在芽殖酵母中的蛋白浓度的功能形态学表型的发展分析
2010年3月24日
基因缺失和蛋白表达研究蛋白质功能的常用方法。在这篇文章中，我们描述了作为一个人口功能的蛋白浓度和单细胞水平分析表型的发展协议酿酒酵母。
该方案利用可调节的启动子，允许受控的蛋白质表达。在本实验中，我们使用高拷贝 2 微米质粒，该质粒表达来自蛋氨酸抑制启动子的 N 2 结构域。野生型酵母细胞用它转化。
质粒和转化体在缺乏 uol 的平板上选择。经过一夜生长。在选择性培养基中，细胞因没有皮质醇介导的生长而同步。逮捕。
最后，在时程实验中，通过将细胞转移到缺乏蛋氨酸的培养基中来诱导表达。通过蛋白质印迹监测蛋白质浓度，通过显微镜观察形态学表型开发。大家好，我是普渡大学生物科学系的 Claudia。
我是 de Bari Muji 在鼻翼，我是 AL 实验室。今天，我们将向您展示一个分析形态表型发展与体内诱导中蛋白质浓度的函数的程序。我们在实验室中使用该程序来研究在内吞适应性蛋白的 N 2 结构域过表达时观察到的细胞分裂表型的形态学和分子方面。
那么让我们开始吧。该方案从构建将表达您感兴趣的蛋白质的酵母菌株开始。在我们的例子中，我们在蛋氨酸抑制启动子 2 毫摩尔蛋氨酸抑制启动子的控制下，用含有第 n 个 2 的高拷贝血浆 DNA 转化野生型酵母菌株 W 3 0 3 抑制 met 25 启动子活性。
虽然缺乏蛋氨酸的培养基允许最大表达，但从含有最近转化细胞的板中挑选 6 个菌落，并在锥形瓶中接种 50 毫升选择性培养基和 0.2 毫摩尔蛋氨酸，在 30 摄氏度下孵育过夜，第二天早上以 200 RPM 振荡。通过测量 600 纳米培养物的光密度来估计细胞密度。将相当于每毫升 20 OD 600 纳米的细胞转移到无菌离心管中，并通过离心收获。
通过涡旋将细胞悬浮在 YPD 培养基中，以将细胞周期 aole 从 1 毫克/毫升的 DMSO 储备液中同步至 15 微克/毫升的最终浓度。在 30 摄氏度下孵育 4 小时，并以 200 RPM 的速度摇动。4 小时后，检查有丝分裂中停滞的细胞百分比。
通过在显微镜下观察并计算具有相同大小芽的细胞数量，进行下一步。仅当停滞大于 90% 时以 2200 RPM 离心 5 分钟收获细胞。用冰冷水洗涤 3 次后，复苏，将沉淀悬浮在缺乏蛋氨酸的选择性培养基中，细胞密度约为 0.5 OD 600 纳米/毫升。
将一半体积的细胞转移到新的无菌管中，并添加蛋氨酸至终浓度为 0.2 毫摩尔。这将作为对蛋白质表达基础水平影响的对照。将两种培养物放回 30 摄氏度的培养箱中。
每小时分析细胞的表型发育，每次 6 小时。将每种培养物的 1 毫升细胞悬液点转移至无菌微量离心管中，离心收获细胞，吸出上清液，并将沉淀重新悬浮在 70 微升培养基中。然后从每毫升 1 毫克的原液中加入 30 微升亚甲蓝，溶于无菌水中。
接下来，将大约 6 微升这种悬浮液移液到干净的载玻片上，并在液滴上盖玻片。轻轻按压盖玻片，在玻璃界面之间形成一层薄而均匀的细胞。将盖玻片分成九个象限，每个象限拍摄三张图像。
每个字段的细胞数不应大于 30 个细胞，以便进行准确定量。计算显示所研究表型的细胞数，在本例中是具有细长和/或连贯芽的芽细胞，这些芽无法彼此分离。我们还计算了自 n 日诱导细胞分裂缺陷以来由蓝色识别的死细胞的数量。
两次过表达导致细胞死亡，每次都能显示表型特异性缺陷。将 1 毫升培养物分装在无菌微量离心管中，并通过离心 reus 收获细胞。将细胞沉淀悬浮在 100 μL（每毫升 1 毫克）的 cal 白色无菌水中溶液中，并在室温下避光孵育 5 分钟。
用钙蛋白染色可实现 e 细胞壁的可视化。用一个 XPBS 洗涤沉淀 3 次。我们将最终沉淀悬浮在 100 μL PBS 中。
在显微镜下观察细胞，并使用紫外光学器件以 100 倍放大倍率获取图像，以可视化细胞壁。为了可视化 GFP 标记的 septin 使用 FS E 过滤器获取图像，使用前面显示的方法量化具有细胞壁缺陷和 septin 错误定位的细胞的百分比，方法是将盖玻片分成九个象限，每个象限拍摄三张图像用于计数 TimeLapse 视频。单个酵母细胞的显微镜检查需要培养基包埋 agros 床以形成 agros 床。
首先用 70% 酒精清洁带有凹陷凹陷的载玻片，并在载玻片风干时让它风干。将 0.06 克 agros 放入 5 毫升不含蛋氨酸的选择性培养基中，在微波炉中煮沸，直到 agros 完全迅速溶解。在载玻片中移取 200 微升含 agris 的培养基。
压低并倒置另一个干净的玻璃载玻片，确保下面没有气泡。当凝胶凝固时，将顶部的载玻片平稳地从凹陷载玻片上移开，始终保持其表面平行。这确保了 agros 床的表面与凹陷滑梯的表面齐平。
用精致的纸巾清洁 agros 床周围的滑动区域。玻片现在可以使用了，时间等于 4 小时。将 1 毫升细胞从培养物中转移到无菌微量离心管中，并通过离心收获。
吸出上清液，并将细胞重悬于 100 μL 不含蛋氨酸的新鲜选择性培养基中。将凡士林涂抹在盖玻片的边缘。然后将一滴细胞悬液滴在 agros 床的中心，并通过轻轻按压盖玻片将其均匀涂抹。
密封盖玻片的边缘，并通过在边缘铺上指甲油来固定其位置。指甲油干燥后，将载玻片放在显微镜的加热载物台上。我们使用配备蔡司 Axio camm、MRM 单色数码相机的蔡司 Axio 200 M 显微镜来选择包含不超过 10 个细胞的视野，并且间隔足够，因为该视野会随着时间的推移而变得拥挤。
随着细胞分裂，每 5 分钟拍摄一次视野图像，持续约 5 小时。以避免反复重新调整焦距。我们对图像采集软件进行编程，以便在每个时间点自动采集一些 Zack 图像。
稍后将选择具有最佳焦点的图像进行电影组装，以确保细胞有足够的热量，除了在整个成像表型回归期间保持显微镜透射白光开启而提供的加热阶段外，还可以通过使用 Image J 软件将图像组装成电影来研究外部热源。在这里，我们显示了过表达目标蛋白的代表性结果。第 N 个。
