Name: 出芽酵母细胞周期依赖性过程的作和分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-26T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 学习使用α因子同步化技术对酿酒酵母进行细胞周期依赖性过程的成像与分析。该方法通过荧光显微镜观察蛋白质定位动态变化，揭示有丝分裂中染色体分离的分子机制。

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感谢犹他大学细胞成像中心对Delta Vision显微镜设施的维护。本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目包括F31CA2717405（资助对象：M.G.S.）和T32GM141848（资助对象：M.G.S.和T.C.S.）、5 For the Fight（资助对象：M.P.M.）、Pew生物医学学者奖（资助对象：M.P.M.）以及NIH资助项目R35GM142749（资助对象：M.P.M.）。

1. 用于细胞周期分析和成像的菌株构建
<ol>
	<li>使用 Pringle 标签质粒（pFA6a 质粒）设计引物以对目标基因进行C端标签标记24简而言之，设计F2和R1引物，使其与pFA6a系列质粒配合使用时，能够扩增出可直接转化至酵母中的PCR产物，从而获得目的基因的“标记”版本。使用以下引物对和质粒： 表1 用于在此方案中标记目标基因。Longtine 等人已详细描述了酵母基因C端标记的质粒和引物设计策略。24. 
	注意：该方法可用于制备荧光标记的蛋白质以进行成像，或制备生长素诱导型降解决定子（Auxin Inducible Degron, AID）标记的蛋白质，从而通过靶蛋白的降解实现细胞周期阻滞及其他相关实验。18例如，用于标记 CDC20 带有AID（IAA7）标签，正向标记引物由25-40个碱基组成 CDC20 基因&#160;终止密码子前立即出现，不包含终止密码子（5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC 
	CAGCCAATATTTGATCAGG 3'），以及添加至3'端的Pringle质粒F2接头序列（5' cggatccccgggttaattaa 3'），以生成最终引物序列（5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC 
	CAGCCAATATTTGATCAGG cggatccccgggttaattaa 3'）。CDC20反向加标签引物包含终止密码子后紧随的25-40个碱基对的反向互补序列（5' ATTATATGCCTTGACATGAA 
	CTTTTATTTTTTTTATTTTA 3') 和 Pringle 质粒 R1 接头序列（5' gaattcgagctcgtttaaac 3'）连接，以生成最终引物序列（5' ATTATATGCCTTGACATGAACTTTTATT 
	TTTTTTATTTTA gaattcgagctcgtttaaac 3'）。还需注意，使用短于40个碱基对的PCR引物会降低其在酵母基因组中整合的效率。</li>
	<li>将引物用分子生物学级水稀释至10 µM。</li>
	<li>使用标准方法，采用F2和R1质粒对及相应的标记质粒进行PCR，按照热循环仪程序进行操作 表 2然后通过琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物的大小。</li>
	<li>将待转化的酵母菌株接种于25 mL酵母提取物蛋白胨腺嘌呤葡萄糖（YPAD）培养基中，于23 °C过夜培养。用于构建 cdc20-AID 酵母（经生长素处理后会降解Cdc20），转化后的菌株可能已含有 OsTIR1 从异位位点表达，或 OsTIR1 可能杂交&#160;之后18.</li>
	<li>次日早晨，检测过夜培养物的OD600。若培养物OD &#60;2.0 继续进行步骤 1.6。如果 OD &#62; 2.0，稀释至约0.2–0.4，并进行2–3个生长周期。</li>
