 Elan 6.8 软件12。 
	注意：该软件最初为心理语言学研究开发，但可用于对视频进行详细注释，并深入分析理毛行为。</li>
	<li>按照下图所示方式为每一行分配内容，以手动注释个体的视频片段。
	<ol>
		<li>按照以下命令流程操作：层级 &#62; 添加新层级 &#62; 在“层级名称”中输入培养皿中的位置 &#62; 添加。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据研究需求，记录并量化各种特定行为（前部理毛、后部理毛、行走、睡眠和站立）。
	<ol>
		<li>按照以下步骤进行注释。
		<ol>
			<li>双击需要注释的层级。右键单击并沿所选层级拖动光标，选择表现出单次理毛行为的时间段。左键单击，选择新建注释，然后双击新高亮的时间段。输入该时间点所表现行为的缩写。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>缓慢观察视频，使用鼠标逐帧浏览并进行注释。在注释过程中放大单个果蝇的图像，以避免错误识别行为。这些可能包括果蝇触碰玻璃边缘或腿部轻微移动，这些动作初看可能类似理毛行为。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成视频的全部注释后，获取每种行为的详细统计信息。确保在整个视频中使用相同的缩写或注释，以便使用此功能。 
	注意：Elan 6.8 将提供行为发生的次数、行为的总持续时间以及每种行为的平均持续时间。
	<ol>
		<li>将连续2秒不间断的理毛定义为一次理毛行为。按以下方式识别每种观察到的行为。在实验开始前，需预先定义解剖区域的参数。
		<ol>
			<li>前部理毛：将果蝇身体前部区域进行的理毛行为识别为前部理毛。 
			注意：该行为几乎总是涉及果蝇用前两对腿摩擦身体前部，如头部或喙部。</li>
			<li>后部理毛：将果蝇身体前后端区域进行的理毛行为识别为后部理毛。 
			注意：为简化起见，翅膀也被归入后部区域。该行为几乎总是涉及果蝇用中间和最末端的一对腿进行摩擦。一个明显的后部理毛行为特征是，从表面上看，果蝇可能看起来像是缺失了最末端的一对腿，如图2D所示。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mueller, J. M., Zhang, N., Carlson, J. M., Simpson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+and+variability+in+Drosophila+grooming+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Variation and variability in Drosophila grooming behavior.</a> Front Behav Neurosci. 15, 769372(2022).</li>
<li>Szebenyi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleaning+behaviour+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Behav%22%5BJournal%5D)">Cleaning behaviour in Drosophila melanogaster.</a> Anim Behav. 17 (4), 641-651 (1969).</li>
<li>Seeds, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suppression+hierarchy+among+competing+motor+programs+drives+sequential+grooming+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila.</a> Elife. 3, e02951(2014).</li>
<li>Ringo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+flies+keep+clean%3F+Head+grooming+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethol%22%5BJournal%5D)">How do flies keep clean? Head grooming in Drosophila.</a> J Ethol. 38, 167-172 (2020).</li>
<li>Feusner, J. D., Hembacher, E., Phillips, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+who+couldn%27t+stop+washing%3A+pathologic+grooming+in+animals+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Spectr%22%5BJournal%5D)">The mouse who couldn't stop washing: pathologic grooming in animals and humans.</a> CNS Spectr. 14 (9), 503-513 (2009).</li>
<li>Berridge, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+super-stereotypy+of+an+instinctive+fixed+action+pattern+in+hyper-dopaminergic+mutant+mice%3A+a+model+of+obsessive+compulsive+disorder+and+Tourette%27s%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequential super-stereotypy of an instinctive fixed action pattern in hyper-dopaminergic mutant mice: a model of obsessive compulsive disorder and Tourette's.</a> BMC Biol. 3, 4(2005).</li>
<li>Russo, A., Diantonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnd%2FDLK+is+a+critical+target+of+FMRP+responsible+for+neurodevelopmental+and+behavior+defects+in+the+Drosophila+model+of+Fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Wnd/DLK is a critical target of FMRP responsible for neurodevelopmental and behavior defects in the Drosophila model of Fragile X syndrome.</a> Cell Rep. 28, 2581-2593.e5 (2019).</li>
<li>Andrew, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+motor-behavior+abnormalities+in+two+Drosophila+models+of+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders.</a> J Neurogenet. 35 (1), 1-22 (2021).</li>
