Name: 使用迭代漂白对荷瘤组织进行三维成像扩展了多重方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 了解迭代漂白多重免疫荧光技术用于表征腹膜转移瘤的三维结构。该方法通过组织固定、抗体染色和高级显微成像，揭示肿瘤微环境中免疫细胞的浸润模式，为免疫治疗研究提供空间分布信息。

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本研究得到了美国国立卫生研究院和国家癌症研究所（NCI）院内研究计划的支持。本研究还部分得到了由NIAID与NCI合作开展的研究项目CAT-I（由Ronald Germain领导）的支持。我们衷心感谢Andrea Radtke所付出的积极协作努力，她的专业专长极大地促进了本研究的开展。

本研究经美国国立卫生研究院机构审查委员会批准，批准号为 NCT01915225。人体组织在诊断性腹腔镜手术时，经书面知情同意后获取。所有组织均带有肿瘤，通过肉眼观察确定，并经最终组织病理学检查证实。所用全部试剂和设备的详细信息列于材料表中。图1提供了整个实验流程的示意图。
1. 打印平台、成像适配器和培养板
<ol>
	<li>平台和9孔板部件的切片/3D打印/后处理流程（如图2A-C所示）
	<ol>
		<li>切片：打开切片软件，导入.STL格式的设计文件（补充文件1和补充文件2）。调整模型方向以实现最佳打印效果，并添加支撑结构。选择医用级打印机，选择透明树脂，设置层高为50 µm。检查可打印性，然后将任务发送至打印机。</li>
		<li>3D打印：确认打印机已准备就绪（树脂盒、料槽和平台安装正确）。在打印机触摸屏上选择来自切片软件的已上传任务以开始打印。打印完成后，使用拆卸工具将打印件从平台上取下。</li>
		<li>后处理：将打印件放入装有99%异丙醇（IPA）的清洗装置中清洗15分钟。从清洗装置中取出部件，再在新鲜IPA中浸泡5分钟。</li>
		<li>在60 °C条件下对部件进行60分钟的后固化处理。使用平口钳去除支撑结构。如有需要，可用细粒度砂纸打磨残留的支撑痕迹。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>高度调节器和外盖的切片/3D打印/后处理流程（如图2A-C所示）
	<ol>
		<li>切片：打开打印软件，导入.STL格式的设计文件（补充文件3和补充文件4）。调整模型方向并分配材料。选择所需的打印模式（高混合、高速），并将模型表面处理设置为哑光。检查可打印性，然后将任务发送至打印机。</li>
		<li>3D打印：确保打印机已装载正确的材料，并且构建托盘清洁无污。在打印机的监控界面中选择已上传任务以开始打印。打印完成后，使用刮刀工具小心地将打印件从构建托盘上取下。</li>
		<li>后处理：将打印件放入水射流清洗机或振荡清洗系统中，以去除支撑材料。如有必要，可使用镊子或钳子等工具手动清除残留支撑。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>平台滑块的激光切割（如图2A、C所示）
	<ol>
		<li>设计准备：在矢量软件中导入*.DWG设计文件（补充文件5）。将线条颜色设置为红色（RGB），用于矢量切割。将任务发送至激光切割机。</li>
		<li>设置激光切割机：打开激光切割软件并导入设计文件。选择材料类型，并根据厚度为1/32&#34;的亚克力板调整功率、速度和分辨率参数。将材料放置在激光工作台上，确保其对齐正确，并调整激光焦距。</li>
		<li>激光切割：启动激光切割过程，并进行监控以确保材料被正确切割。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在打印平台上固定组织
<ol>
	<li>收获培养基的制备与操作台准备
	<ol>
		<li>在100 mL DMEM（低糖）中添加Anti-Anti，并置于37 °C培养箱中预热，待用（即收获培养基）。</li>
		<li>在手术室内设置一个&#34;操作台&#34;，配备以下物品：经高压灭菌的3D打印平台、一包2-0丝线结扎线、加热板、装有50 mL预热收获培养基的样本杯、一个含30 mL预热收获培养基的15 cm培养皿，以及一个24孔板（其中4个孔各含1.5 mL收获培养基）（将上述所有物品置于加热板上）、一把镊子和一把手术剪。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织切除与固定 
	注意：组织来源于手术室。通过肉眼观察识别腹膜上肿瘤病灶区域，其厚度和直径均小于0.5 mm（图2D）。需要注意的是，每制备一个平台约需2 cm2组织（腹膜）。
	<ol>
		<li>由外科医生小心地将带有肿瘤的腹膜从下方的腹壁肌肉和筋膜分离。将分离后的组织片转移至含有温热收获培养基的样本杯中，并放置于加热板上的操作台。</li>
		<li>将组织固定在含有收获培养基的15 cm培养皿中的平台上。小心地将带瘤组织（间皮面朝上）覆盖在平台的小孔侧，并用2-0丝线缝合固定。将已固定的组织平台倒置（浸没）放入含有收获培养基的24孔板中（图2E-G）。 
		注意：组织应充分拉平以避免平台表面出现皱褶，但不可过度牵拉产生张力，以免引发不必要的生物力学和生理变化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 固定/染色/漂白步骤
