使用迭代漂白对荷瘤组织进行三维成像扩展了多重方法
2025年4月25日
本文介绍了一种多重免疫荧光方案，该方案经过优化以表征腹膜转移的三维结构。
本研究的重点是确定免疫调节药物和复杂实体胃肠道肿瘤的靶点。分析肿瘤微环境细胞景观对于了解免疫疗法等治疗的敏感性绝对至关重要。单细胞测序和流式细胞术有助于表征肿瘤微环境，但缺乏空间背景。最近，出现了多重成像和转录组学平台，以研究体内肿瘤微环境。
用于分析肿瘤微环境的可用多重技术，无论是迭代的还是多合一的，都仅限于两个维度。该协议将表征扩展到深度维度，提供超越单个FFPE或冷冻切片的见解。
[旁白]首先，将薄纸转移到装有温收获培养基的样品杯中，并将其放在制备台的加热板上。将组织安装在含有收获培养基的 15 厘米板中的平台上。小心地将荷瘤组织覆盖在平台上的小孔口侧，中间皮侧朝上，并用 2-0 丝缝线固定。将准备好的组织平台反向完全浸没在含有收获培养基的 24 孔板中。对于固定，将 10 毫升固定液添加到含有 30 毫升冷 PBS 的 50 毫升锥形管中，以制备 40 毫升固定缓冲液。使用镊子，将安装在平台上的组织转移到固定缓冲液中。并在4摄氏度下孵育24小时。倒出固定剂。用 40 毫升冷 PBS 代替。并在4摄氏度下孵育10分钟。对于染色，将 1 毫升封闭缓冲液加入孔中并插入组织平台。在室温下将摇杆设置为 30 RPM 的低速上阻挡至少两个小时。在微量离心管中制备0.8毫升抗体染料溶液，并在室温下以10,000g离心两分钟。将 0.75 毫升上清液转移到 9 孔孵育板的干净孔中。并插入一个洗过的平台。用铝箔纸包裹盘子。并在室温下在设置为 30 RPM 的低速摇杆上孵育至少两个小时。在含有 40 毫升 PBS 的 50 毫升锥形管中在 4 摄氏度下清洗平台 10 分钟。将0.1毫升PBS加入3.5厘米成像盘的玻璃底部中心，并将其放在一边。将高度调节环顺时针方向松散地拧入外盖。并将平台安装在内部塑料支架中，确保槽口对齐。用滑块固定平台。将组装好的成像适配器放在玻璃底盘上，小心地降低高度调节环，直到组织接触缓冲液。一旦达到与玻璃的最佳距离，将 0.2 毫升 PBS 添加到组织上，底部朝上，以防止成像过程中组织脱水。启动图像采集软件。选择合适的物镜，例如 20X 或 40X，并添加相应的浸入介质。选择图像采集参数，例如 600 赫兹的扫描速度、1024 x 1024 像素的 XY 分辨率、三线平均值和双向扫描。选择合适的激光线或调整白光激光以匹配用于染色的荧光团的激发和发射光谱。将组装好的成像皿放入显微镜载物台上的样品架中。使用 XY 控件将样品居中，将物镜带到盖板玻璃上，然后开始图像采集。每轮成像后，执行漂白步骤。在蒸馏水中制备5毫升每毫升1.5毫克硼氢化锂溶液，在室温下孵育30分钟。将 1 毫升硼氢化锂溶液转移到 9 孔孵育板的干净孔中，并在室温下插入洗涤平台 60 分钟。在锥形管内用 20 毫升 PBS 短暂清洗平台。使用Z补偿的最高激光设置检查剩余的荧光信号。用第一轮迭代漂白染色的荷瘤腹膜样本扩展多重性或IBEX 1，用于可视化的面板如下图所示。肿瘤病变被鉴定为玫瑰花状结构，对 CD44 和足拉宁呈双阳性，具有状间皮瘤的核排列特征。此处显示了荷瘤腹膜样本中选定区域的高分辨率免疫荧光图像。 这些图像揭示了肿瘤区域和肿瘤三级淋巴结构界面，突出了高密度 CD45 阳性细胞的一致免疫细胞浸润。该图显示了IBEX第一至第六周期的迭代免疫荧光染色，说明了肿瘤病灶和肿瘤三级淋巴结构界面内免疫和结构标志物的空间分布。此处显示了不同光学截面的最大投影。这种 3D 成像证实了肿瘤病变和三级淋巴结构位于不同的 Z 深度，证明了 2D 成像在捕捉复杂组织结构方面的局限性。
概述
本文描述了一种多重免疫荧光协议，该协议针对腹膜转移的三维结构进行了优化。研究强调了分析肿瘤微环境以增强对治疗敏感性的理解的重要性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 免疫学
背景
- 了解肿瘤微环境对免疫疗法至关重要。
- 传统方法在分析肿瘤时缺乏空间背景。
- 多重成像技术已出现以解决这些局限性。
- 该协议将特征分析延伸到深度维度。
研究目的
- 优化多重免疫荧光协议。
- 表征腹膜转移的三维结构。
- 提供对肿瘤微环境的洞察。
使用的方法
- 肿瘤组织的转移和固定。
- 用抗体染料溶液进行阻断和染色。
- 使用先进显微技术进行图像获取。
- 迭代漂白步骤以增强多重性。
主要结果
- 用特定标记识别肿瘤病变。
- 可视化肿瘤区域中的免疫细胞浸润。
- 展示了超越2D局限性的3D成像能力。
- 对免疫和结构标记的空间分布的洞察。
结论
- 该协议有效地捕捉了肿瘤结构的复杂性。
- 多重成像为免疫疗法研究提供了宝贵的洞察。
- 进一步的应用可以增强对肿瘤生物学的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Three-dimensional multiplex immunofluorescence imaging of tumor-bearing tissue enables comprehensive spatial mapping of the tumor microenvironment, directly addressing a critical bottleneck in immuno-oncology discovery. By resolving the distribution of immune, stromal, and tumor cell populations in situ, this approach enhances predictive confidence for target validation and therapeutic hypothesis testing. The IBEX protocol's ability to interrogate intact tissue architecture supports risk-adjusted portfolio decisions at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatially resolved interrogation of immune and tumor cell interactions within native tissue architecture.
- Supports mechanistic de-risking by revealing cellular heterogeneity and microenvironmental context.
- Improves predictive confidence for immunomodulatory target selection and validation.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated, multiplexed tissue systems for downstream phenotypic screening.
- Delivers quantitative, reproducible marker expression data across multiple cell types and tissue depths.
- Enables assay standardization and scalability for high-content imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical tissue analysis with disease-relevant human tumor microenvironments.
- Supports translational biomarker discovery by mapping immune infiltration and tertiary lymphoid structures in 3D.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by maintaining spatial context.
Pipeline & Workflow Integration
This IBEX-based imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational tissue analysis.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing by enabling spatial mapping of cell populations and interactions.
- Screening: Supplies multiplexed, quantitative readouts for robust assay development and compound evaluation.
- Analytics: Generates high-resolution, multi-marker datasets for comparative analysis of tissue regions and conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to clinically relevant tissue architectures and biomarker landscapes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform for diverse tumor models and immune-oncology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes multiplex imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation by clarifying biological context.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immuno-oncology assets based on spatial tissue insights.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiplex immunofluorescence and confocal microscopy.
- Demands access to advanced imaging platforms and custom mounting hardware.
- Necessitates cross-team standardization of staining panels and imaging parameters.
- Adaptation may be needed for different tissue types or disease models.
- Imaging depth and marker multiplexity are limited by tissue properties and fluorophore compatibility.
