Name: 在芽殖酵母中的蛋白浓度的功能形态学表型的发展分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-24T16:05:00.000+00:00
Duration: 15 min 2 s
Description: 学习在芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae中利用可调控启动子分析蛋白浓度与表型发育的关系。该方法通过Western blotting和显微镜技术监测蛋白质表达水平，为研究蛋白质功能提供可靠方案。

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感谢 Brian G. Coon 和 Claudia B. Hanna 提供的有益讨论与支持。 
本项目得到了普渡大学生物科学系为 R. Claudio Aguilar 提供的启动资金，以及通过普渡大学癌症中心由美国癌症协会机构研究基金授予 R. Claudio Aguilar 的资助。

A. 细胞培养与蛋白诱导
本部分介绍了细胞培养条件、使用诺考达唑进行细胞周期同步化，以及随后在酵母细胞中通过可调控启动子诱导蛋白表达的方法。
<ol>
 <li>将野生型酵母菌株 W303（leu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15）用含有目的基因（ENTH2）的高拷贝（2μ）质粒 DNA 进行转化，该基因受甲硫氨酸可抑制启动子 (MET25) 的调控。2 mM 甲硫氨酸足以抑制启动子活性，而缺乏甲硫氨酸的培养基则允许基因最大程度表达。因此，可通过使用不同浓度的甲硫氨酸来实现目标蛋白水平的表达。质粒 DNA 在 W303 细胞中的转化采用 LiAc-TE 法，按照标准操作流程进行2。
 注意：本实验应通过在含有 2 mM 甲硫氨酸的培养基中过夜培养细胞，以确保蛋白表达仅处于本底水平。次日早晨，在细胞周期同步化后（约 4 小时），将细胞重悬于不含甲硫氨酸的培养基中以诱导蛋白表达。然而，我们发现只有当细胞内 ENTH2 蛋白积累到一定浓度后（通常在蛋白诱导 4–6 小时后3），才会诱导出依赖 ENTH2 的细胞分裂表型，这使得对表型所有表现形式的分析过程非常漫长（至少 16 小时）。我们发现，在含有 0.2 mM 甲硫氨酸的培养基中过夜培养细胞，虽可抑制形态学表型，但允许蛋白浓度达到亚临界水平，当转移至不含甲硫氨酸的培养基时，蛋白水平可迅速上升至足以诱导表型的程度。这使得在相对较短的时间内即可对严重的细胞分裂缺陷表型进行详细分析。因此，我们建议实验人员根据具体情况确定诱导表型的亚阈值甲硫氨酸浓度。</li>
 <li>从含有近期转化细胞的平板上挑取六个单克隆，使用标准无菌技术将其接种于 50 ml 含 0.2 mM 甲硫氨酸的筛选培养基中，置于灭菌的锥形瓶内。在 30°C、200 rpm 振荡条件下过夜培养。（有关标准酵母培养条件的更多信息，请参见参考文献 4）</li>
 <li>次日早晨，通过测定培养物在 600 nm 处的光密度（OD）来估算细胞密度。取相当于 20 OD600nm 的细胞转移至无菌离心管中，在室温下以 2200 rpm 离心 5 分钟收集细胞。</li>
 <li>将细胞重悬于 YPD 培养基中，浓度为 0.4 OD600nm/ml，并加入诺考达唑（Nocodazole），使其终浓度为 15 μg/ml（母液为 1 mg/ml 溶于 DMSO）。在 30°C、200 rpm 振荡条件下孵育 4 小时。 注意：也可采用其他阻滞方法，例如使用 α-因子阻滞于 G0 期，或使用羟基脲阻滞于 G1-S 期。我们发现，使用诺考达唑将细胞阻滞于有丝分裂期对本实验目的而言简便且有效。</li>
 <li>孵育 4 小时后，通过显微镜观察具有大小相等芽体的细胞数量，计算处于有丝分裂阻滞状态的细胞百分比。若阻滞率超过 90%，则进行下一步操作；否则继续将细胞维持在诺考达唑处理中，直至达到理想的有丝分裂阻滞比例。</li>