注意：针对 4 µm 厚的 FFPE 或固定冷冻切片进行的原方案修改详见图 3。表 1列出了用于 IBEX 第 1-6 轮的抗体（及其稀释比例）。
<ol>
	<li>固定
	<ol>
		<li>在含有 30 mL 冷的 1× PBS 的 50 mL 圆锥管中加入 10 mL 固定剂原液，配制 40 mL 固定缓冲液。</li>
		<li>使用镊子将安装在平台上的组织转移至固定缓冲液中，在 4 °C 下孵育 24 小时。</li>
		<li>倾去固定液，加入 40 mL 冷的 1× PBS，于 4 °C 下孵育 10 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色
	<ol>
		<li>在每个孔中加入 1 mL 封闭缓冲液（含 1% BSA、0.3% Triton-X-100 和 1% Fc Block 的 1× PBS，经 0.22 µm 滤器过滤），插入组织平台，在室温下以低速（30 rpm）摇床封闭至少 2 小时。 
		注意：确保平台上的缺口与孔壁凹槽对齐。此步骤对时间不敏感，也可在 4 °C 下过夜进行。</li>
		<li>在微量离心管中配制 0.8 mL 抗体/染料溶液，在室温下以 10,000 × g 离心 5 分钟。将 0.75 mL 上清液转移至 9 孔孵育板的洁净孔中，并插入已清洗的平台。</li>
		<li>用铝箔包裹孵育板，在室温下以低速（30 rpm）摇床孵育至少 2 小时。</li>
		<li>将平台置于含 40 mL 1× PBS 的 50 mL 圆锥管中，在 4 °C 下清洗 10 分钟。此时平台已准备好插入成像适配器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>漂白
	<ol>
		<li>每轮染色和成像后，使用酯还原剂硼氢化锂（LiBH4）对荧光染料进行漂白。该处理可消除 Alexa Fluor (AF)488、AF647 和 AF750 的荧光信号，但对 AF594 和核染料 Hoechst 的信号无影响。 
		警告：硼氢化锂与水剧烈反应，接触水时会释放易燃氢气；使用过的硼氢化锂及被其污染的废弃物需作为危险废物处理。</li>
		<li>在通风橱中用蒸馏水配制 5 mL 浓度为 1.5 mg/mL 的 LiBH4 溶液，在室温下孵育 30 分钟。 
		注意：LiBH4 溶液若在使用前超过 &#62;4 小时配制，其还原/漂白效果将显著降低。</li>
		<li>将 1 mL LiBH4 溶液转移至 9 孔孵育板的洁净孔中，插入已清洗的平台，在室温下孵育 60 分钟。</li>
		<li>将平台在锥形管中用 20 mL 1× PBS 快速清洗一次，并使用上一轮成像中用于 Z 轴补偿的最高激光设置检测残留荧光信号，确认后方可进行下一轮染色。</li>
		<li>在进入下一轮抗体孵育前，重复在室温下封闭样本 2 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 成像步骤
<ol>
	<li>成像适配器/平台的组装
	<ol>
		<li>向3.5 cm成像培养皿的玻璃底部中央加入0.1 mL的1×PBS，备用。将高度调节环顺时针松松地旋入外盖，然后将平台安装到内层塑料支架中（对准缺口与凹槽），并用滑块固定平台。</li>
		<li>将组装好的成像适配器放置在玻璃底培养皿上，小心降低高度调节环，直至组织接触缓冲液。避免平台在玻璃底部发生旋转。</li>
		<li>当达到与玻璃之间的最佳距离后，向组织（此时底面朝上）上添加0.2 mL的1×PBS，以防止成像过程中组织脱水。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>共聚焦成像
	<ol>
		<li>开启倒置共聚焦显微镜的所有组件，包括计算机、显微镜、激光器以及用于目镜观察的LED光源。启动图像采集软件。</li>
		<li>选择合适的物镜（例如20x或40x），并添加相应的浸没介质。例如，本研究使用20x水镜；为防止长时间图像采集过程中干燥，需向物镜添加约200 µL的水。</li>
		<li>将组装好的成像培养皿放入显微镜载物台的样品架中，并确保样品固定牢固（不移动）。 
		注意：将组装好的样品放置在显微镜载物台上时，应注意缺口位置，并在后续重复操作中使用相同位置，以方便图像对齐。保持成像适配器处于最佳高度设置对于连续多轮成像至关重要。</li>
		<li>使用X-Y控制将样品居中，并将物镜升至盖玻片位置。通过目镜观察，并以Hoechst信号作为参考，调节物镜以实现组织的精细对焦。</li>
		<li>选择合适的激光线或调节白光激光器（WLL）至所用荧光染料的激发和发射光谱。通过调整设置消除通道间的信号重叠；若荧光染料的激发光谱相近，则应分步采集序列图像。</li>
		<li>选择以下图像采集参数：扫描速度600 Hz，XY分辨率1024 × 1024，3线平均，以及双向扫描。</li>
		<li>选择以下Z栈参数：（1）根据所用物镜优化Z步进大小，（2）定义Z栈的起始与终止位置，（3）调整Z补偿参数以确保整个Z栈亮度均匀，（4）采集一个平均值为1的单视野测试Z栈。</li>
		<li>定义待成像区域，并采集高分辨率的多视野Z栈图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