	<li>在 OD600 = ~0.4–2.0 时收获细胞，以确保细胞处于对数生长期。每次转化收获 5 OD 的细胞（例如，OD600 = 1.0 时取 5 mL）。若对同一菌株进行多次转化，此阶段可将细胞合并。于 3,000 × g 离心收集细胞 g 在23 °C下持续5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用 25 mL 水洗涤细胞沉淀，随后在 3,000 x g 23 °C 下孵育 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于 1 mL 0.1 M 醋酸锂（LiAc）中，并转移至 1.6 mL 离心管中。若进行多个转化实验，需将 1 mL 重悬液分装至多个离心管中（例如，两个转化实验分装为 2 × 500 µL；三个转化实验分装为 3 × 333 µL，依此类推）。</li>
	<li>以 1,000 x 离心细胞 g 在23 °C下离心2分钟，弃去上清液。</li>
	<li>向细胞沉淀中依次加入以下组分：i) 240 µL 50% PEG，ii) 36 µL 1.0 M LiAc，iii) 20 µL = 50 µg 经5分钟预煮沸的鲑鱼精子DNA，iv) 54 µL 水。</li>
	<li>加入10 µL PCR产物（步骤1.3中获得）至细胞中，涡旋振荡1分钟，确保充分混匀。</li>
	<li>在温控室内的旋转滚筒中或在1000 rpm的恒温振荡器中，于30 °C孵育细胞30分钟。</li>
	<li>将细胞在42 °C水浴中热激15分钟。 
	注意：最佳热激时间可能因酵母菌株背景不同而有所差异。本方案已针对W303菌株背景进行优化。</li>
	<li>以 1,000 x g 离心细胞 g 在23 °C下孵育2分钟。移除上清液，并轻轻重悬于100 µL水中。</li>
	<li>使用KanMX或其他药物筛选进行转化时，将细胞接种于YPAD培养基上，于23 °C培养，次日通过影印法转接到含药物的平板上。 
	注意：转化细胞中的药物抗性基因表达需要在YPAD培养基上培养一天，这一步骤至关重要。</li>
	<li>对于使用营养缺陷型标记（URA、HIS等）的转化，直接将细胞涂布于选择性培养基上。</li>
	<li>在23 °C下孵育平板3天，使酵母转化子菌落生长。</li>
	<li>通过基因组PCR或蛋白质印迹法验证基因标记的正确性。这些方法由Burnette进行了详细描述。25 和 Chu 等人26. 
	注意：在未进行回交的情况下，不建议通过重复转化来构建含多个标记等位基因的菌株，因为转化过程可能具有诱变效应。例如，为构建同时含有 Stu2-GFP 和 Spc110-mCherry 的菌株，我们建议分别对菌株进行转化，获得携带 Stu2-GFP 和 Spc110-mCherry 的单个菌株，然后通过酵母杂交、孢子形成、四分体分离及基因型分析，将这两个等位基因整合至同一单倍体菌株中。有关酵母杂交的更多详细信息可参考 Stansfield 和 Stark 的文献。27 和 Morin 等人28进行α因子阻滞-释放实验时，所使用的单倍体菌株必须 MATa.</li>
</ol>
2. 酵母培养与细胞周期同步化：α因子阻断-释放
<ol>
	<li>将酵母接种于25 mL YPAD培养基中，23 °C过夜培养，次日早晨使菌液OD600达到0.5–2.0。
	<ol>
		<li>若次日早晨细胞OD600超过2.0，则稀释至OD600 = 0.2–0.4，并在23 °C继续培养至少一个细胞周期（2–3小时）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞稀释至OD600 = 0.5，并加入α因子至终浓度1 µg/mL（储存液为10 mg/mL溶于DMSO中）。理想情况下，细胞应携带bar1突变（例如bar1-1），该突变可提高其对α因子的敏感性。BAR1野生型细胞对α因子敏感性较低，需使用至少高一个数量级的α因子浓度才能有效阻滞，成本较高。</li>
	<li>在阻滞处理后2.5–3.5小时，通过计数无出芽的“香肠状”（shmoo）细胞比例来评估阻滞程度。当90–95%的细胞呈现香肠状形态（即G1期阻滞）时，进行释放操作。具体时间因酵母菌株、培养基和温度而异。</li>
	<li>通过在23 °C下以3,000 × g离心3–5分钟收集细胞，弃去上清液，从而解除α因子阻滞。</li>
	<li>用25 mL YPAD + 1% DMSO重悬菌体沉淀，洗涤细胞。</li>
	<li>重复步骤2.4–2.5共三次，总计洗涤三次，第一次洗涤后更换离心管一次。</li>