 <li>以 2200 rpm 离心 5 分钟收集细胞，用预冷的冰水洗涤三次。最后一次洗涤后，将细胞沉淀重悬于不含甲硫氨酸的筛选培养基中，细胞密度约为 0.5 OD600nm/ml。将一半体积的细胞转移至新的无菌离心管中，并加入甲硫氨酸至终浓度为 0.2 mM，作为基础表达水平蛋白效应的对照组。此时刻标记为实验的第一个时间点（时间 = 0 小时）。此后每小时取样分析一次，持续 6 小时。</li>
</ol>
B. 表型发育分析
注意：以下描述的所有分析方法无需同时进行。
通过蛋白质印迹法测定蛋白质表达水平
<ol>
 <li>在每个时间点，测定培养物在600 nm处的光密度（OD600nm），并通过在2200 rpm下离心5分钟收集相当于2个OD600nm单位的细胞。</li>
 <li>将沉淀重悬于1 ml无菌水中，并将悬液转移至1.5 ml离心管中。再次离心以获得沉淀，吸除上清液。</li>
 <li>将沉淀重悬于50 μl SDS-PAGE Laemmli样品缓冲液（50 mM Tris pH 6.8，2% SDS，10%甘油，2% β-巯基乙醇和0.006%溴酚蓝）中。加入50 μl酸洗玻璃珠（直径0.2–0.4微米），涡旋振荡1分钟。</li>
 <li>将离心管置于95°C金属浴中煮沸2分钟，再次涡旋30秒，继续煮沸5分钟。将蛋白样品在-20°C下冷冻保存。</li>
 <li>将蛋白样品在12% SDS-PAGE凝胶上电泳分离，转印至硝酸纤维素膜，并使用适当的抗体进行Western blot检测目标蛋白。在此示例中，通过加入鼠源抗HA抗体（Covance，Princeton, NJ），在Blotto-Tween（1×PBS，5%脱脂奶粉，0.1% Tween）中以1:2000稀释，孵育检测带有血凝素（HA）标签的ENTH结构域。随后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠二抗（Pierce），同样以1:2500稀释于Blotto-Tween中，在室温下孵育1小时使其结合膜上的初级抗体。使用Supersignal West Pico化学发光底物检测HRP标记的抗小鼠抗体。</li>
 <li>通过密度测定法对蛋白表达水平进行定量分析。</li>
</ol>
本部分介绍了两种根据蛋白质浓度增加来追踪表型发育的方法。第一种方法基于细胞群体，而第二种方法则在单细胞水平上进行研究。
细胞分裂表型和细胞死亡的定量分析
<ol>
 <li>在每个时间点，使用无菌技术将 1ml 细胞悬液转移至无菌离心管中，并在 2200 rpm 条件下离心 5 分钟以收集细胞。</li>
 <li>吸除上清液，将沉淀重悬于 70μl 培养基中，随后加入 30μl 亚甲蓝溶液（储存液浓度为 1mg/ml，溶剂为无菌水）。亚甲蓝是一种蓝色活体染料，在胞质的还原性环境中会褪为无色，因此死细胞因其呈现蓝色而可被识别。</li>
 <li>用移液器吸取约 6μl 上述悬液滴加至洁净的玻璃载片上，盖上盖玻片，轻轻按压使细胞在两层玻璃之间形成均匀的薄层。</li>
 <li>将盖玻片分为 9 个象限，按图 2 所示在每个象限采集 3 张图像。每个视野中的细胞数量不应超过 30 个，以确保准确量化。每张盖玻片在空气泡破坏样本前可维持约 15 分钟的成像时间。</li>
 <li>统计显示目标表型的细胞数量。由于 ENTH2 过表达所诱导的细胞分裂缺陷会导致细胞死亡，因此我们同时统计因呈蓝色而被识别的死细胞数量。</li>
 <li>计算具有表型的细胞百分比。</li>
 <li>按图 3 所示方式绘制数据。</li>
</ol>
使用荧光显微镜观察表型特异性缺陷
在 ENTH2 过表达时观察到的细胞分裂缺陷细胞，通常表现出细胞壁缺陷和 Septin 蛋白错误定位（以 GFP 融合蛋白形式可视化）。芽殖酵母的细胞壁可通过 Calcofluor White（CfW）染色进行清晰观察，CfW 可与酵母细胞壁中的几丁质不可逆结合。