目前的多重荧光成像技术仅限于薄切片，无法提供三维结构信息。本研究描述了一种将IBEX成像方法16,17应用于完整肿瘤组织的实验方案，肿瘤组织被固定在定制设计的载样平台上。选择腹膜肿瘤病灶来展示该技术，因为患者通常存在多个大小适宜的肿瘤病灶，在全球大多数三级转诊中心进行的标准细胞减灭术中，这些病灶会连同周围正常腹膜组织一并切除22,23。然而，该方案同样适用于实质器官转移灶和小鼠模型肿瘤，使用此前已报道的肿瘤切片即可完成24,25。此外，载样平台上的固定环直径可根据实验或组织需求进行调整，但较大的区域容易导致组织下垂并延长成像时间。无论组织来源和大小如何，从获取组织到保存的时间必须尽可能缩短，以确保最佳质量26。在手术室内设置准备台可确保涉及患者样本时能够及时处理。应记录从组织获取到固定的全过程时间，以保证不同实验之间的可比性。
通过IBEX方案获取组织样本时采用整体封片方式，即在组织完整附着于载样平台的条件下进行固定、成像以及漂白等步骤。这种方法可确保样本在反复进行染色/成像/漂白循环过程中的完整性，避免了因存在半永久性切片-玻片界面或反复加盖/移除盖玻片而导致的组织丢失。为减少试剂消耗，特制的9孔板可确保载样平台与孔壁之间达到最佳贴合，从而将无效体积&#34;dead volume&#34;降至最低。所有用于染色的抗体均为直接标记的一抗，所用的荧光染料偶联物（Hoechst染料除外）均为Alexa Fluor系列染料，因其具有优异的荧光亮度而被选用27。其他荧光染料。抗体组合方案的设计依据来自IBEX成像社区所提交的数据，该社区是一个开放的全球性资源库，收集了国际范围内使用IBEX技术的科研人员所提供的数据集、实验方案及反馈信息（https://ibeximagingcommunity.github.io/ibex_imaging_knowledge_base/）。抗体组合的循环顺序经过精心设计，通常情况下，低丰度靶标被安排在较早的循环中。其中IBEX第1轮循环（CD45、CD44和Podoplanin）为例外，因这三个标志物在初始染色轮次中用于识别肿瘤病灶。
抗体组合的规模相对较小，以减少在高激光强度设置下产生的通道串扰，而高激光强度是使用共聚焦显微镜对组织深层成像所必需的。在可能的情况下均加入了AF750偶联物，以将抗体组合从2种扩展至3种抗体。需要注意的是，目前 commercially available 的AF750偶联物种类较少，且该通道的靶标必须丰度较高，这进一步限制了该荧光染料的应用。例如本方案中使用的AF750标记的抗SMA抗体，尽管该克隆在与AF488或AF594偶联时表现稳定可靠，但与AF750偶联后的信号强度显著降低，导致难以获得高质量的Z轴层扫图像。
室温下3小时的抗体孵育时间相较于原始方案较短，这很可能反映了腹膜组织样本中细胞密度较低。相反，使用1.5 mg/mL硼氢化锂进行60分钟的漂白步骤则更为严格。这些参数是通过实验经验确定的，可能因所用组织和抗体的不同而有所变化。需要注意的是，由于在活性漂白溶液中孵育，组织中可能会困住少量气泡。在成像过程中一旦发现此现象，可通过吸力瓶对9孔孵育板中的样本平台施加真空进行脱气处理。由于输入图像分析软件的数据量过大，通常在IBEX研究中应用的Simple ITK样本配准方法无法实施。尽管如此，通过比较各个数据集仍可轻松识别相同的细胞群体。总体而言，迭代循环的时间安排使得每个循环可在一天内完成，其中成像过程占据整个循环的大部分时间（约8小时）。
该技术确实存在一些局限性，值得指出。由于该方案耗时较长，因此不太可能被广泛采用，而更可能在特定情况下使用。我们设想该方案最适合用于表征治疗前后的肿瘤免疫微环境变化（例如，用于癌症免疫治疗的双特异性抗体），或用于预测总体治疗效果。尽管该方案可提供三维表征，但目前尚不清楚需要检测多大范围的区域才能有效描述肿瘤及其复杂的细胞群体28。在某些机构，获取新鲜的人体组织可能较为困难，但我们认为该方案同样适用于动物模型29。
该方案的应用范围广泛，从基础研究中分析多种实体瘤的肿瘤微环境（TME）组成，到临床试验中患者治疗前后组织活检的评估均有涉及。尽管从单细胞层厚度的组织切片中可获得大量数据，但三维（3D）生物学特征却容易被忽视。我们认为3D成像可作为其他空间生物学技术的补充，有望辅助筛选用于后续分析的二维（2D）切片。此外，目前正在进行一项将活体成像组分结合至多小时连续观察的实验方案，该方案将使用本文所述的组织固定与成像装置。

