出芽酵母细胞周期依赖性过程的作和分析
2025年9月26日
该协议详细介绍了酵母细胞周期停滞和可选释放的两种方法，并详细阐述了使用荧光显微镜来研究 酿酒酵母细胞周期依赖性过程。
我们研究分裂细胞在有丝分裂过程中如何忠实传递染色体，重点关注确保染色体准确分离的分子机器和机制。我们同步细胞，研究随细胞周期变化的分子过程。没有这些方法，关键变化将隐藏在不同步的细胞群体中。
与其他同步方法相比，BAR1突变体中的α因子停止提供了更干净、可逆的G1停止，使我们能够同步追踪整个酵母培养在周期中的进展。我们的研究揭示了蛋白质在整个细胞周期中的动态定位和活性变化，揭示了染色体分离和纺锤体维持等关键有丝分裂过程。首先，将酵母接种到25毫升YPAD培养基中，并过夜孵育，达到600纳米的光学密度，范围在0.5至2.0之间。
将酵母细胞稀释至600纳米0.5的光学密度。向培养物中添加α因子，达到每毫升1微克的最终浓度。在α因子添加后2.5至3.5小时，在显微镜下计算未出芽的shmoo细胞百分比，以评估细胞停滞情况。
然后，在离心机中以3000克、23摄氏度旋转三到五分钟。小心地倒掉上清液以去除α因子。将细胞沉淀重新悬浮于含1%二甲基亚磺化物的25毫升YPAD中清洗细胞。
将细胞沉淀转移到新管中，重复洗涤两次，共洗三次以去除残留的α因子。接着，将YPAD加入洗净细胞，使最终体积达到25毫升，并将悬浮液转移到新的瓶中进行进一步孵育或使用。释放后立即采集零分钟时间点样本并定型。
释放后60分钟，用光学显微镜评估细胞群体的同步性。如有需要，释放后60分钟再次添加α因子，最终浓度为每毫升1微克，以阻止细胞进入下一个周期。继续每15分钟采集一次，最多180分钟，或持续多久。
要固定酵母细胞，需以最大速度离心1毫升培养液，持续1分钟。完全抽取上清液。然后将沉淀重新悬浮于500微升的固定液中，并在23摄氏度下孵育2到15分钟。
离心固定细胞后，抽取上清液，并将沉淀重新悬浮于500微升0.1摩尔磷酸钾缓冲液中，pH值为6.4。成像前，将固定电池以最大速度以23摄氏度离心一分钟。抽取完上清液后，将沉淀液重新悬浮于10至100微升的Triton、DAPI和山梨醇溶液中。
将约0.8微升的染色细胞悬浮液移液器直接移入干净的盖层中心。用移液器尖端轻轻将液滴涂抹成约一平方厘米大小的圆形区域。将封面套放在显微镜载玻片上。
用Kimwipe轻轻按压封面边缘，均匀分布样品。然后用指甲油封住盖片边缘，确保样本固定。将准备好的载玻片带到配备60倍放大率、1.42数值孔径油沉物镜以及红、绿、蓝、远红激光和滤光片的显微镜前。
将显微镜聚焦在附着在盖片上的酵母细胞。聚焦后，调整每个荧光通道的曝光设置，使信噪比至少达到三比一。调整采集设置，收集14到20张Z堆栈图像，每个切片间距0.2微米，覆盖总z深度为2到4微米。
在配备后处理模块的显微镜上，为每个z堆栈图像选择解卷积和快速投影选项。获取样品的z叠，捕捉足够的图像记录每个实验条件或时间点约100到200个酵母细胞。分析时，请在ImageJ软件中打开投影图像。
调整每个荧光通道的亮度和对比度，以增强可见度。分析细胞周期进程时，每个时间点计数100个细胞，并将它们分为包含一个或两个细胞核。要计算显示Stu2-GFP点的单元百分比，需统一所有图像的绿色通道亮度设置。
显示与Spc110-m樱桃点共定位的Stu2-GFP点的计数细胞，显示其为动粒定位阳性。接下来，为了量化蛋白质点的强度，使用自由手选工具勾勒出信号周围的关注区域。通过按T键或选择ROI经理菜单中的选项，将选择添加到兴趣区域管理器中。
在ROI管理器中，点击测量以计算点点强度。为了可视化时间变化，绘制每个时间点的平均强度与95%置信区间。每个病症大约计数100个细胞。
在G1抑制细胞中，Stu2-GFP定位于单纺锤极近端点，并沿细胞质微管传递额外分散信号。释放60分钟后，Stu2-GFP定位为两个相邻的交叉点，标记为Spc110-mCherry标记的双重主轴极。到90分钟后，在后期阶段，Stu2-GFP既出现在纺锤极附近，也出现在跨越单轴的微管上。
有丝分裂退出后，120分钟时，Stu2-GFP在细胞质的星体微管上重新出现。定量结果显示，Stu2-GFP在纺锤极附近的强度在早期有丝分裂期间增加，在后期前达到峰值，之后下降。双核细胞的百分比在约90分钟达到峰值，表明同步进入后期。
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概述
本研究探讨酵母（S. cerevisiae）细胞如何在有丝分裂过程中管理染色体分离，利用同步细胞周期来观察细胞动力学。通过在BAR1突变体中采用α因子阻滞，研究人员可以实现精确的G1期阻滞，以监测蛋白质定位和活性在整个细胞周期中的变化。
研究的关键组成部分
研究领域
- 细胞周期调控
- 染色体分离
- 显微镜技术
背景
- 同步的细胞周期揭示了在未同步群体中隐藏的分子过程。
- 蛋白质定位在整个细胞周期中的变化对于理解有丝分裂至关重要。
- α因子阻滞提供了比其他方法更清晰的同步方法。
使用的方法
- 荧光显微镜用于成像蛋白质定位
- Saccharomyces cerevisiae作为生物模型
- α因子处理用于G1同步和随后的释放技术
主要结果
- 观察到蛋白质定位的动态变化，特别是在有丝分裂期间的Stu2-GFP。
- 在释放后约90分钟时，双核细胞数量达到峰值，表明同步进入后期。
- 蛋白质斑点的定量强度显示了与不同细胞周期阶段相关的显著变化。
结论
- 该研究有效展示了同步酵母细胞周期以研究有丝分裂过程的精确方法。
- 这项研究对于更广泛的细胞分裂和染色体行为的生物学理解具有重要意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Cell cycle synchronization in budding yeast enables precise interrogation of dynamic molecular processes critical for chromosome segregation and mitotic fidelity. These methods provide high-resolution temporal control, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking at early discovery inflection points. Robust synchronization and quantitative imaging outputs facilitate risk-adjusted portfolio decisions in cell cycle-targeted R&D programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous testing of cell cycle-dependent hypotheses by isolating specific cell cycle phases.