<ol>
 <li>在每个时间点，取1 ml培养物至无菌离心管中，室温下以2200 rpm离心5分钟收集细胞。</li>
 <li>将细胞沉淀重悬于100 μl含1 mg/ml CfW的无菌水溶液中，室温避光孵育5分钟。</li>
 <li>离心收集细胞，并用1× PBS洗涤3次。</li>
 <li>将沉淀重悬于100 μl 1× PBS中，使用显微镜在紫外光（细胞壁）和FITC滤光片（GFP-Septin）下以100倍放大倍数进行成像。</li>
 <li>参照B.2.1节中步骤4–6，定量具有细胞壁缺陷和Septin错位的细胞百分比。</li>
</ol>
B.3. 单细胞水平表型发育的确定：延时视频显微镜观察。
<ol>
 <li>用70%酒精清洁带有凹槽的载玻片，并使其自然晾干。</li>
 <li>在无菌玻璃试管中，将0.06 g琼脂糖加入5 ml不含甲硫氨酸的选择性培养基中，用微波炉加热至琼脂糖完全溶解。</li>
 <li>迅速将200 μl含琼脂糖的培养基移入载玻片的凹槽中，然后将另一张洁净的载玻片倒置覆盖其上，确保下方无气泡残留。</li>
 <li>待凝胶凝固后，平稳地将上层载玻片从凹槽载玻片上移开，始终保持两片表面平行。此操作可确保琼脂糖表面与凹槽载玻片表面齐平。用柔软的擦拭纸清洁琼脂糖周围区域。载玻片现已准备就绪，可供使用。</li>
 <li>在时间 = 4小时时，将1 ml培养物转移至无菌离心管中，在室温下以2200 rpm离心5分钟收集细胞。 
注意：建议选择较晚的时间点，以确保蛋白表达水平较高，从而保证表型的充分发育。需通过预实验根据具体情况确定诱导时间。
 </li>
 <li>吸除上清液，将细胞重悬于100 μl不含甲硫氨酸的新鲜选择性培养基中。</li>
 <li>在盖玻片边缘涂抹凡士林。然后在琼脂糖表面中央滴加一滴细胞悬液，并轻轻盖上盖玻片，使其均匀铺展。</li>
 <li>用凡士林密封盖玻片边缘，并用指甲油沿边缘涂覆以固定其位置。待指甲油完全干燥。</li>
 <li>将载玻片置于显微镜加热台上，选择一个包含不超过10个细胞且分布足够分散的视野。随着细胞分裂，该视野将逐渐变得拥挤。</li>
 <li>每5分钟拍摄一次该视野图像，持续约5小时。可通过ImageJ软件将图像序列合成为视频以观察表型进展（<a name="cite">Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2005</a>）</li>
</ol>
注意：我们使用蔡司Axiovert 200M显微镜、蔡司Axiocam MRm黑白数字相机以及卡尔·蔡司Axiovision图像采集软件（版本4.4）进行活细胞成像。温度控制通过将载玻片置于加热载物台上实现，该载物台由PeCon Tempcontrol 37设备维持在30°C。
为了避免反复重新调整焦距，可将图像采集软件设置为在每个时间点自动采集若干z轴层析图像，待后期拼接视频时再从中选择焦距最佳的图像。部分图像采集软件为时间序列实验提供自动对焦选项，若有此功能，建议使用。
野生型酵母细胞在 30°C 时生长最佳，因此温度控制至关重要。为了确保足够的热量，除了使用加热载物台外，提供外部热源会有所帮助。例如，我们在整个成像过程中始终保持显微镜透射白光开启。
在制备琼脂糖凝胶层和细胞夹心结构时，避免产生气泡也至关重要。气泡中截留的空气在长时间加热后会膨胀，容易将细胞推出成像区域。
在成像过程中，尤其是重新对焦时，确保视野内各个细胞的位置不发生明显变化也非常重要。ImageJ 提供了图像稳定插件，可用于校正视频组装后细胞位置的微小偏移。（<a href="http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html">http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html</a>）。

