多光子成像技术在口腔鳞状细胞癌原位小鼠模型中对肿瘤细胞侵袭的观察

本实验的总体目标是建立一种口腔癌小鼠模型，以实现对舌部肿瘤侵袭过程的可视化与定量分析。该模型的构建首先通过慢病毒感染方法，将 life Act M cherry 基因导入口腔鳞状细胞癌细胞，并经稳定克隆筛选，获得适用于双光子成像的标记细胞；随后，将标记了 life Act M cherry 的细胞注射至麻醉小鼠的舌部，于裸鼠体内建立原位异种移植瘤模型。

然后通过双光子显微镜对包含肿瘤的舌组织进行成像。最终可获得结果，通过新鲜舌组织的双光子成像及随后对原发肿瘤和区域侵袭细胞群的计算机辅助三维重建，定量显示舌肌内的局部口腔肿瘤侵袭情况。该技术相较于现有方法（如免疫组织化学或生物发光成像）的主要优势在于，能够以三维方式对肿瘤细胞的侵袭进行定量测量。

该技术的应用前景涉及口腔癌的治疗干预，因为它为分析肿瘤侵袭相关蛋白以及评估临床前化合物在抗侵袭治疗策略中的作用提供了一个模型系统。通常，初次接触该技术的研究人员会面临一定困难，因为将肿瘤细胞注射到舌组织以及为双光子显微镜成像准备舌样本在技术上要求较高，需要熟练的技巧和反复练习。对该方法的可视化呈现至关重要，因为双光子成像过程中的肿瘤注射步骤学习难度较大，且需要具备专业技能才能开始培养操作。

人头颈部肿瘤细胞系培养于完全培养基中，培养基成分为添加了10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素和1%非必需氨基酸的DMEM。为了将LifeAct-mCherry编码序列插入PLL 7.0慢病毒载体，首先需要通过定点突变引入三个同义突变，以修饰亲本mCherry cDNA中的SbfI识别位点。随后，使用带有侧翼EcoRI和SbfI酶切位点的引物对修饰后的LifeAct-mCherry序列进行PCR扩增，并将其亚克隆至PLL 7.0载体中，构建PLL 7.0-LifeAct-mCherry表达质粒。按照慢病毒表达系统的要求，将包装细胞系293T培养至70%~80%汇合度，使用完全培养基进行后续操作。

使用 Cal Foss 将 PLL 7.0 LIFE Act M cherry PS PACS 2 和 P-V-S-V-G 载体以 3:2:1 的比例转染细胞。转染 24 小时后，更换为新鲜的完全培养基，每 12 小时收集并补充培养基，持续 72 小时，将收集的培养基于 4°C 保存，以获得稳定表达 LIFE Act M cherry 的头颈部细胞系。将收集的培养基在 4°C 下以 2000 RPM 离心 10 分钟，取 1 毫升澄清的含病毒培养基加入 OSC 19 或 US CCC 1 细胞中，感染 12 小时。

洗涤细胞，然后加入额外的1毫升病毒，继续孵育12小时。在含有200毫克/毫升嘌呤霉素的培养基中培养细胞两周，以筛选抗性克隆。通过荧光显微镜目视筛选存活的克隆，检测mCherry的表达。使用无菌的3毫米克隆环消化并挑取单个阳性克隆。

将阳性细胞维持在含有 200 毫克/毫升嘌呤霉素的培养基中，直至冻存或用于原位注射以建立原位肿瘤异种移植模型。表达 mCherry 的肿瘤细胞经离心后，用 50 微升完全培养基重悬约 2.5 × 10⁴ 个细胞。将肿瘤细胞吸入 1 毫升注射器中，注射器连接 27 号半英寸针头。

接下来，对8周龄雌性裸鼠（athymic nude mice）进行麻醉，使用80毫克/千克的氯胺酮（ketamine）和10毫克/千克的赛拉嗪（xylazine）联合麻醉。当动物停止活动后，涂抹眼用润滑软膏，并通过按压足垫指甲检查其反应性。

将小鼠置于37至40摄氏度的加热垫上。使用无菌镊子轻轻夹住舌尖，并将其从口腔中拉出。缓慢将细胞注射至每侧舌体的一侧，以在舌中心形成一个膨大的肿块。

按每公斤体重 2.1 毫克的剂量向小鼠注射育亨宾，并将其放回加热垫上，以监测其从麻醉中恢复的情况。将小鼠置于含有柔软转基因面团饲料的无菌笼具中。每两到三天称重一次，并通过肉眼观察监测肿瘤的发生情况。

