芽殖酵母中细胞周期依赖性过程的操作与分析

我们研究分裂细胞在有丝分裂过程中如何精确地传递其染色体，重点关注确保染色体准确分离的分子机器和作用机制。我们通过细胞同步化来研究随细胞周期变化的分子过程。若无这些方法，关键的变化将在未同步的细胞群体中被掩盖。

与其他同步化方法相比，在 BAR1 突变体中使用 α-因子阻滞可实现更纯净、可逆的 G1 期阻滞，使我们能够追踪整个酵母培养物同步地通过细胞周期。我们的研究揭示了细胞周期中蛋白质定位和活性的动态变化，阐明了染色体分离和纺锤体维持等关键有丝分裂过程。首先，将酵母接种至 25 毫升 YPAD 培养基中，在 30 °C 下振荡培养过夜，使其在 600 纳米处的光密度值达到 0.5 至 2.0 之间。

将酵母细胞稀释至600纳米处的光密度为0.5。向培养物中加入α因子，使其终浓度达到每毫升1微克。在加入α因子后2.5至3.5小时，于显微镜下计数无芽但呈纺锤形的细胞所占百分比，以评估细胞阻滞情况。

然后，在23摄氏度下，以3,000g离心3至5分钟，沉淀细胞。小心倒去上清液以去除α因子。用含有1%二甲基亚砜的25毫升YPD培养基重悬细胞沉淀，以洗涤细胞。

将细胞沉淀转移至新的离心管中，并重复洗涤两次，共洗涤三次，以去除残留的α因子。接着，向洗涤后的细胞中加入YPD完全培养基（YPAD），使最终体积为25毫升，然后将细胞悬液转移至新的培养瓶中，进行后续培养或使用。在释放后立即收集零分钟时间点的样品，并对样品进行固定。

在释放后60分钟，于光学显微镜下评估细胞群体的同步性。如需要，可在释放后60分钟再次加入α-因子，使其终浓度达到每毫升1微克，以阻断细胞进入下一个细胞周期。此后每15分钟继续收集一次时间点样品，直至180分钟，或根据需要延长取样时间。

为固定酵母细胞，将一毫升培养物在最大转速下离心一分钟。完全吸除上清液。随后，将沉淀重悬于500 µL固定液中，在23 °C条件下孵育2至15分钟。

离心固定后的细胞，吸除上清液，并将沉淀重悬于500微升pH 6.4的0.1摩尔磷酸钾缓冲液中。成像前，在23摄氏度下以最大速度离心固定细胞1分钟。吸除上清液后，将沉淀重悬于10至100微升的Triton、DAPI和山梨醇溶液中。

用移液器吸取约 0.8 微升染色后的细胞悬液，直接滴加到洁净的盖玻片中央。用移液器吸头轻轻将液滴铺展成约一平方厘米大小的圆形区域。将盖玻片放置在显微镜载玻片上。

使用无尘纸轻轻按压盖玻片边缘，使样品均匀分布。然后用指甲油密封盖玻片边缘，以固定样品。将制备好的载玻片置于配备60倍放大、数值孔径1.42的油浸物镜，以及红、绿、蓝和远红激光与滤光片组的显微镜下观察。

将显微镜聚焦于附着在盖玻片上的酵母细胞。聚焦完成后，调节每个荧光通道的曝光设置，使信噪比至少达到三比一。调整采集参数，以收集14至20个z轴层析图像，每层间隔0.2 µm，覆盖总z轴深度为2至4 µm。

对于配备后期处理模块的显微镜，为每个z轴层叠图像选择去卷积（Deconvolution）和快速投影（Quick Projection）选项。采集样品的z轴层叠图像，针对每种实验条件或时间点，获取足够数量的图像以记录约100至200个酵母细胞。进行分析时，在ImageJ软件中打开投影图像。

调整每个荧光通道的亮度和对比度以增强可见性。为分析细胞周期进程，对每个时间点计数100个细胞，并将其分类为含有一个或两个细胞核。为计算显示Stu2-GFP点状信号的细胞百分比，需在所有图像中统一绿色通道的亮度设置。

将显示与 Spc110-mCherry 点状信号共定位的 Stu2-GFP 点状信号的细胞计为动粒定位阳性细胞。接着，为定量蛋白点状信号的强度，使用手绘选择工具围绕信号勾勒出感兴趣区域。通过按下 T 键或从 ROI 管理器菜单中选择相应选项，将该选区添加至感兴趣区域管理器。

在 ROI 管理器中，单击“测量”以计算点状结构的强度。为可视化随时间的变化，绘制每个时间点的平均强度及其 95% 置信区间。每种条件下计数约 100 个细胞。

在G1期停滞的细胞中，Stu2-GFP定位于一个靠近纺锤体极的点状结构，同时在细胞质微管上可见弥散的信号。释放60分钟后，Stu2-GFP定位于两个点状结构，紧邻由Spc110-mCherry标记的已复制纺锤体极。到90分钟时，在后期阶段，Stu2-GFP既出现在纺锤体极附近，也沿跨越单一轴线的微管分布。

有丝分裂结束后，在120分钟时，Stu2-GFP再次出现在细胞质的星体微管上。定量分析显示，Stu2-GFP在纺锤体极附近的信号强度在早期有丝分裂期间逐渐增加，在后期之前达到峰值，随后下降。双核细胞的百分比在约90分钟时达到峰值，表明细胞同步进入后期。