<ol><li>Rönicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+conditional+promoters+for+expression+of+heterologous+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGietz%2C+RD+%22High+efficiency+transformation+with+lithium+acetate+in+Molecular+Genetics+of+Yeast%3A+A+Practical+Approach%22">High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press Inc. New York. 121-134 (1994).</li>
<li>Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+endocytic+protein+Epsin+2+functions+in+a+cell-division+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway.</a> J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).</li>
<li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSherman%2C+F+%22Getting+started+with+yeast+in+Guide+to+Yeats+genetics+and+Molecular+Biology%22">Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology</a>. , Academic Press Inc. San Diego. 3-21 (1991).</li>
</ol>

本方案描述了如何通过蛋白质过表达来监测形态学表型（酵母细胞无法正常进行细胞分裂）的发展过程。进行此操作时，重要的是要记住以推荐的离心速度离心收集酵母细胞，因为更高的速度可能会损伤细胞并掩盖实验结果。亚甲蓝和Calcofluor White应在成像前立即加入活细胞中，因为这些染料具有毒性。只要目标蛋白由可调控启动子驱动表达，该方案也可轻松适用于在蛋白质抑制条件下观察的表型。

<table><tbody><tr><td>诺考达唑</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>1% (w/v) 亚甲蓝</td><td>试剂</td><td>VWR international</td><td>VW6276-0</td><td></td></tr><tr><td>卡乐氟尔白</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3543</td><td></td></tr><tr><td>凡士林</td><td>试剂</td><td>VWR international</td><td>VW3339-2</td><td></td></tr></tbody></table>

酿酒酵母中蛋白质浓度依赖的形态表型发育分析

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

基因敲除和蛋白过表达是研究蛋白质功能的常用方法。在本文中，我们描述了一种在群体和单细胞水平上，作为蛋白质浓度函数分析表型发育的实验方案Saccharomyces cerevisiae. 尽管本实验方案基于蛋白质的过表达，但也可轻松调整用于依赖于蛋白表达抑制的形态学表型研究。我们实验室致力于研究内吞作用适配器蛋白epsin的信号传导特性。为此，我们采用了一种显性负性策略，即过表达其保守的EpsinN-TerminalH为了干扰内源性epsin-2（Ent2或YLR206W）的功能，我们表达了epsin-2的氨基末端同源结构域（ENTH结构域）。我们观察到，在野生型细胞中过表达Ent2的ENTH结构域（ENTH2）会导致细胞分裂缺陷，该缺陷依赖于一组支架蛋白——分裂素（septins）的错误定位。

基因删除和蛋白质过表达是研究蛋白质功能的常用方法。本文中，我们描述了一种在群体水平和单细胞水平上分析酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中蛋白质浓度依赖性表型发育的实验方案。