为进行离体成像，需在不同时间点处死荷瘤小鼠以制备小鼠舌头样本。通过吸入二氧化碳实施安乐死，取出舌头后用一倍磷酸盐缓冲液（1×PBS）冲洗。然后使用本地手工店购买的单丝缝纫线和8号缝纫针进行后续操作。

将舌头固定在常规石蜡组织包埋盒的一侧。舌头固定后，将整个包埋盒组件浸入一份 XPBS 中。立即使用双光子显微镜对舌头进行成像处理。

将舌部样本盒浸入含有1倍磷酸盐缓冲液（XPBS）的60毫米培养皿中。将培养皿固定在双光子显微镜物镜下方、可伸缩悬臂上的定制设计支架中。将40倍、数值孔径0.8的水浸物镜直接置于可见肿瘤病灶表面或上方。

使用强度为60毫瓦、输入波长为755纳米的钛宝石激光器，通过双光子显微镜对舌头进行成像。为优化mCherry信号，以1微米为增量，在15至100微米的总组织深度范围内，连续采集每层厚度为1微米的激光扫描图像。采用此配置，可分析组织深度达1毫米的肿瘤。

使用扫描成像系统采集图像。扫描成像可生成用于控制XY轴检流计扫描镜的双通道光栅扫描信号，同时通过数据采集板同步接收来自光电倍增管的最多四个通道的信号输入。扫描成像通过控制物镜的Z轴来采集Z轴层扫图像，并以单次或循环模式采集延时图像。

将图像保存为单个16位深度的TIF文件。使用Amira软件打开包含Z轴层叠图像的TIF文件，将肿瘤图像序列渲染为单个三维图像。使用TEX功能生成三维重建图像。

在生成的图像中，通常会显示一个较大的原发肿瘤图像，以及多个较小的分离性侵袭群（invasive groups，IGs）。为测量肿瘤体积，需定义原发肿瘤区域的阈值，并对图像堆栈的每一层进行背景荧光校正与消除。对每个侵袭群重复进行阈值设定操作。

选择原发肿瘤和所有igs后，确定原发肿瘤的体积测量值及其X、Y、Z方向的肿瘤OID坐标。为了计算igs到肿瘤中心点的距离，使用公式ti = N NT × VT × dt计算肿瘤侵袭指数（ti），其中NT等于图像中igs的总数，VT等于所有igs的总体积，DT等于所有侵袭性细胞群从原发肿瘤中心出发所移动的总距离。

通过将原始的16位单色探针文件导入Nikon NIS Elements软件中，可生成具有更高地形细节的三维渲染图像。从图像堆栈创建一个ND文件，然后手动校准文档以指定像素尺寸，从而获得更高质量的渲染效果。

在Z平面上添加额外的切片。该图展示了从双光子成像NIS elements或镜面获得的原始数据示例。可使用软件对舌部肿瘤的原始数据进行重建，本图展示了重建结果。

该面板展示了在 Amira 软件中使用 TEX 功能进行三维重建的示例。此处展示的是对图像堆栈中单个双光子切片进行阈值分割的示例，用于识别原发肿瘤中的侵袭性细胞群以及原发肿瘤中心或类器官。在对每个阈值分割后的切片进行分析后，Amira 会量化每个侵袭性细胞群的体积及其相对于中心（Centro）的迁移距离。

这些数据可以通过图形化方式展示，并用于获得肿瘤细胞侵袭程度的数值。此处归因于原发部位的图像，是通过常规病理免疫组织化学标记所观察到的肿瘤代表性图像，与使用本方案获得的类似肿瘤的三维图像相对比。一旦掌握从舌体取出到最终三维重建的整个流程，若操作得当，该技术可在约两小时内完成。在进行此操作时，需注意避免针头穿透舌体，以免导致肿瘤细胞丢失并影响肿瘤的成瘤率。在此流程完成后，可对经蛋白水平调控的治疗性化合物或细胞进行测试，以评估其对口腔癌侵袭的影响。

在体内实验中，切勿忘记操作经慢病毒修饰的人源肿瘤细胞具有潜在危险性，因此在处理注射过的小鼠时，必须始终采取适当的防护措施，例如穿戴合适的个人防护装备（PPE），并在符合生物安全二级（BSL-2）标准的超净工作台内操作。