实体瘤具有高度异质性，其组成复杂，包含多种细胞类型（恶性与非恶性细胞）、细胞外基质蛋白以及可溶性因子1,2最终，这种高度复杂且异质性的肿瘤微环境（TME）决定了肿瘤对免疫治疗等疗法的敏感性3,4因此，技术&#160;高度多重免疫荧光5,6 和空间转录组学7 已应用于表征厚度约为4 µm的细胞层中肿瘤微环境（TME）的复杂性。
与单细胞测序和流式细胞术等细胞分散方法不同8,9,10这些技术可保留空间关系，提供有关细胞间相互作用的关键信息，并可用于识别预测治疗反应的潜在生物标志物11,12,13然而，肿瘤病灶本质上是三维（3D）结构，上述二维（2D）方法无法充分反映其复杂的细胞微环境。该领域已充分认识到三维生物学的重要性，这一点从患者来源的肿瘤类器官培养技术的广泛应用中可见一斑14然而，类器官并未保留原始组织的细胞复杂性 体内 肿瘤微环境（TME）限制了其在免疫调节药物中的应用，也限制了对TME中多样化细胞群体的表征。
尽管有可能对连续的2D切片进行分析并通过计算方法 &#34;缝合&#34; 将图像整合以进行三维重建时，该技术成本过高，且难以高保真地实现15为以经济高效且可重复的方式对三维组织（如肿瘤）进行表征，本研究开发并展示了一种独特的组织制备与多重免疫荧光染色/分析方法，该方法采用原发性腹膜癌患者腹膜肿瘤病灶样本进行验证。
基于成熟的IBEX技术（Iterative Bleaching Extends Multiplexity）16,17的改进，本实验方案详细描述了组织固定装置和成像适配器的3D打印、腹膜组织的获取与安装、使用多种肿瘤和细胞类型标志物进行多轮染色，以及高分辨率共聚焦三维成像。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor Plus 750 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A30105</td><td>F-actin 染料</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗人 CD206（MMR）抗体</td><td>BioLegend</td><td>321114</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗人 CD31 抗体</td><td>BioLegend</td><td>303110</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗人 CD4 抗体</td><td>BioLegend</td><td>300519</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗人 HLA-DR 抗体</td><td>BioLegend</td><td>307656</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗小鼠/人 CD44 抗体</td><td>BioLegend</td><td>103016</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 抗人 CD45 抗体</td><td>BioLegend</td><td>304060</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 标记的抗钙结合蛋白抗体 [EP1798]</td><td>Abcam</td><td>ab214244</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 抗人 CD3 抗体</td><td>BioLegend</td><td>300416</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 抗人 CD8 抗体</td><td>BioLegend</td><td>344726</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 抗人Podoplanin抗体</td><td>BioLegend</td><td>337007</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 标记的抗波形蛋白抗体</td><td>BioLegend</td><td>677807</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 标记的CD68抗体（KP1）</td><td>圣克鲁斯</td><td>sc-20060AF647</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 750 全角蛋白抗体（AE-1/AE-3）</td><td>Novus</td><td>NBP2-33200AF750</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 750 人α-平滑肌肌动蛋白抗体</td><td>R&amp;研发</td><td>IC1420S</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记CD20单克隆抗体（L26）eBioscience</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>53-0202-82</td><td>抗体</td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>Gibco</td><td>15240096</td><td>补充收获培养基</td></tr><tr><td>BioMed Clear 树脂（Form 3）</td><td>FormLabs</td><td>RS-F2-BMCL-01</td><td>用于平台和孵育板的树脂</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906-500g</td><td>封闭液组分</td></tr><tr><td>浇铸亚克力 1/32&quot; 厚</td><td></td><td></td><td>用于切割载玻片的材料</td></tr><tr><td>CleanStation DT3&amp;nbsp;</td><td>Stratasys</td><td>DT3</td><td>高度调节器的后处理 &amp;和外盖</td></tr><tr><td>容器，样本&amp;nbsp;</td><td>McKesson</td><td>870203</td><td>将组织从手术台转移至准备台</td></tr><tr><td>CorelDraw&amp;nbsp;</td><td>CorelDRAW</td><td></td><td>用于激光切割的矢量设计文件制备软件</td></tr><tr><td>Cytofix</td><td>BD生物科学</td><td>554655</td><td>固定剂</td></tr><tr><td>15 cm 培养皿</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td>封片过程中使用的培养皿</td></tr><tr><td>35毫米培养皿，1.5号盖玻片，14毫米玻璃直径，未包被</td><td>Matek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>成像培养皿</td></tr><tr><td>DMEM（无葡萄糖）</td><td>Gibco</td><td>11966025</td><td>收获培养基</td></tr><tr><td>Fc封闭</td><td>BD 生物科学</td><td>564220</td><td>封闭液组分</td></tr><tr><td>3B+型</td><td>Formlabs</td><td>3B+型</td><td>用于平台和培养板的打印机</td></tr><tr><td>Form Cure</td><td>Formlabs</td><td>FH-CU-01</td><td>平台与培养板孵育后的处理</td></tr><tr><td>成形清洗</td><td>Formlabs</td><td>FH-WA-01</td><td>平台与培养板孵育后的处理</td></tr><tr><td>GrabCAD Print</td><td>GrabCAD</td><td>GrabCAD Print</td><td>用于 Stratasys 打印机的模型制备软件</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 10 mg/mL</td><td>Biotium</td><td>40046</td><td>核染料</td></tr><tr><td>J826 Prime 3D 打印机</td><td>Stratasys</td><td>J826</td><td>用于高度调节器的打印机 &amp;和外盖</td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Leica</td><td>LAS X</td><td>共聚焦软件</td></tr><tr><td>激光切割系统&amp;nbsp;</td><td>通用激光系统</td><td>ULS PLS6.150D</td><td>用于滑块的CO2激光切割</td></tr><tr><td>硼氢化锂</td><td>STREM Chemicals</td><td>93-0397</td><td>漂白剂化学成分</td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>洗涤、封闭和染色用基础缓冲液</td></tr><tr><td>PreForm</td><td>FormLabs</td><td>PreForm</td><td>用于准备 Formlab 打印机模型的软件</td></tr><tr><td>丝线缝合线&amp;nbsp;2-0&amp;nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>A305.O35</td><td>将组织固定于平台</td></tr><tr><td>Stellaris 8 WLL 共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>STELLARIS 8</td><td>共聚焦成像&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td></td><td></td><td>过滤AB溶液</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>美国生物公司</td><td>AB02025-00100</td><td>通透化试剂，封闭溶液组分</td></tr><tr><td>Vero ContactClear</td><td>Stratasys</td><td>CTT610，4 公斤</td><td>用于高度调节器的树脂 &amp;和外盖</td></tr><tr><td>加热托盘</td><td>春季 美国</td><td>ST-1220</td><td>保持培养基和组织温暖</td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td>Gibco</td><td>15230-170</td><td>LiBH4的稀释剂</td></tr></tbody></table>