	<li>向细胞中加入YPD培养基，调整终体积为25 mL，并将细胞转移至新培养瓶。 
	注：使用新培养瓶至关重要，以避免残留微量α因子影响细胞释放。</li>
	<li>取时间点（0分钟）样品并进行固定（参见步骤4.1至4.4的固定操作说明）。</li>
	<li>若在23 °C下进行培养，则此后每15分钟取一次时间点样品。若温度不同，取样间隔应根据细胞生长速度相应调整。</li>
	<li>在60分钟时间点，通过光学显微镜观察是否存在大小均一的小芽（芽体大小&#60;母细胞大小的25%），以判断释放的同步性。</li>
	<li>可选：在释放后60分钟，再次加入α因子至终浓度1 µg/mL，以阻止细胞进入下一个细胞周期。加药前需确认细胞形态均一且带有小芽，以验证释放同步性。</li>
	<li>继续采集时间点样品至180分钟，或根据需要延长采样时间。在23 °C条件下，中期（metaphase）约出现在释放后45–60分钟，后期（anaphase）约出现在60–90分钟，大多数细胞在释放后120分钟时已进入新的G1期。</li>
</ol>
3. 酵母培养与细胞周期同步：Cdc20 耗竭阻滞-释放
<ol>
	<li>在23 °C下接种酵母过夜培养，使其在次日早晨的OD600达到0.5–2.0。
	<ol>
		<li>如果次日早晨细胞的 OD600 超过 2.0，则稀释至 OD600 = 0.2–0.4，并在 23 °C 下继续培养至少一个细胞周期（2–3 小时）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将所有培养物稀释至OD600 = 0.5，并从1 M储备液（500倍浓缩液）中加入生长素，使其终浓度为500 µM。对于需添加其他药物（如诺考达唑）的培养物，应同时在适当浓度下加入这些药物（例如，诺考达唑约10 µg/mL）。</li>
	<li>在停滞2小时后，通过计数大芽细胞所占百分比来检测停滞程度（大芽的判定标准为出现芽体） &#62; 25% 母细胞大小）。当90–95%的细胞停滞在有丝分裂期时，根据实验目的选择收集样品或释放细胞解除停滞。如果停滞细胞未达到90%，继续培养细胞，并每隔15–30分钟检查一次。所需时间因酵母菌株、培养基和温度的不同而有所差异。 
	注意：若计划释放细胞，不建议让阻滞持续过长时间（超过4小时），因为长时间阻滞可能会降低细胞活力。</li>
	<li>为解除 Cdc20 耗竭导致的阻滞，通过在 3000 x 离心收集培养物 g 23 °C下持续3-5分钟。</li>
	<li>通过在 25 mL YPAD + 1% DMSO 中重悬沉淀，洗涤细胞，然后在 3,000 x g 条件下离心收集细胞 g 在23 °C下持续3-5分钟。</li>
	<li>重复步骤 3.4–3.5，共洗涤 2 次。</li>
	<li>向细胞中加入 YPAD，使最终体积达到 25 mL，然后将细胞转移至新的烧瓶中。 
	注意：使用新的烧瓶对于去除可能阻止释放的痕量生长素至关重要。</li>
	<li>取0时间点并进行固定（参见步骤4.1至4.4中的固定操作说明）。</li>
	<li>以10-15分钟为间隔，持续采集所需时程的时间点数据。在23 °C条件下，大多数细胞在50-70分钟后会从阻滞状态中释放。 
	注意：细胞从这种Cdc20缺失导致的阻滞中释放的同步性不如α因子阻滞那样高。然而，该方法可用于研究后期或有丝分裂退出相关事件。此外，该阻滞-释放策略存在一项技术局限性：在释放后的较晚时间点，难以区分尚未从阻滞中释放的中期细胞与已提前释放并进入下一细胞周期中期的细胞。如有需要，可通过以下方法克服此问题：对单个细胞进行活细胞成像以追踪其从阻滞中释放的过程，或向培养物中添加α因子（前提是细胞为 MATa) 以在有丝分裂结束后将细胞阻滞在G1期。</li>
</ol>
4. 酵母固定
<ol>
	<li>取1 mL（或0.5–1.5 OD）培养物，在23 °C下以最大速度（约20,000 ×g）离心1分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并将细胞重悬于500 µL固定液（含3.7%甲醛的0.1 M磷酸钾缓冲液（KPi），pH 6.4）中。</li>
	<li>在23 °C下将细胞于固定液中孵育2–15分钟。 
	对于时间进程实验，通常建议固定15分钟，以便在取样时统一离心操作的时间点。 