首先，第 n 个蛋白质的表达 2.在实验过程中，测定来自表达 HA 的细胞的裂解物，使用单克隆抗 HA 抗体通过蛋白质印迹分析第 2 个，如免疫印迹所示，在 0.2 毫摩尔蛋氨酸存在下生长的细胞具有最低的蛋白质表达。然而，在缺乏蛋氨酸的培养基中生长的细胞在实验过程中显示 S 2 浓度的持续升高。
接下来，分析在存在或不存在蛋氨酸的情况下生长 6 小时的细胞，因为低第 n 2 浓度不能仅诱导细胞分裂表型或细胞死亡。用亚甲蓝染色后呈蓝色表示，低百分比的细胞死亡。同样，每个细胞的细胞核数、细胞壁和隔膜蛋白组织也符合预期。
相反，M 2 的过度表达会导致大量的细胞分裂缺陷和细胞死亡，如连接的细长芽的长链所示，这些芽在用亚甲蓝染色时仍保持蓝色。大多数表型细胞是多核的，如 DPI 染色所示。钙化白染色显示异常细胞壁斑块的积累。
此外，septin 的定位严重错误且杂乱无章。作为时间函数的表型定量显示在此图中，其中空心圆圈代表零毫摩尔蛋氨酸，闭合圆圈代表 0.2 毫摩尔蛋氨酸。我们在这里看到，随着时间推移，细胞中第 n 个浓度的积累，显示细胞分裂表型的细胞百分比也会上升。
对照细胞在 0.2 下生长。毫蛋氨酸表明表型发育是蛋白质浓度升高的函数，而不是由于细胞培养条件。最后，通过延时视频显微镜捕获第 n 次过表达时的表型发展。
第 n 小时后，两个过表达细胞表现出轻度形态学细胞分裂表型。随着电影的进行，我们看到顶芽生长异常和延长，从而产生非常细长的芽。我们还在细胞分离事件发生之前看到新芽出现的事件。
此外，观察到芽从母细胞的几个区域出现，从而产生一个分支。我们刚刚向您展示了如何表征和分析形态表型的发展与出芽列表中的蛋白质浓度的函数关系。通过执行此程序，请务必记住以推荐的离心速度抚摸细胞，因为更快的离心速度可能会损坏细胞。
同样重要的是要记住在成像前添加亚甲蓝和氯化物，因为它们对 Light East 细胞有毒。因此，感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概览
本文介绍了一种基于蛋白质浓度分析酿酒酵母表型发展的协议。该研究集中于群体和单细胞水平，利用可调控启动子来控制蛋白质表达。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 遗传学
背景
- 基因缺失和蛋白质过表达是研究蛋白质功能的常见方法。
- 了解蛋白质浓度效应对于表型分析至关重要。
- 酵母作为此类研究的模式生物。
- 可调控启动子允许精确控制蛋白质表达水平。
研究目的
- 分析蛋白质浓度和表型发展之间的关系。
- 为该领域的研究人员提供详细协议。
- 增强对酵母中蛋白质功能的理解。
使用的方法
- 利用高拷贝两微米质粒。
- 从蛋氨酸可抑制启动子表达N两个域。
- 用质粒转化野生型酵母细胞。
- 在选择性培养基上筛选质粒和转化子。
主要结果
- 成功用质粒转化酵母细胞。
- 通过可调控启动子实现了受控的蛋白质表达。
- 在群体和单细胞水平分析表型发展。
- 获得了蛋白质浓度对酵母表型影响的见解。
结论
- 该协议提供了一种可靠的方法来研究酵母中的蛋白质功能。
- 受控的蛋白质表达对于准确的表型分析至关重要。
- 这种方法可以应用于分子生物学的各种研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables quantitative analysis of morphological phenotypes as a function of protein concentration, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By linking protein expression levels to cellular outcomes, it provides predictive confidence for pathway interrogation and phenotypic screening in yeast-based model systems. The approach aids in prioritizing targets with clear dose-response relationships, reducing ambiguity in functional genomics campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating protein concentration with phenotypic severity.
- Operational Value: Supports functional target validation through dose-dependent phenotype quantification.
- Scientific Value: Facilitates biological de-risking by identifying concentration thresholds for observable defects.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated yeast strains for reproducible, quantitative screening of genetic or chemical modulators.
- Operational Value: Standardizes phenotype readouts via microscopy and staining, enabling scalable assay formats.