采用迭代漂白扩展多重性方法对荷瘤组织进行三维成像

Three-Dimensional Imaging of Tumor-Bearing Tissue Using the Iterative Bleaching Extends Multiplexity Approach

肿瘤微环境（TME）的空间异质性是决定治疗反应的关键因素，尤其对于免疫肿瘤学药物而言，其疗效取决于特定免疫细胞亚群的分布情况。在过去十年中，已开发出多种复杂技术，利用福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）或固定冷冻组织的二维切片，实现对TME的高分辨率解析。尽管这些薄切片更易于获取和分析，但缺乏可靠且全面表征肿瘤所必需的三维结构。为克服这一局限，已开发出一种组织包埋与成像技术，以实现对肿瘤病灶在原位in vivo状态下进行三维分析。本方案详细描述了人类肿瘤组织的获取、样本在定制打印平台上的固定，以及固定后样本的染色流程。本研究改进了多重免疫荧光技术IBEX（Iterative Bleaching Extends Multiplexity），利用商业可得的抗体，对肿瘤、免疫和基质细胞的多达15种标志物进行三维TME表征。通过倒置白光激光共聚焦显微镜，结合定制打印的成像适配器和商用玻底培养皿，实现了最大达100 µm的成像深度，确保组织的最佳取向。本方案突出了IBEX方法在拓展多重免疫荧光研究方面的潜力，为更全面地理解TME组成提供了技术支持。