	注意：固定时间应根据具体使用的荧光染料和目标蛋白进行优化。</li>
	<li>在23 °C下以最大速度离心细胞1分钟，吸除上清液，再将细胞重悬于500 µL的0.1 M KPi缓冲液（pH 6.4）中。重悬于KPi缓冲液中的细胞可在4 °C保存，直至成像前。 
	注意：固定后细胞的荧光信号可持续长达2周，具体时长取决于所用荧光染料；然而，若需对荧光信号进行定量分析，建议在7天内完成图像采集。</li>
</ol>
5. 准备用于成像的载玻片
<ol>
	<li>准备成像时，在 23 °C 条件下以最大速度离心细胞 1 分钟，并弃去上清液。将细胞重悬于 10–100 µL 的 Triton/DAPI/山梨醇溶液（1.2 M 山梨醇，1% Triton，0.1 M KPi，pH 7.5，2 µg/mL DAPI）中。</li>
	<li>用移液器吸取约 0.8 µL 细胞悬液，直接滴加到洁净的盖玻片上。使用移液器吸头轻轻将细胞液滴铺展成一个直径约 1 cm2 的圆形区域，位于盖玻片中央。</li>
	<li>将盖玻片放置于显微镜载玻片上。使用无尘纸（Kimwipe）轻轻按压盖玻片周围，使样品均匀分布。</li>
	<li>用指甲油密封盖玻片的边缘。</li>
	<li>可选：成像前可将样品置于阴凉避光处保存最多 4–6 小时，以帮助细胞沉降并减少过度移动。</li>
</ol>
6. 成像
<ol>
	<li>将载玻片置于配备60倍/1.42油镜以及红、绿、蓝、远红激光和滤光片组的显微镜下进行观察。也可使用更高倍数的物镜（最高可达100倍）。</li>
	<li>调节显微镜，使附着在盖玻片上的酵母细胞处于焦平面。 
	注意：若酵母细胞移动过于明显，可将载玻片置于阴凉避光处静置20–60分钟，以使细胞沉降。</li>
	<li>当酵母细胞清晰聚焦后，调节各通道的曝光参数，使信噪比至少达到3:1，并确保无荧光点状结构出现过曝现象。 
	注意：例如，在我们使用的配备科学级CMOS相机的成像系统上，采用60倍550物镜并使用折射率为n = 1.516的浸油时，将红色通道的最大信号值设为1000–2000 au，绿色通道设为3000 au，蓝色通道设为3000 au，DIC通道设为4000–5000 au，可获得高质量图像。</li>
	<li>调整采集参数，获取14–20层、每层间隔0.2 µm的Z轴层扫图像，总跨度为2–4 µm。</li>
	<li>对于配备后期处理模块的显微镜，为每组Z轴图像选择去卷积和快速投影功能。</li>
	<li>采集细胞的Z轴层扫图像，每种条件或时间点应获取足够图像，以涵盖约100–200个细胞。</li>
	<li>有关成像软件的操作说明，请参见含软件截图的补充文件1。</li>
</ol>
7. 图像分析
<ol>
	<li>在 ImageJ 中打开投影图像，并调整亮度和对比度以查看不同通道。如果成像所用显微镜不具备后期处理模块，则在此阶段对 Z 轴层叠图像进行最大投影。</li>
	<li>为确定细胞周期进程，每时间点计数 100 个细胞，并将其分类为含一个或两个细胞核。或者，通过计算纺锤体长度或纺锤极体之间的距离来定义细胞周期状态。Spc110 焦点间距离 &#60; 1.5 µm 对应于中期细胞，而距离 &#62; 1.5 µm 对应于后期细胞。</li>
	<li>为计算蛋白点状信号（例如 Stu2-GFP）的强度，使用自由手选工具围绕目标信号边界进行绘制。通过按下T键或使用菜单将该信号添加至 ROI（感兴趣区域）管理器。在ROI 管理器中选择测量，以计算每个选定点状信号的强度。为观察点状信号随时间的变化，可绘制每个时间点的平均强度及其 95% 置信区间的折线图。</li>
	<li>为计算含有 Bub1-GFP 点状信号的细胞百分比，需确保不同图像间绿色通道的最小和最大亮度设置一致。若 Bub1-GFP 点状信号与 Mtw1-mCherry 点状信号存在重叠，则计为 Bub1 定位于动粒；否则计为阴性。每种条件下计数约 100 个细胞。有关 Bub1 向动粒定位的更多信息，请参见 Aravamudhan 等人29 的研究。</li>
	<li>为计算大芽单核细胞的百分比，统计群体中具有大芽且含一个细胞核（一个 DAPI 信号）的细胞数量，并除以细胞总数。</li>
	<li>有关成像软件的操作说明及截图，请参见补充文件 1。</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