<li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA-+and+acetylcholine-related+gene+expression+in+blood+correlate+with+tic+severity+and+microarray+evidence+for+alternative+splicing+in+Tourette+syndrome%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">GABA- and acetylcholine-related gene expression in blood correlate with tic severity and microarray evidence for alternative splicing in Tourette syndrome: a pilot study.</a> Brain Res. 1381, 228-236 (2011).</li>
<li>Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Drosophila+grooming+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantification of Drosophila grooming behavior.</a> J Vis Exp. 125, e55231(2017).</li>
<li>Morris, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiSpy%3A+an+affordable%2C+accessible%2C+and+flexible+imaging+platform+for+the+automated+observation+of+organismal+biology+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PiSpy: an affordable, accessible, and flexible imaging platform for the automated observation of organismal biology and behavior.</a> PLoS One. 17 (10), e0276652(2022).</li>
<li>ELAN (Version 6.8) [Computer software]. Nijmegen: Max Planck Institute for Psycholinguistics, The Language Archive. , Nijmegen: Max Planck Institute for Psycholinguistics, The Language Archive. At 
 <a target="_blank" href="https://archive.mpi.nl/tla/elan&#34">https://archive.mpi.nl/tla/elan&#34</a> (2024).</li>
<li>Müller, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tourette%27s+syndrome%3A+clinical+features%2C+pathophysiology%2C+and+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Dialogues+Clin+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tourette's syndrome: clinical features, pathophysiology, and therapeutic approaches.</a> Dialogues Clin Neurosci. 9 (2), 161-171 (2007).</li>
<li>Southall, T. D., Elliott, D. A., Brand, A. H. The GAL4 system: a versatile toolkit for gene expression in Drosophila. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSouthall%2C+TD+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22">Cold Spring Harb Protoc</a>. 2008, (2008).</li>
<li>Hatfield, T., Johnson, S. Knockdown of the GABARAP ortholog Atg8a elicits deficits in learning and promotes obsessive behaviors in Drosophila melanogaster. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHatfield%2C+T+%22MicroPubl+Biol%22">MicroPubl Biol</a>. 2024, (2024).</li>
<li>Bartholomew, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+climbing+and+flight+behaviour+in+Drosophila+melanogaster+following+carbon+dioxide+anaesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia.</a> Sci Rep. 5, 15298(2015).</li>
<li>Sindhurakar, A., Butensky, S. D., Carmel, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+forelimb+tasks+for+rodents%3A+current+advantages+and+limitations%2C+and+future+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Automated forelimb tasks for rodents: current advantages and limitations, and future promise.</a> Neurorehabil Neural Repair. 33 (7), 503-512 (2019).</li>
<li>Qiao, B., Li, C., Allen, V. W., Shirasu-Hiza, M., Syed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+long-term+grooming+behavior+in+Drosophila+using+a+k-nearest+neighbors+classifier%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of long-term grooming behavior in Drosophila using a k-nearest neighbors classifier.</a> Elife. 7, e34497(2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