腹膜是一种厚度小于1 mm的膜性结构，衬于腹壁表面，并与腹腔器官的表面相延续。腹膜由表面间皮细胞及其下方的结缔组织构成，其中散布有脂肪细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和成纤维细胞，以及血管和淋巴管。腹膜恶性肿瘤大多继发于腹腔内肿瘤的转移（例如卵巢癌或胃癌）18，较少情况下为腹膜原发性肿瘤（例如间皮瘤）19。这些通常较小（&lt;1 cm）的肿瘤病灶结构高度复杂，但可通过本文所述技术进行三维表征。通过叠加五层共聚焦图像的最大强度投影，可观察固定于载物台上的整个样本（图4，左上角插图）。第一轮IBEX（IBEX1，图4）使用了三种主要的荧光标记抗体（AF488-CD44、AF594-CD45 和 AF647- Podoplanin）以及细胞核染料Hoechst。肿瘤病灶呈现出CD44和Podoplanin双阳性、呈玫瑰花环样结构的特征，并具有乳头状间皮瘤典型的细胞核排列方式。
通过细胞形态和两种抗体来鉴定肿瘤细胞，因为抗Podoplanin和抗CD44抗体均识别非肿瘤细胞，这一点已通过抗Podoplanin检测到淋巴管以及CD44抗体与免疫细胞亚群的结合得到证实。随后采用平铺扫描模式，在优化的Z轴步长下以更高分辨率捕获较小的兴趣区域（ROIs），用于生成三维投影图像（图5A）。平台经过迭代染色程序处理，并在IBEX循环1-6中对相同的兴趣区域进行成像。代表性图像包括肿瘤区域（黄色框）和肿瘤-三级淋巴结构（TLS）界面区域（蓝色框），如图5B-M所示。
TLS的存在以及CD3阳性细胞的密度表明存在显著的免疫细胞浸润20，并可能对免疫调节药物产生应答21。值得注意的是，TLS与大部分肿瘤病灶位于组织的不同Z轴深度，通过比较图6中不同光学切片的层叠投影可以证实这一点，这凸显了三维成像的优势，以及在对三维结构使用二维成像时可能遗漏的生物学信息。这些病灶的三维特征在视频文件（视频1-12）中更为明显，这些视频展示了图5中各个病灶的体渲染图像。
<img alt="3D 组织成像过程；平台打印、组织安装、抗体孵育、3D 重建。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：从 3D 打印到腹膜肿瘤 3D 成像的工作流程。该方案包含五个步骤，用于制备荷瘤腹膜组织的 3D 多重成像图像。（1）打印用于承载组织的平台、成像适配部件和孵育板。（2）组织获取与安装操作。（3）使用多聚甲醛固定。（4）IBEX 染色与成像循环。（5）利用成像软件进行 3D 重建。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织成像装置示意图、多细胞培养皿、显微镜图像及实验活检过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：用于三维成像的带组织接口的硬件组件。（A）成像适配器内平台组装的示意图。（B）9孔培养板。（C）成像适配器组件及其组装的实物照片。（D）诊断性腹腔镜检查过程中观察到的带有间皮瘤的腹膜。（E）将组织固定在平台上的过程。（F,G）带有肿瘤的腹膜组织固定在平台上的情况。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="免疫染色过程示意图：固定、洗涤、封闭、抗体、漂白；实验步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：IBEX 循环的时间线示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="肿瘤类器官显微镜图像；免疫荧光标记 CD44、CD45；比例尺 1 mm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：与 IBEX1 面板孵育后平台的整体视图。 与 IBEX1 面板（Hoechst、AF488-CD44、AF594-CD45 和 AF647-Podoplanin）孵育后整个平台的最大投影图像。虚线圆圈标示肿瘤区域。插图：安装在成像平台上的带瘤腹膜照片。比例尺：1 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="多重免疫荧光显微镜；组织结构；抗体标记物；IBEX分析结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：选定平台区域的高分辨率免疫荧光图像。 (A) IBEX1 抗体组合（Hoechst、AF488-CD44、AF594-CD45 和 AF647-波形蛋白）孵育后获取的 56 块图像 Z 轴堆栈合并的最大投影。黄色矩形：各图中所示的肿瘤病灶B-G）。蓝色矩形框：图中所示的肿瘤-三级淋巴结构界面H-M). (B-G) 使用 IBEX 面板 1-6 对单个肿瘤病灶进行体积渲染。B）IBEX1（绿色：CD44，红色：CD45，青色：Podoplanin）。C) IBEX2，绿色：CD20，红色：F-actin，青色：CD3。D) IBEX3，绿色：CD8，红色：CD4，青色：panCK。E）IBEX4，绿色：CD31，青色：CD68。F）IBEX5，绿色：CD206，青色：Calretinin。G) IBEX6，绿色：波形蛋白，红色：HLADR。H-M一个肿瘤-三级淋巴结构界面的个体样本，使用IBEX panel 1-6进行体积渲染。H) IBEX1，绿色：CD44，红色：CD45，青色：Podoplanin。I) IBEX2，绿色：CD20，红色：F-actin，青色：CD3。J) IBEX3，绿色：CD4，红色：panCK，青色：CD8。K) IBEX4，绿色：CD31，红色：SMA，青色：CD68。L）IBEX5，绿色：CD206，青色：Calretinin。M) IBEX6，绿色：HLADR，青色：Vimentin。所有图板中，蓝色：Hoechst。比例尺：(A，1 mm）；（B-M, 250 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="CD3、CD20蛋白的荧光成像；通道合并；免疫荧光分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：二维模拟成像。有限光学切片（10层）与完整堆栈（102层）投影的比较证实了二维模拟中组织背景信息的丢失。（A）第30–40层的最大投影（10 µm）。（B）第85–95层的最大投影（10 µm）。（C）第1–102层的最大投影（约100 µm）。所有图板均使用IBEX2（Hoechst、AF488-CD20、AF647-CD3、AF790-鬼笔环肽）。比例尺：200 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：用于各个IBEX面板的抗体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Table%201_IBEX%20panels.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
视频 1：使用 IBEX 面板 1 对单个病灶进行的动画体积渲染（蓝色：Hoechst，绿色：CD44，红色：CD45，青色：Podoplanin）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie1_IBEX1.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 2：使用 IBEX 面板 2 对单个病灶进行动画体积渲染（蓝色：Hoechst，绿色：CD20，红色：F-actin，青色：CD3）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie2_IBEX2.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频3：使用IBEX面板3对单个病灶进行的动画体积渲染（蓝色：Hoechst，绿色：CD8，红色：CD4，青色：panCK）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie3_IBEX3.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 4：使用 IBEX 面板 4 对单个病灶进行的动画体积渲染（蓝色：Hoechst，绿色：CD31，青色：CD68）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie4_IBEX4.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 5：使用 IBEX 面板 5 对单个病灶进行的动画体积渲染（蓝色：Hoechst，绿色：CD206，青色：Calretinin）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie5_IBEX5.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 6：使用 IBEX 6 号面板对单个病灶进行的动画体积渲染（蓝色：Hoechst，绿色：波形蛋白 Vimentin，红色：HLADR）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie6_IBEX6.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 7：三级淋巴结构-病灶界面的动画体渲染（IBEX 面板 1）（蓝色：Hoechst，绿色：CD44，红色：CD45，青色：Podoplanin）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie7_TLS_IBEX1.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 8：使用 IBEX 面板 2 对三级淋巴样结构-病灶界面进行动画体积渲染（蓝色：Hoechst，绿色：CD20，红色：F-actin，青色：CD3）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie8_TLS_IBEX2.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频9：三级淋巴结构-病灶界面的动画体积渲染（IBEX 面板3）（蓝色：Hoechst，绿色：CD8，红色：CD4，青色：panCK）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie9_TLS_IBEX3.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 10：使用 IBEX 面板 4 对三级淋巴样结构-病灶界面进行动画体积渲染（蓝色：Hoechst，绿色：CD31，红色：SMA，青色：CD68）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie10_TLS_IBEX4.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 11：三级淋巴样结构-病灶界面的 IBEX 第 5 面板动画体渲染（蓝色：Hoechst，绿色：CD206，青色：Calretinin）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie11_TLS_IBEX5.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 12：三级淋巴样结构-病灶界面的动画体积渲染（IBEX 面板 6）（蓝色：Hoechst，绿色：波形蛋白，红色：HLADR）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie12_TLS_IBEX6.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充文件 1：孵育板的打印文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/incubation_plate.form" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：36 个独立平台的打印文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/platform_x36.form" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 3：高度调节环的打印文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/SMART_imaging_heightAdjuster.STL" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 4：外盖的打印文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/SMART_imaging_petriDishLid_35mm.STL" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 5：滑块的激光切割文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/imaging_platform_slider.DWG" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种用于表征腹膜转移灶三维结构的多重免疫荧光染色方案。