利用芽殖酵母的细胞周期同步化技术可研究多种细胞过程的重要机制。通过α因子处理实现G1期阻滞与释放，可使细胞群体同步地经历细胞周期各阶段；正如我们所展示的，该方法能够揭示细胞调控因子（如Stu2）的动态定位模式36细胞周期阻滞也可以通过遗传学手段实现。 通过 耗竭细胞周期调控因子（如Cdc20）可使细胞停滞于中期，从而能够在无纺锤体张力的条件下评估有丝分裂特异性过程，例如Bub1在动粒上的招募。37.
在芽殖酵母中，存在多种其他遗传手段可诱导细胞周期阻滞。cdc34（泛素连接酶SCF复合物的一个组分）的温度敏感型突变体可通过阻断蛋白酶体介导的细胞周期调控因子降解，从而在G1晚期造成阻滞40。在非允许温度下，cdc34-ts细胞在复制纺锤极体后、但在启动DNA复制前发生阻滞41。通过耗竭APC组分（如Cdc23）也可实现细胞在中期的阻滞，其机制...

真核细胞的分裂通过一个称为细胞周期的程序进行高度调控。细胞周期中发生的高度保守且动态的过程，不仅其本身具有重要的研究价值，而且对其他细胞生物学过程的研究也具有广泛的影响。例如，许多细胞器在细胞分裂过程中会发生显著的重塑，且许多蛋白质的丰度和定位在整个周期中受到严格调控1,2,3。尽管与酵母相比，多细胞动物系统在细胞分裂调控方面存在一些额外的复杂性，例如具有更多种类的调控激酶和蛋白质，以及来自外部信号的更多输入，但总体而言，细胞分裂在所有真核生物中高度保守4,5。许多关于细胞周期进程和关键调控步骤的基础性研究工作是在酵母中完成的，由于多种原因，酵母至今仍是研究细胞周期相关问题极具吸引力的模式生物6,7。其中最主要的优势在于存在大量可用于操控细胞周期的方法，能够实现细胞在不同阶段的阻滞以及细胞群体的同步化。其他优势还包括酵母较短的细胞周期（约90–150分钟，具体时长取决于温度和培养基条件）、易于进行遗传操作，以及拥有大量条件性等位基因，可在接近野生型背景下开展相关研究。
细胞周期各个阶段的进程由多种关键激酶的活性驱动，其中包括普遍存在的周期蛋白依赖性激酶（Cdk）、Polo样激酶和Aurora激酶。细胞周期检查点调控细胞周期的进程，确保细胞在满足特定条件之前不会进入分裂的下一阶段8,9。研究人员可利用这些检查点及其调控的转换过程，实现细胞群体的长期阻滞，或短暂阻滞后再释放，从而达到细胞同步化的目的（图1）。例如，细胞周期承诺检查点（在酵母中称为限制点或Start）可确保细胞在启动DNA复制之前具备足够的营养以完成分裂10。该检查点可在单倍体酵母中被操控，以实现G1期阻滞，这利用了酵母交配程序与细胞周期之间的相互作用。在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，单倍体细胞具有两种交配类型之一：MATa 或 MATα，其由交配型基因座在遗传上决定。一种交配类型的酵母对另一种交配类型的交配信息素敏感，并通过激活MAP激酶信号级联反应作出响应，最终磷酸化并稳定Cdk抑制因子Far1；Far1通过结合Cln1/2-Cdk复合物并抑制其活性，阻止细胞进入细胞周期11,12,13。响应交配信息素的细胞可通过观察是否存在交配突起（即“shmoos”）来直观判断（图1）。因此，可将化学合成的α因子加入&#160;MATa细胞培养物中，以实现G1期阻滞。另一个可用于同步酵母细胞的细胞周期转换节点是中期向后期的转换。在有丝分裂过程中，纺锤体组装检查点（SAC）监测动粒与微管的连接情况，当检测到未连接的动粒时，会通过隔离其激活因子Cdc20来抑制后期促进复合物/环体（APC/C）。APC/C是一种E3泛素连接酶复合物，对进入后期至关重要。当SAC被满足后，Cdc20便与APC/C结合，促使APC/C对多个蛋白（主要是securin和cyclin B）进行泛素化修饰，使其靶向降解，从而促进染色体分离和有丝分裂退出14,15。尽管Cdc20本身并非SAC的组成部分，但其抑制是SAC激活的作用靶点；因此，可通过诱导性耗竭Cdc20，使酵母培养物阻滞于中期（图1）16。
本方案包含两种酵母细胞周期操控方法，以及每种方法的一个应用实例。第一种方法利用α因子将细胞阻滞在G1期，随后通过洗涤步骤释放细胞，使其同步重新进入细胞周期。这些同步化的细胞将继续完成整个细胞周期，从而使研究人员能够追踪并研究处于各个细胞周期阶段的细胞。在此方法中，持续监测一种GFP标记的目的蛋白Stu2的动态定位，并追踪其与有丝分裂纺锤体的关联情况。该方法还利用了标记的纺锤极体（SPB）组分Spc110-mCherry，可用于测量有丝分裂纺锤体的长度，并作为细胞周期进程的优良指标17。此方法展示了细胞周期阻滞与释放如何实现细胞群体的同步化，从而便于在整个细胞周期中对特定蛋白或其他目标组分进行研究。
在第二种方法中，通过使用生长素诱导型降解子（auxin-inducible degron, AID）系统耗尽Cdc20，实现有丝分裂阻滞18。在表达TIR1（一种来源于植物的F-box蛋白）的细胞中，任何带有AID标签的蛋白质在添加生长素后都会被泛素化并降解。在此，我们使用带有AID标签的Cdc20，以实现Cdc20的可诱导降解，从而导致细胞停滞在中期。随后，利用带有标签的着丝粒蛋白Mtw1-mCherry作为定位参考标记，监测该细胞群体中SAC组分Bub1-GFP向动粒的招募情况。尽管Bub1在动粒上具有不依赖于纺锤体组装检查点（SAC）的功能，并且在有丝分裂早期即定位于动粒，但在阻滞细胞中其持续存在于动粒则表明动粒与微管之间的连接异常19。我们通过使用微管毒性药物诺考达唑（nocodazole）处理细胞来验证这一点，该药物可破坏动粒-微管连接。本实验突显了如何利用高度可调控的阻滞方法来研究特定细胞周期阶段的生物学过程。我们进一步证明，生长素可以从cdc20-AID培养物中洗脱，使细胞释放进入后期并进入新的细胞周期；但根据我们的经验，这些培养物的同步释放程度不如α因子阻滞-释放方法。这两种阻滞-释放方法均有效且易于实施，但酵母研究人员还可采用多种其他方法将细胞阻滞在不同的细胞周期阶段20,21,22,23。这些方法的更多细节见讨论部分。