- Scientific Value: Generates concentration-dependent output data useful for hit confirmation and structure-activity relationship early exploration.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant phenotypes (e.g., cell division defects) to model conserved cellular processes in a genetic system.
- Operational Value: Ensures continuity from molecular target engagement to phenotypic outcome in a controlled expression system.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement by defining protein concentration windows associated with specific mechanistic outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, connecting target modulation to phenotypic readouts before lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling titration of protein expression to observe pathway-specific phenotypes.
- Screening: Delivers assay-ready, genetically encoded systems with quantifiable, concentration-dependent outputs.
- Analytics: Provides microscopy-based quantification of phenotypic penetrance and subcellular localization defects as functional readouts.
- Translational Research: Links target perturbation to conserved cellular phenotypes, supporting extrapolation to higher eukaryotes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying any protein where concentration-dependent morphology informs function.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target function by reducing mechanistic ambiguity through dose-response profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via inducible expression and blinded phenotypic scoring.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying concentration thresholds linked to on-target vs. off-target effects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization based on phenotypic sensitivity and dynamic range.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics, molecular cloning, and fluorescence microscopy.
- Dependent on inducible expression systems, centrifugation equipment, and imaging infrastructure.
- Necessitates standardization across teams for staining protocols, imaging settings, and phenotype scoring criteria.
- Adaptation to other model systems may require promoter optimization and phenotypic validation.
- Phenotype penetrance may vary with genetic background, necessitating isogenic controls for accurate interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:49
Introduction
1:30
Cell Culture and Protein Induction
11:55
Effects of ENTH2 Overexpression
4:00
Quantification of Cell-Division Phenotype and Cell Death
7:58
Determination of Phenotype Development at the Single Cell Level by Time-Lapse Video Microscopy
5:32
Visualizing Phenotype-Specific Defects by Fluorescence Microscopy
14:23
Conclusion