肿瘤微环境（TME）的空间异质性是治疗反应的关键决定因素，特别是对于免疫肿瘤学药物而言，……

本研究聚焦于确定免疫调节药物及复杂实体胃肠道肿瘤的作用靶点。分析肿瘤微环境的细胞图谱对于理解肿瘤对免疫治疗等疗法的敏感性至关重要。单细胞测序和流式细胞术有助于表征肿瘤微环境，但缺乏空间信息。近年来，多重成像和转录组学平台相继出现，可用于在体内环境下研究肿瘤微环境。目前可用于分析肿瘤微环境的多重技术，无论是迭代式还是一体化方法，均局限于二维层面。本方案将表征扩展至深度维度，从而提供超越单个FFPE或冷冻切片的洞察。[旁白] 首先，将组织片转移至含有温热收获培养基的样品杯中，并将其置于准备台上的加热板上。将组织固定在含有收获培养基的15厘米培养皿中的支架上。小心地将带有肿瘤的组织以间皮面朝上方向覆盖在支架的小孔侧，并用2-0丝线缝合固定。将准备好的组织支架倒置并完全浸入含有收获培养基的24孔板中。进行固定时，向一个含有30毫升冷PBS的50毫升锥形管中加入10毫升固定剂原液，配制40毫升固定缓冲液。使用镊子将固定在支架上的组织转移至固定缓冲液中，在4摄氏度下孵育24小时。倾去固定液，更换为40毫升冷PBS，在4摄氏度下孵育10分钟。进行染色时，向一个孔中加入1毫升封闭缓冲液，并插入组织支架，在室温下以30 RPM低速摇床上封闭至少2小时。在微量离心管中配制0.8毫升抗体染料溶液，在室温下以10,000 g离心2分钟。将0.75毫升上清液转移至9孔孵育板的一个洁净孔中，并插入已清洗的支架。用铝箔包裹该板，在室温下以30 RPM低速摇床上孵育至少2小时。在含有40毫升PBS的50毫升锥形管中于4摄氏度下洗涤支架10分钟。向3.5厘米成像皿的玻璃底部中央加入0.1毫升PBS，并暂时放置一旁。将高度调节环松散地顺时针旋入外盖中。将支架安装在内层塑料 holder 中，确保缺口槽对齐。用滑块固定支架。将组装好的成像适配器放置在玻璃底皿上，小心降低高度调节环，直至组织接触缓冲液。当达到玻璃表面的最佳距离后，将0.2毫升PBS加到组织上表面（底部朝上），以防止成像过程中组织脱水。启动图像采集软件。选择合适的物镜，例如20X或40X，并添加相应的浸没介质。设置图像采集参数，如600赫兹的扫描速度、1024×1024像素的XY分辨率、三线平均以及双向扫描。选择适当的激光线，或调节白光激光器以匹配染色所用荧光染料的激发和发射光谱。将组装好的成像皿放入显微镜载物台的样品 holder 中。使用XY控制将样本居中，将物镜升至盖玻片位置，开始图像采集。每次成像后，执行一次漂白步骤。在蒸馏水中配制5毫升浓度为1.5毫克/毫升的硼氢化锂溶液，在室温下孵育30分钟。将1毫升硼氢化锂溶液转移至9孔孵育板的一个洁净孔中，并插入已清洗的支架，在室温下孵育60分钟。在锥形管内的20毫升PBS中短暂洗涤支架。使用Z补偿的最高激光设置检查残留的荧光信号。此处展示的是经第一轮迭代漂白扩展多重检测（IBEX 1）抗体组合染色的带瘤腹膜样本可视化结果。肿瘤病灶被识别为呈菊形团样结构，同时表达CD44和podoplanin，其细胞核排列特征符合乳头状间皮瘤。此处展示了来自带瘤腹膜样本选定区域的高分辨率免疫荧光图像。这些图像揭示了肿瘤区域与肿瘤三级淋巴样结构界面，显示出一致的免疫细胞浸润，伴有高密度的CD45阳性细胞。该图展示了IBEX第1至第6个循环中的迭代免疫荧光染色，阐明了肿瘤病灶及肿瘤三级淋巴样结构界面内免疫标记物和结构标记物的空间分布。此处展示了不同光学切片的最大投影图像。三维成像证实，肿瘤病灶与三级淋巴样结构位于不同的Z轴深度，表明二维成像在解析复杂组织结构方面的局限性。