<table><tbody><tr><td>α-因子</td><td>犹他大学核心合成设施</td><td></td><td>序列：WHWLQLKPGQPMY</td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf管</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP 混合液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion HF 反应缓冲液</td><td>New England BioLabs</td><td>B0518S</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP2401C-212</td><td></td></tr><tr><td>腺嘌呤半硫酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9126-100G</td><td></td></tr><tr><td>琼脂，颗粒状</td><td>顶端化学试剂与试剂</td><td>20-275</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Apex Bioresearch Products</td><td>20-102GP</td><td></td></tr><tr><td>Amsco Century 蒸汽灭菌器高压灭菌</td><td>Steris</td><td>SV-1262</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌的去离子水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>生长素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 I3750-5G-A；CAS：87-51-4</td><td></td></tr><tr><td>Cargille 激光液体</td><td>Cargille Laboratories</td><td>20130</td><td></td></tr><tr><td>D-山梨醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876-500G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）</td><td>分子探针</td><td>货号 D1306</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精中的脱氧核糖核酸钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠</td><td>Fisher Chemical</td><td>S811-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>20688</td><td></td></tr><tr><td>FIJI/ImageJ2 版本 2.14.0/1.54f</td><td>ImageJ2</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr><tr><td>固定转速涡旋混合器</td><td>VWR</td><td>https://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&amp;amp;gQT=2</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜 DV Ultra</td><td>Leica</td><td>https://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&amp;amp;utm_source=google&amp;amp;utm_medium=cpc&amp;amp;utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&amp;amp;utm_content=text_ad&amp;amp;utm_term=荧光显微镜&amp;amp;gad_source=1&amp;amp;gad_campaignid=170130111&amp;amp;gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&amp;amp;gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwE</td><td>序列号：NV01063。不再提供支持</td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Fisher Chemical</td><td>货号#F79-500</td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳装置</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Owl EasyCast B1</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td><td>Fermentas</td><td>SM0333</td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠</td><td>Fisher Scientific</td><td>11312A</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>VWR</td><td>48300-026</td><td></td></tr><tr><td>Innova 2300 平台摇床</td><td>新不伦瑞克</td><td>NB-2300</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>适用于1.5 mL离心管的实验室离心机</td><td>Eppendorf</td><td>2525</td><td></td></tr><tr><td>适用于50 mL离心管的实验室离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5804</td><td></td></tr><tr><td>乙酸锂二水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158-250G</td><td></td></tr><tr><td>Master cycler nexus X2</td><td>Eppendorf</td><td>https://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器 p2、p20、p200 和 p1000 及相应的吸头</td><td>Rainin</td><td>L-2XLS+R，L-20XLS-R，L-200XLS-R，L-1000XLS-R</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12541014</td><td></td></tr><tr><td>诺考达唑</td><td>Calbiochem</td><td>货号#487928；CAS：31430-18-9；批号#B35705</td><td></td></tr><tr><td>橙G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O7252</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-591</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨颗粒&amp;nbsp;</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP9725-5</td><td></td></tr><tr><td>Phusion HF DNA聚合酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-X</td><td>Rainin</td><td>PX-100R</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>424195000</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>424200025</td><td></td></tr><tr><td>电源</td><td>Bio-Rad</td><td>23786</td><td></td></tr><tr><td>启动 Acquire Ultra 1.2.2</td><td>softWoRx Cytiva</td><td>使用 DV Ultra 获取</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP152-10</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>试管旋转仪</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>VWR</td><td>WBE10A11B</td><td></td></tr><tr><td>超纯水</td><td>Apex Bioresearch Products</td><td>18-194</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物 颗粒状</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP9727-5</td><td></td></tr></tbody></table>