基因敲除和蛋白过表达是研究蛋白质功能的常用方法。本文中，我们描述了一种用于分析……的实验方案。

本方案利用一种可调控的启动子，实现对蛋白表达的控制。在本实验中，我们使用一种高拷贝的2微米质粒，该质粒在甲硫氨酸可抑制启动子的驱动下表达N端二聚化结构域。将该质粒转化至野生型酵母细胞中。在缺乏uol的平板上筛选质粒和转化子。经 overnight 培养后，在选择性培养基中通过无皮质醇介导的生长阻滞使细胞同步化。最后，在时间过程实验期间，通过将细胞转移至不含甲硫氨酸的培养基中以诱导 and to 的表达。通过蛋白质印迹法监测蛋白浓度，通过显微镜观察形态学表型的发育。大家好，我是普渡大学生物科学系的 Claudia。我是来自 alar 的 de Bari Muji，同时也在 AL 实验室。今天我们将向您展示一种分析形态学表型发育随体内蛋白浓度变化的实验方法。在我们的实验室中，利用该方法研究在内吞作用适配蛋白 absent two 的 N 二结构域过表达时所观察到的细胞分裂表型的形态学和分子特征。那么，让我们开始吧。本实验方案首先构建一种能够表达目标蛋白的酵母菌株。在我们的实验中，我们将含有 nth2 基因的高拷贝质粒 DNA 转化至野生型酵母菌株 W 3 0 3 中，该质粒中的 nth2 基因受甲硫氨酸可抑制型启动子调控，2 毫摩尔甲硫氨酸可抑制 met25 启动子的活性。尽管缺乏甲硫氨酸的培养基可实现最大表达，但仍需从含有近期转化细胞的平板上挑取六个菌落，接种于50毫升含0.2毫摩尔甲硫氨酸的选择性培养基中，置于锥形瓶内，于30摄氏度、200转/分钟振荡条件下过夜培养。次日早晨，通过测定600纳米处的光密度值估算细胞密度。取相当于每毫升20个OD600纳米单位的细胞，转移至无菌离心管中，通过离心收集细胞。通过涡旋将细胞重悬于YPD培养基中，以同步细胞周期，并从DMSO中浓度为1毫克/毫升的储备液中加入药物至终浓度为15微克/毫升。在30摄氏度下以200转/分钟振荡培养4小时。4小时后，检测处于有丝分裂阻滞的细胞百分比。在显微镜下观察并计数具有大小相等芽体的细胞数量，然后进行下一步。只有当细胞阻滞率大于90%时，以2200转/分钟离心5分钟收集细胞。用预冷的冰水洗涤三次后，将细胞沉淀重悬于缺乏甲硫氨酸的选择性培养基中，细胞密度约为每毫升0.5 OD（600纳米波长处）。将一半体积的细胞转移至新的无菌离心管中，并加入甲硫氨酸至终浓度为 0.2 毫摩尔。这将作为由于基础水平蛋白表达所引起效应的对照。将两份培养物均放回 30 °C 恒温培养箱中。在每个时间点的六小时内，每小时分析一次细胞表型的发育情况。取1毫升各培养物的细胞悬液，转移至无菌的微量离心管中，通过离心收集细胞，吸除上清液，并将沉淀重悬于70 µL培养基中。然后，从浓度为1毫克/毫升的无菌水储备液中加入30 µL的亚甲基蓝溶液。接下来，取约六微升该悬液滴加到洁净的玻璃载片上，然后将盖玻片覆盖在液滴上。轻轻按压盖玻片，使细胞在玻璃界面之间形成一层薄而均匀的分布。将盖玻片分为九个象限，每个象限拍摄三张图像。每个视野中的细胞数量不应超过30个，以确保准确的定量分析。统计显示目标表型的细胞数量，在本示例中为具有拉长和/或串联芽体且未能彼此分离的出芽酵母细胞。我们还统计因染色呈蓝色而被识别的死亡细胞数量，因为nth诱导后会引起细胞分裂缺陷。两种过表达导致细胞死亡，以在每个时间点观察特定表型缺陷。取一毫升培养物至无菌微量离心管中，通过离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于100微升含1毫克/毫升刚果红的无菌水中，室温避光孵育5分钟。使用钙白染色可实现对细胞壁的可视化观察。用1×PBS将沉淀洗涤三次。将最终沉淀重悬于100微升PBS中。在显微镜下观察细胞，并使用紫外光学系统在100倍放大倍数下获取细胞壁的图像。为观察GFP标记的septin，使用FS E滤光片获取图像。通过之前所示的方法，将盖玻片分为九个象限，每个象限拍摄三张图像用于计数，从而量化具有细胞壁缺陷和septin错位定位的细胞百分比。