多光子成像在口腔鳞状细胞癌原位小鼠模型的肿瘤细胞的侵袭

产生的口腔癌和肿瘤浸润的定量监测的小鼠模型，通过多光子显微镜标记细胞内的舌头所涉及的技术的一个全面的概述。该系统可以作为一个有用的平台和反侵入性化合物的分子评估药物疗效。

该程序的总体目标是产生口腔癌小鼠模型，该模型允许可视化和量化肿瘤在舌中的侵袭。这是通过首先生成口腔鳞状癌细胞来实现的，用于通过生命慢病毒感染 Act M cherry 和稳定克隆选择进行双光子成像。接下来，通过将生命 Act M 樱桃标记的细胞注射到麻醉小鼠的舌头中，在裸鼠中产生原位异种移植肿瘤。

然后通过两个光子显微镜对含有肿瘤的舌头进行成像。最终，通过对新鲜舌组织的两个光子成像和随后的计算机辅助原发性肿瘤和区域侵袭细胞群的三维重建，可以获得显示舌肌内局部口腔肿瘤浸润的量化结果。与免疫组化或生物发光成像等现有方法相比，该技术的主要优点是可以在三个维度上定量测量肿瘤细胞侵袭。

该技术的意义延伸到治疗干预口腔癌，因为它为分析参与肿瘤侵袭的蛋白质以及评估抗侵入性治疗策略的临床前化合物提供了一个模型系统。一般来说，刚接触这项技术的人会很挣扎，因为将肿瘤细胞注射到舌头中并为两次照片显微镜准备舌头在技术上要求很高，需要技巧和实践。这种方法的可视化至关重要，因为两个光子步骤的肿瘤注射很难学习并且需要专门的技能才能开始培养。

人头颈部肿瘤细胞系在完全培养基中，由补充有 10% FBS、1% 青霉素链霉素和 1% 非必需氨基酸的 DMEM 组成。为了将 LIFE Act M 樱桃包被序列转移到 PLL 7.0 慢病毒载体位点中，首先需要定向诱变将三个沉默突变引入 SBF 中，即亲本 mCherry CD NA 中的一个识别位点。接下来，PCR 扩增 Modified Life Act mCherry 序列，侧翼为 ECO R，一个 SBF 一个位点，并亚为 PLL 7.0。为了在慢病毒表达系统培养后生成 PLL 7.0 LIFE Act M 樱桃构建体，包装细胞系 2 9 3 T 17 至 40% 在完全培养基中汇合。

使用 Cal Foss 用 PLL 7.0、LIFE Act、M、cherry PS、PACS two 和 P-V-S-V-G 载体分别以 3 比 2 的比例转染细胞。24 小时后，用新鲜的完全培养基更换培养基，每 12 小时收集并补充培养基，持续 72 小时，并将收集的培养基储存在 4 摄氏度下，以产生具有稳定生命的头颈部细胞系Act M 樱桃表达。将收集的培养基在 4 摄氏度下以 2000 RPM 离心 10 分钟，将 1 毫升含有病毒的澄清培养基添加到 OSC 19 或 US CCC one 细胞中 12 小时。

冲洗细胞，然后再添加 1 毫升病毒，再浸泡 12 小时。在含有 200 毫克/毫升 pur 霉素的培养基中培养细胞两周 为了选择抗性菌落，目视筛选存活的菌落进行终生。通过荧光显微镜胰蛋白酶眼睛进行 act m cherry 表达，使用无菌 3 毫米克隆盘的单个阳性菌落。

将阳性细胞维持在含有 200 毫克/毫升 pur mycin 的培养基中，直至冻结，或用于原位注射以产生原位肿瘤异种移植胰蛋白酶生命法案。然后离心培养物，并在 50 微升完全培养基中重悬约 2.5 倍 10 至第四个细胞。将肿瘤细胞装入连接到 27 号半英寸针头的 1 毫升注射器中。

接下来麻醉，八周龄的雌性无胸腺狐狸。一只裸鼠，每公斤氯胺酮 80 毫克和每公斤甲苯噻嗪 10 毫克的组合。一旦动物停止移动，涂抹眼部润滑软膏，并将指甲按入脚垫以检查反应性。

将鼠标放在 37 到 40 摄氏度之间的加热垫上。使用无菌镊子，轻轻抓住舌尖并将其从口腔中拉出。慢慢地将细胞注射到每个舌头的一侧，以在舌头中心形成一个球状肿块。

用每公斤 yohi being 注射 2.1 毫克的小鼠，并将它们放回加热垫以在麻醉恢复期间监测它们。将小鼠置于含有柔软转基因面团饮食的无菌笼中。每两到三天称量一次小鼠，并目视监测它们的肿瘤发作。