总体而言，这种易于执行且成本效益高的检测方法可对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的梳理行为进行可靠的表征。该技术能够深入分析大量已知梳理行为的发生频率、持续时间以及在身体解剖区域上的分布情况。一个良好的指标是梳理行为即将发生或正在进行的标志，即果蝇腿部位置的变化，特别是六条腿中任意一条腿的抬起。特别关注腿部运动之后的行为，有助于识别梳理行为。本检测方法支持从总体梳理行为到特定解剖区域的刻板梳理行为的注释，例如针对翅膀、头部或腿部的梳理行为。根据研究需求，这些行为可选择性地纳入或忽略。在本文提供的代表性数据中，我们以强迫性梳理行为作为代表指标，用于反映与图雷特综合征等神经发育障碍相关的强迫/强迫性行为。此外，还可收集其他数据，例如果蝇在培养皿中的行走模式、睡眠时间以及跌倒频率等信息。
除了需要配备相机或拟购买的目标相机外，该检测方法成本较低，且使用了实验室中常见的工具。可根据研究需求或现有材料对实验装置进行额外调整，尤其是构建观察室时。
在进行实验时，必须避免使用标准的二氧化碳麻醉剂，...

黑腹果蝇 是一种在行为学和神经生物学研究中广泛使用的模式生物，有助于揭示驱动类似人类行为的机制。该生物的自我理毛行为具有高度的调控性和明确的行为特征，遵循可清晰区分的刻板模式。1果蝇表现出的独立梳理行为通常可根据解剖区域进行分类2，最简单的方式是定义为后部或前部。 果蝇 梳理行为最初将集中于前部区域，随后转移至后端3在正常情况下，果蝇会表现出梳理行为以保持身体清洁（例如去除灰尘），并在暴露于潜在有害的外界刺激（如致病性微生物）时发生此类行为。4.
梳理行为异常，特别是自发的强迫性梳理行为，已在多种模型系统中被用作评估强迫和/或强迫性行为的指标。在啮齿类、鸟类和犬类等生物中观察到的强迫性梳理行为的转化研究成果，为理解引发人类类似强迫行为的病症提供了线索5。这些病症包括拔毛癖、强迫症以及图雷特综合征6。过度梳理行为也已被用作评估黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中类似神经发育障碍模型行为表型的基准。在脆性X综合征（FSX）及相关自闭症谱系障碍（ASD）的果蝇模型中已观察到强迫性梳理行为。在dfmr1基因发生突变时会出现过度的自发性梳理行为，该基因是与ASD和FSX相关的FMR1基因的直系同源物7。此外，这些突变体在身体前段与后段的梳理分布上也表现出显著变化8。这些变化被认为反映了部分患有上述疾病的患者所表现出的以身体为中心的强迫性和强迫性行为。在使用本文所述的梳理行为检测方法时，我们观察了通过商用GAL4驱动系和UAS-RNAi品系介导的Drosophila基因Atg8a RNAi敲低后果蝇的梳理行为9。
该方法涉及对果蝇特定梳理行为的视频进行人工标注。以往旨在评估梳理行为的研究，例如使用染料等间接方法，虽然能够有效量化梳理效果，但无法测量梳理的持续时间或频率10。然而，本实验方法可对Drosophila的梳理频率和持续时间进行量化，既可进行总体分析，也可按解剖区域分别分析。本文详述的方法相较于当前的自动化方法具有一些优势，因其易于修改，且无需计算背景知识的研究人员亦可操作。所需设备在大多数实验室中均易于获取，因此本方法提供了一种经济高效的方式来评估是否存在过度自我梳理的表型（见材料表）。这使得该方法特别适用于以本科生为主的科研机构，并可轻松适应培训环境或教学实验室的需求。

<table><tbody><tr><td>16 GB Micro SD 卡</td><td>Adafruit</td><td>1294</td><td>用于安装操作系统</td></tr><tr><td>显示屏</td><td>Adafruit</td><td>3578</td><td>任何可通过 HDMI 或柔性电缆连接的显示屏均可满足需求</td></tr><tr><td>Drosophila Atg8a-RNAi UAS 品系</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>34340</td><td>用于代表性数据的果蝇品系</td></tr><tr><td>Drosophila Ok6 驱动品系</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于代表性数据的果蝇品系</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>用于限制果蝇活动范围</td></tr><tr><td>散热片</td><td>Adafruit</td><td></td><td>防止计算机过热</td></tr><tr><td>镜头</td><td>Adafruit</td><td>4563</td><td>仅与高清摄像头配合使用</td></tr><tr><td>PiCamera</td><td>Adafruit</td><td>4561</td><td>此处使用了高清版本，但在预算受限时也可使用标准摄像头</td></tr><tr><td>Raspberry Pi 4</td><td>Adafruit</td><td>4292</td><td>PiSpy 系统运行所用的计算机</td></tr><tr><td>排线电缆</td><td>Adafruit</td><td>1648</td><td>用于连接摄像头与显示屏</td></tr><tr><td>SB 组件外壳</td><td>Adafruit</td><td>4301</td><td>用于保护计算机</td></tr><tr><td>点样板</td><td>Fisher Scientific</td><td>S99406</td><td>我们已有 Pyrex 材质的版本可供使用，但细胞培养皿或塑料点样板同样适用</td></tr><tr><td>三脚架</td><td>Best Buy</td><td>6355959</td><td>用于悬挂和定位摄像头，任何具备此功能的装置均可满足需求</td></tr><tr><td>USB C 电源适配器</td><td>Adafruit</td><td>1995</td><td>为计算机供电</td></tr></tbody></table>

drosophila melanogaster 过度梳理行为表型评估中的梳理行为量化方法

Quantification of Drosophila melanogaster Grooming Behavior for Evaluation of Excessive Grooming Phenotypes

在模式生物中，刻板理毛行为的可观测变化被广泛应用于转化研究。这些变化代表了可引发人类类似行为异常的病理状态；例如，过度理毛行为可作为图雷特综合征或强迫症等疾病中强迫性和重复性行为的替代指标。Drosophila melanogaster 的理毛实验可用于评估异常的自我理毛表型。实验中，果蝇被连续记录10分钟，随后由观察者在盲法条件下对预先定义的理毛行为进行观察和标注。通过手动标注视频片段，可获得理毛行为发作频率及自我理毛持续时间的定量数据。该实验成本相对较低，所需材料大多为实验室常规配备，且易于根据特定研究需求进行调整。此外，与依赖复杂计算机技术的自动化方法相比，该实验操作技术要求较低，因此特别适用于小型实验室和学生实验教学。本文详细讨论了实施该实验所需的具体步骤及其当前存在的局限性。