芽殖酵母中细胞周期依赖性过程的操作与分析

Manipulation and Analysis of Cell Cycle-Dependent Processes in Budding Yeast

真核细胞遵循一种保守的细胞周期，该周期调控着包括DNA维持和细胞器稳态在内的多种过程。为了正确解读实验结果，通常需要以依赖于细胞周期的方式研究细胞过程。目前已有一系列化学和遗传方法可用于在多种生物体（包括脊椎动物模型）的培养细胞中实现细胞周期同步，从而便于研究依赖于细胞周期的过程。然而，在模式生物中，芽殖酵母因其高效的同步化方法、较短的世代时间以及良好的遗传操作性，仍然是进行细胞周期分析的强大工具。酵母与其它真核生物共享核心的细胞周期调控机制，这使其在细胞周期调控研究中取得了多项里程碑式的发现。本实验方案详细介绍了酵母细胞周期分析的方法，重点介绍G1期阻滞-释放和有丝分裂阻滞-释放实验，内容涵盖菌株构建、培养物准备以及显微镜观察。文中提供了通过PCR标记方法构建适用于细胞周期阻滞和荧光显微镜观察的酵母菌株的技术。利用肽类信息素α-factor可实现G1期阻滞，短暂洗涤后即可实现同步释放并进入细胞周期进程。在释放后不同时间点取样，并固定用于显微观察。第二种方法通过耗竭细胞周期调控因子Cdc20使酵母细胞阻滞于有丝分裂期，获得处于中期的细胞群体，并可选择性地释放进入后期。样品在释放前后均被固定并制备用于成像，随后进行显微成像与分析。图像分析主要关注蛋白质在细胞周期中动态定位及群体丰度变化的系统记录。这些同步化方法适用于多种细胞周期操控实验；尽管本文重点强调其在固定细胞成像中的应用，但也可根据需要调整用于其他多种分析，包括活细胞成像以及生物化学和分子生物学检测。

通过荧光显微镜分析细胞周期依赖性蛋白定位的变化，可借助本文所述方法轻松实现。我们课题组长期致力于研究有丝分裂纺锤体的动态调控及其功能。在酵母中，纺锤体极体（由组分Spc110标记）作为微管组织中心，微管丝从此处延伸而出，形成有丝分裂纺锤体的结构30。微管结合蛋白Stu2通过促进微管聚合在纺锤体形成中发挥重要作用31。Stu2还在多种细胞位置中发挥不同功能，包括着丝粒、纺锤体极体和微管正端，其在细胞周期中定位的动态变化有助于实现这些功能32,33,34,35。利用标记的Spc110和Stu2进行荧光显微镜观察，可帮助理解它们在细胞周期中的定位与功能。图2展示了在α因子...