为了准备用于离体成像的小鼠舌头，在不同时间点对携带肿瘤的小鼠实施安乐死。吸入二氧化碳，提取舌头并用一个 XPBS 冲洗。然后使用当地业余爱好商店的单丝缝纫线和 8 号缝纫针。

将舌头连接到常规石蜡组织包埋盒的一侧。固定舌头后，将整个盒组件浸入一个 XPBS 中。立即使用双光子显微镜处理舌头，使用双光子显微镜对舌头进行成像。

将舌盒浸入含有一个 XPBS 的 60 毫米培养皿中。将培养皿固定在定制设计的支架上，该悬臂位于双光子显微镜物镜下方。将 40 x 0.8 数值孔径水浸物镜直接放在可见的肿瘤病灶上或上方。

使用强度为 60 毫瓦、输入波长为 755 纳米的钛蓝宝石激光器，通过两个光子显微镜对舌头进行成像。为了优化 M cherry 信号，在 15 到 100 微米的总组织深度上以 1 微米的增量深度收集连续的 1 微米激光扫描图像。通过这种配置，可以分析组织深度达 1 毫米的肿瘤。

使用 scan image 捕获图像。扫描图像生成光栅扫描模式的双通道输出，以控制 XY 恒温测量扫描镜，同时通过数据采集板同时捕获来自光电倍增管输入的最多四个通道信号。扫描图像通过控制物镜的 Z 轴来收集 Z 堆栈图像，并以单个或循环模式收集延时图像。

将图像保存在具有 16 位深度的单个 TIF 文件中。使用 Amira 软件，通过打开包含 Zs 堆栈图像集的 TIF 文件，将肿瘤图像堆栈渲染为单个三维图像。使用 TEX 函数生成三维渲染。

渲染的图像中可能会出现一个大的原发肿瘤图像，其中包含几个较小的解离侵袭性组或 ig。要测量肿瘤体积，请定义原发肿瘤区域的阈值和图像堆栈的每个切片，以校正并消除背景荧光。对每个侵袭组重复阈值作。

选择原发肿瘤和所有 ig 后，确定原发肿瘤的体积测量值以及 X 、 Y 和 Z 肿瘤 OID 坐标。为了计算 igs 与中心肿瘤点的距离，使用 ti 等于 N NT 乘以 VT 乘以 dt 计算肿瘤侵袭指数或 ti。其中 NT 等于图像中 igs 的总数，VT 等于所有 igs 的总体积，DT 等于所有侵袭性组从原发肿瘤中心行进的总距离。

通过在软件中将原始 16 位单色尖端文件导入 Nikon NIS 元素，可以生成具有更多地形细节的三维渲染。从图像堆栈创建 ND 文件。然后手动校准文档以指定像素大小，以获得更高质量的渲染。

在 Z 平面中添加其他切片。此图显示了从双光子图像 NIS 元件或镜子获取的原始数据的示例。软件可用于重建舌肿瘤的原始数据，如图所示。

此面板显示了在 Amira 软件中使用 TEX 函数进行三维渲染的示例。以下是从图像堆栈中对单个双光子部分进行阈值处理的示例，以识别来自原发肿瘤以及原发肿瘤中心或 oid 的侵袭组。分析每个阈值部分后，Amira 量化每个侵袭组从 Centro 行进的体积和距离。

这些数据可以以图形方式演示并用于获得肿瘤细胞侵袭完整水平的数值。归因于此处显示的原发部位是通过常规病理免疫组织化学标记可视化的肿瘤的代表性图像，与使用所述方案的类似肿瘤的三维图像相比 一旦掌握了从舌头拔出点到最终 3D 渲染，如果在尝试此程序时正确执行，该技术可以在大约两个小时内完成， 注意不要用针头刺穿舌头，从而丢失肿瘤细胞并阻碍肿瘤服用遵循此程序。可以对具有纵蛋白水平的治疗性化合物或细胞进行测试，以确定它们对口腔癌侵袭的疗效。

在体内环境中，不要忘记与用慢病毒修饰的人类肿瘤细胞一起工作是危险的预防措施，例如适当的 PPE 和在 BSL 两个认证的层流罩中工作，在与注射小鼠一起工作时应始终服用。