该实验可生成定量数据，用于测量经标注视频中理毛行为的时间和频率。代表性的实验装置图像及行为定义方式如图所示。 图2鉴于视频分析可能引入的主观性，所有视频的标注工作应对进行分析的研究人员设盲。
本方法用于评估Drosophila基因Atg8a在梳理行为发育中的作用。Atg8a与人类基因GABARAP为同源基因，后者在部分图雷特综合征（TS）患者中表现出表达水平降低9。TS是一种以不自主运动和发声（称为抽动）为特征的疾病，常与其他引发强迫/强迫性行为的疾病共病13。我们旨在通过利用TS及其他神经发育模型中常见的行为标志——强迫性梳理行为，来理解这种表达水平的降低如何影响该神经发育疾病的发展。通过比较利用Gal4-UAS系统14构建的Atg8a RNAi介导敲低突变体与其相应的UAS品系和Gal4驱...

本文所述方法涉及对Drosophila melanogaster特定梳理行为所获视频资料进行人工标注。该方法可用于量化梳理行为的发作次数以及总体梳理时间，以评估是否存在非典型的自我梳理表型。

Drosophila melanogaster 过度梳理行为表型评估中的梳理行为量化方法

在模式生物中，刻板理毛行为的可观测变化被应用于转化研究。这些变化代表了引发……的病理特征。

本研究通过RNAi介导的Atg8a基因敲降，模拟图雷特综合征患者中观察到的GABARAP功能缺陷，评估黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的理毛行为。我们旨在阐明aAtg8a在行为发育中的作用，从而深入理解其人类同源蛋白在神经行为过程中的调控功能。目前，采用人工注释方法存在若干实验挑战，包括复杂的分析流程（如视频注释与审阅）以及人工注释过程中固有的主观性。自动化方法也面临一些挑战，包括需要具备较强的计算机科学专业知识才能有效实施和操作。我们发现，基因 Atg8a 在果蝇行为发育中所起的作用超出了此前已知的范围。更具体而言，我们发现该基因同时调控梳理行为和学习能力，提示 Atg8a 的同源基因可能在其他生物中也具有类似功能。该技术可直接定量分析果蝇的梳理行为频率及分布情况。对于无法使用自动化方法的实验室而言，此方法尤为适用，且相较于基于染料的间接方法，可实现更详细的分析。总体而言，本研究推动了果蝇作为研究伴有强迫行为的神经发育障碍（如抽动秽语综合征）模型生物的应用。此外，这还增加了自噬相关蛋白在行为发育中发挥作用的越来越多的证据。首先，将四个三孔培养皿并排置于白色表面上，每个培养皿上覆盖一块玻璃盖片。将相机置于培养皿上方。确保载玻片上无反光，以免影响观察培养皿中果蝇的可见度；必要时调整培养皿位置或调暗灯光以消除反光。现在，在进行录像的实验台面上标记培养皿和相机的位置。将四至九日龄的果蝇置于覆盖有Parafilm和纸巾的冰块上，进行轻微麻醉。麻醉后，应尽快使用画笔将果蝇转移至观察室。在三孔板的每个孔中各放置一只果蝇，操作时需尽量轻柔，以避免干扰果蝇，防止引发应激相关的行为改变。在麻醉后让果蝇适应环境30分钟，随后使用相机记录果蝇行为，然后打开终端并输入 cd PiSpy。输入 python3 PiSpy.py，然后输入所需的录制时长和帧率。选择所需的分辨率，然后单击快速捕获。现在使用 Pi Spy 中的预览相机功能，确保果蝇处于焦点且清晰可见。以推荐的每秒 24 帧的帧率录制果蝇活动 10 分钟，并保存文件。为分析视频，将文件导入 ELAN 6.8 软件，对梳理行为进行详细标注和深入分析。选择层级，添加新层级，在层级名称中输入培养皿中的位置信息，并进行添加，以将每一行分配用于手动标注个体的行为片段。要标注行为，需双击待标注的层级，右键单击并沿该层级拖动光标，划定个体表现出单次理毛行为的时段。单击以选择新的标注区域，然后双击新高亮的时间段，输入在该时间点所观察到行为的缩写。视频完成注释后，点击“查看”，然后选择“注释统计”，以获取每种行为的详细分类。将发生于果蝇身体前部区域的 grooming 行为识别为前部 grooming；将发生于果蝇身体前后端区域的 grooming 行为识别为后部 grooming。与对照组相比，Atg8a RNAi 突变体的理毛行为持续时间显著增加。Atg8a RNAi 突变体用于理毛的时间也显著高于对照组。在前部与后部理毛行为的分布上未观察到显著差异。

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