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使用迭代漂白对荷瘤组织进行三维成像扩展了多重方法

本文全面概述了构建口腔癌小鼠模型的技术，以及通过多光子显微镜对标记细胞进行舌内肿瘤侵袭的定量监测方法。该系统可作为评估抗侵袭性化合物分子机制及药物疗效的有用平台。...

多光子成像技术在口腔鳞状细胞癌原位小鼠模型中对肿瘤细胞侵袭的观察

复杂的组织团块，从器官到肿瘤，均由多种细胞成分构成。我们利用多重荧光标记的转基因小鼠，结合多参数免疫荧光染色及光谱解混技术，解析了组织内不同细胞表型的贡献，从而根据蛋白质表达情况确定细胞来源及其特性。...

荧光组织移植后用于可视化细胞来源、类型及相互作用的定量多光谱分析

组合使用5种荧光蛋白标记造血干细胞和祖细胞可实现 体内 通过共聚焦和双光子显微镜进行克隆追踪，揭示造血再生过程中骨髓造血结构的动态变化。该方法可在移植后长期、非侵入性地对光谱编码的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）来源的细胞在完整组织中进行命运图谱绘制。<br...

体内 克隆追踪标记有五种荧光蛋白的造血干细胞与祖细胞：基于共聚焦与多光子显微镜技术

本方案描述了利用多光子显微镜对多细胞相互作用进行长时间实时延时成像的方法。 体内...

延长时程活体成像技术用于实时观察肿瘤微环境中多细胞动态变化

光学相干断层扫描（OCT）是一种三维成像技术，可用于监测和表征多细胞肿瘤球体的生长动力学。本研究展示了基于体素计数法对肿瘤球体进行精确的体积定量分析，并利用内源性光学衰减对比实现无需标记的球体内坏死组织检测。...

利用光学相干断层扫描对三维肿瘤球体进行长期形态学与生理学监测

本文介绍了一种在同一只活体动物体内，对脑肿瘤细胞在侵入性外科手术干预（例如活检）前后进行高分辨率时间序列多光子成像的方法。该方法能够在单细胞水平上研究此类侵入性外科操作对肿瘤细胞迁移、侵袭和增殖行为的影响。...

对侵入性手术活检后脑肿瘤细胞行为的纵向活体成像

在癌症免疫治疗时代，人们对阐明肿瘤微环境动态的研究兴趣显著增加。本方案详细介绍了质谱成像技术的染色和成像步骤，可实现高度多重的空间分析。...

利用质谱成像技术分析福尔马林固定石蜡包埋组织样本以拓展对肿瘤微环境的理解

本文介绍了一种5D超声技术，该技术结合了多平面3D重建与彩色多普勒融合，能够同步显示甲状腺的结构与功能信息。通过最大限度减少盲区，该方法可实现病灶的快速精确定位，提高诊断准确性，尤其有助于初学者的操作与判读。...

同步三平面重建结合彩色多普勒成像用于甲状腺病变的精确定位与快速诊断

采用脉冲电子顺磁共振技术对小鼠肿瘤的定量三维氧分布图进行了无创成像。利用超声B型成像和能量多普勒成像获取解剖结构和血管结构信息。将两种模态的图像叠加，实现多参数肿瘤分析。...

肿瘤缺氧评估：通过电子顺磁共振进行体内三维氧成像

本文介绍了迭代漂白扩展多重性（IBEX）方法的应用，该方法利用市售的自动化组织染色仪，并针对基于酪酰胺信号放大技术的试剂在使用过程中的优化因素进行了探讨。...

迭代漂白结合染色自动化技术扩展核心设施中的多重检测能力

将低成本、多功能的光照射技术与手动IBEX方法相结合，可实现对具有显著本底自发荧光的人体组织进行优化成像。本方案详细介绍了如何利用倒置显微镜、广泛可得的试剂以及开源软件，对存档的临床样本获取多重标记的全片图像，并进行图像配准与处理。...

高度自发荧光临床样本的迭代漂白扩展多重成像优化工作流程

了解迭代漂白多重免疫荧光技术用于表征腹膜转移瘤的三维结构。该方法通过组织固定、抗体染色和高级显微成像，揭示肿瘤微环境中免疫细胞的浸润模式，为免疫治疗研究提供空间分布信息。

采用迭代漂白扩展多重性方法对荷瘤组织进行三维成像

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