单个酵母细胞的显微成像需要使用嵌入培养基的琼脂床来制备琼脂床。首先用70%酒精清洁带有凹陷的玻璃载玻片，并在载玻片晾干的过程中使其自然风干。将0.06克琼脂加入5毫升缺乏甲硫氨酸的筛选培养基中，在微波炉中加热至沸腾，直至琼脂迅速完全溶解。用移液器吸取200微升含琼脂的培养基滴加到载玻片上。将另一块干净的载玻片倒扣在凹槽上，确保下方无气泡残留。待凝胶凝固后，平稳地将上方载玻片从凹槽载玻片上移开，始终保持两者的表面相互平行。此操作可确保琼脂糖床的表面与凹槽载玻片的表面齐平。用柔软的纸巾清洁农杆菌培养区周围的载玻片区域。载玻片现已准备好，可在四小时时间点使用。将一毫升培养物中的细胞转移至无菌微量离心管中，并通过离心收集细胞。吸弃上清液，并将细胞重悬于100微升不含甲硫氨酸的新鲜选择性培养基中。在盖玻片边缘涂抹凡士林。然后取一滴细胞悬液置于载片的琼脂区域中央，并轻轻按压盖玻片使其均匀铺展。用指甲油沿盖玻片边缘封边以固定其位置。待指甲油干燥后，将玻片置于显微镜的加热载物台上。我们使用配备有 Zeiss Axio cam MRM 黑白数码相机的 Zeiss Axio 200 M 显微镜，选择一个细胞数量不超过 10 个且分布足够分散的视野，因为随着时间推移，视野中的细胞会变得密集。细胞分裂过程中，每隔五分钟拍摄一次视野图像，持续约五小时。为避免反复重新调焦，我们编程设定图像采集软件在每个时间点自动获取几张Zack图像。稍后将选择对焦最清晰的图像用于制作视频，以确保细胞获得足够的热量；除了使用加热载物台外，还可通过在整个成像过程中保持显微镜透射白光开启，提供额外的热源。通过使用 Image J 软件将图像合成为视频，可研究表型逆转现象。此处我们展示了过表达目标蛋白的代表性结果。Nth two。首先，检测 nth two 的蛋白表达。在实验的时间过程中，收集表达 HA 标签 nth two 的细胞裂解液，并使用单克隆抗 HA 抗体进行 Western 印迹分析。如免疫印迹所示，含有 0.2 毫摩尔甲硫氨酸的培养基中培养的细胞，其蛋白表达水平极低。然而，在缺乏甲硫氨酸的培养基中培养的细胞，S two 蛋白浓度在整个实验时间过程中呈现持续上升的趋势。随后分析了在有或无甲硫氨酸的条件下培养六小时的细胞，因为低浓度的 nth two 无法单独诱导细胞分裂表型或细胞死亡。经亚甲蓝染色后，仅有少量细胞呈蓝色，表明其已死亡。同样，每个细胞的细胞核数量、细胞壁以及 septin 的排列均正常，符合预期。相比之下，M基因的过表达会导致严重的细胞分裂缺陷和细胞死亡，这可通过甲烯蓝染色后仍保持蓝色的长串相连的伸长芽体来证明。大多数表型细胞均为多核细胞，这一点可通过DPI染色确认。钙荧光白染色显示异常细胞壁斑块的积聚。此外，septin 出现明显的错位和紊乱。该表型随时间变化的定量分析结果如图所示，其中空心圆圈代表 0 毫摩尔甲硫氨酸，实心圆圈代表 0.2 毫摩尔甲硫氨酸。我们在此可见，随着 nth2 浓度在细胞内随时间逐渐积累，表现出细胞分裂表型的细胞百分比也随之上升。在0.2 mM甲硫氨酸条件下培养的对照细胞表明，表型发育是蛋白质浓度升高的结果，而非细胞培养条件所致。最后，通过延时视频显微镜记录了nth2过表达后表型的发育过程。经过四小时的 nth 处理后，两种过表达细胞显示出轻微的形态学细胞分裂表型。随着影片的进展，我们观察到顶端芽体生长出现异常且持续时间延长，导致芽体变得非常细长。我们还观察到，在细胞尚未完成分裂的情况下，新的芽体便已开始出现。此外，可以观察到芽体从母细胞的多个区域萌发，从而形成分支状外观。我们刚刚向您展示了如何在出芽列表中，根据蛋白质浓度来表征和分析形态学表型的发展。进行此操作时，务必记住以推荐的离心速度对细胞进行处理，因为过高的速度可能会损伤细胞。还需要注意的是，应在成像前立即加入亚甲蓝和氯化物，因为它们对光东细胞具有毒性。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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