本方案详细介绍了两种酵母细胞周期阻滞及可选释放的方法，并阐述了如何利用荧光显微镜研究酿酒酵母（S. cerevisiae）中依赖于细胞周期的过程。

真核细胞遵循一种保守的细胞周期，该周期调控多种过程，包括DNA维持和细胞器稳态。研究细胞……

我们研究分裂细胞在有丝分裂过程中如何精确地传递其染色体，重点关注确保染色体准确分离的分子机器和作用机制。我们通过细胞同步化来研究随细胞周期变化的分子过程。若无这些方法，关键的变化将在未同步的细胞群体中被掩盖。与其他同步化方法相比，在 BAR1 突变体中使用 α-因子阻滞可实现更纯净、可逆的 G1 期阻滞，使我们能够追踪整个酵母培养物同步地通过细胞周期。我们的研究揭示了细胞周期中蛋白质定位和活性的动态变化，阐明了染色体分离和纺锤体维持等关键有丝分裂过程。首先，将酵母接种至 25 毫升 YPAD 培养基中，在 30 °C 下振荡培养过夜，使其在 600 纳米处的光密度值达到 0.5 至 2.0 之间。将酵母细胞稀释至600纳米处的光密度为0.5。向培养物中加入α因子，使其终浓度达到每毫升1微克。在加入α因子后2.5至3.5小时，于显微镜下计数无芽但呈纺锤形的细胞所占百分比，以评估细胞阻滞情况。然后，在23摄氏度下，以3,000g离心3至5分钟，沉淀细胞。小心倒去上清液以去除α因子。用含有1%二甲基亚砜的25毫升YPD培养基重悬细胞沉淀，以洗涤细胞。将细胞沉淀转移至新的离心管中，并重复洗涤两次，共洗涤三次，以去除残留的α因子。接着，向洗涤后的细胞中加入YPD完全培养基（YPAD），使最终体积为25毫升，然后将细胞悬液转移至新的培养瓶中，进行后续培养或使用。在释放后立即收集零分钟时间点的样品，并对样品进行固定。在释放后60分钟，于光学显微镜下评估细胞群体的同步性。如需要，可在释放后60分钟再次加入α-因子，使其终浓度达到每毫升1微克，以阻断细胞进入下一个细胞周期。此后每15分钟继续收集一次时间点样品，直至180分钟，或根据需要延长取样时间。为固定酵母细胞，将一毫升培养物在最大转速下离心一分钟。完全吸除上清液。随后，将沉淀重悬于500 µL固定液中，在23 °C条件下孵育2至15分钟。离心固定后的细胞，吸除上清液，并将沉淀重悬于500微升pH 6.4的0.1摩尔磷酸钾缓冲液中。成像前，在23摄氏度下以最大速度离心固定细胞1分钟。吸除上清液后，将沉淀重悬于10至100微升的Triton、DAPI和山梨醇溶液中。用移液器吸取约 0.8 微升染色后的细胞悬液，直接滴加到洁净的盖玻片中央。用移液器吸头轻轻将液滴铺展成约一平方厘米大小的圆形区域。将盖玻片放置在显微镜载玻片上。使用无尘纸轻轻按压盖玻片边缘，使样品均匀分布。然后用指甲油密封盖玻片边缘，以固定样品。将制备好的载玻片置于配备60倍放大、数值孔径1.42的油浸物镜，以及红、绿、蓝和远红激光与滤光片组的显微镜下观察。将显微镜聚焦于附着在盖玻片上的酵母细胞。聚焦完成后，调节每个荧光通道的曝光设置，使信噪比至少达到三比一。调整采集参数，以收集14至20个z轴层析图像，每层间隔0.2 µm，覆盖总z轴深度为2至4 µm。对于配备后期处理模块的显微镜，为每个z轴层叠图像选择去卷积（Deconvolution）和快速投影（Quick Projection）选项。采集样品的z轴层叠图像，针对每种实验条件或时间点，获取足够数量的图像以记录约100至200个酵母细胞。进行分析时，在ImageJ软件中打开投影图像。调整每个荧光通道的亮度和对比度以增强可见性。为分析细胞周期进程，对每个时间点计数100个细胞，并将其分类为含有一个或两个细胞核。为计算显示Stu2-GFP点状信号的细胞百分比，需在所有图像中统一绿色通道的亮度设置。将显示与 Spc110-mCherry 点状信号共定位的 Stu2-GFP 点状信号的细胞计为动粒定位阳性细胞。接着，为定量蛋白点状信号的强度，使用手绘选择工具围绕信号勾勒出感兴趣区域。通过按下 T 键或从 ROI 管理器菜单中选择相应选项，将该选区添加至感兴趣区域管理器。在 ROI 管理器中，单击“测量”以计算点状结构的强度。为可视化随时间的变化，绘制每个时间点的平均强度及其 95% 置信区间。每种条件下计数约 100 个细胞。在G1期停滞的细胞中，Stu2-GFP定位于一个靠近纺锤体极的点状结构，同时在细胞质微管上可见弥散的信号。释放60分钟后，Stu2-GFP定位于两个点状结构，紧邻由Spc110-mCherry标记的已复制纺锤体极。到90分钟时，在后期阶段，Stu2-GFP既出现在纺锤体极附近，也沿跨越单一轴线的微管分布。有丝分裂结束后，在120分钟时，Stu2-GFP再次出现在细胞质的星体微管上。定量分析显示，Stu2-GFP在纺锤体极附近的信号强度在早期有丝分裂期间逐渐增加，在后期之前达到峰值，随后下降。双核细胞的百分比在约90分钟时达到峰值，表明细胞同步进入后期。

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生物学

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固有动力学可视化工具是一个交互式可视化软件包，可连接至基因调控网络推断工具，以增强并简化功能网络模型的生成。该可视化工具可用于更合理地确定推断工具的参数，从而提高所得模型的可靠性。...

固有动力学可视化工具：用于评估与可视化基因调控网络推断流程输出的交互式应用程序

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利用细胞周期同步性丧失特征模型对同步化时间序列数据进行对齐以实现跨实验比较

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裂殖酵母的定量活细胞荧光显微镜分析

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芽殖酵母中细胞周期依赖性过程的操作与分析

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