- Supports mechanistic de-risking through direct observation of protein localization and activity changes.
- Facilitates functional validation of mitotic regulators and pathway components.
- Provides quantitative benchmarks for target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Delivers synchronized cell populations for reproducible assay development and compound screening.
- Standardizes biological context, reducing variability in phenotypic readouts.
- Enables quantitative measurement of protein dynamics and cell cycle progression.
- Supports scalability and platform reuse for high-content imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns yeast model outputs with conserved eukaryotic cell cycle machinery for translational relevance.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of mitotic targets.
- Enables risk-adjusted advancement of cell cycle-modulating agents based on mechanistic insights.
- Supports biomarker identification through quantitative imaging of cell cycle transitions.
Pipeline & Workflow Integration
Cell cycle synchronization and quantitative imaging position this method at the interface of early discovery, lead identification, and preclinical mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling phase-specific molecular interrogation.
- Screening: Provides reproducible, synchronized populations for robust assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of protein localization, abundance, and cell cycle progression for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges yeast model findings to higher eukaryotes via conserved cell cycle mechanisms.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for diverse cell cycle-dependent analyses across R&D teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell cycle-targeted research.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of cell-based assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency by de-risking early-stage targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of mitotic and cell cycle-related programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics, cell culture, and quantitative fluorescence microscopy.
- Demands access to high-resolution imaging platforms and analytical software (e.g., ImageJ).
- Necessitates cross-team standardization of synchronization protocols and imaging parameters.
- Adaptable to various strain backgrounds and compatible with live or fixed cell analyses.
- Potential limitations include model-specific differences and the need for careful control of synchronization efficiency.
