Name: 裂殖酵母的活细胞定量荧光显微镜分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: 学习使用定量活细胞荧光显微镜技术分析裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe的亚核基因组组织结构，探究不同生长条件和突变对染色质动态与基因调控的影响机制。

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我们感谢Hiraoka教授向我们提供了菌株。本研究得到了Goran Gustafsson基金会和瑞典癌症协会（2008/939）的资助。

1. 裂殖酵母培养
<ol>
	<li>制备爱丁堡基本培养基（Edinburgh Minimal Media, EMM）以及不含氯化铵的EMM培养基（EMM-N）8。为降低自发荧光，葡萄糖溶液不应进行高压灭菌，而应使用0.2 μm滤膜过滤除菌，随后加入已高压灭菌的培养基中。</li>
	<li>将新鲜在富含培养基YEA8琼脂平板上培养的裂殖酵母细胞接种至3 mL含过滤除菌葡萄糖的EMM液体培养基中。使用13 mL试管，并将管盖轻轻旋紧以保证细胞良好通气。在30 °C、225 rpm振荡条件下培养细胞。每天早晚通过血球计数板（Burker chamber）计数并进行适当稀释，使细胞持续保持在对数生长期（1 × 106 - 2 × 107 个细胞/mL），共培养2天。</li>
	<li>实验当天，确保细胞处于对数生长期早期，密度为5 × 106 - 1 × 107 个细胞/mL。</li>
	<li>为进行氮饥饿处理，将细胞在EMM-N培养基中饥饿20分钟。具体操作如下：在台式离心机中以不超过1.5 rcf的转速离心收集3 mL细胞至1.5 mL离心管中，因较高转速可能导致裂殖酵母产生应激反应9。采用双次离心法，即：先以1.5 rcf离心2分钟，然后将离心管旋转180°，再次以1.5 rcf离心2分钟10，以确保所有细胞集中形成单一沉淀。用EMM-N洗涤一次后，将沉淀重悬于EMM-N培养基中，在30 °C、225 rpm振荡条件下孵育15分钟，随后进入步骤2的样品制备阶段。</li>
</ol>
2. 样品制备
<ol>
	<li>在台式离心机中以最大1.5 rcf的转速离心1.5 mL细胞，收集至1.5 mL离心管中，因为更高的离心速度可能诱导裂殖酵母产生应激反应9。采用双次离心法，即：先离心2分钟，然后将离心管旋转180°，再次以1.5 rcf离心2分钟10。这有助于将所有细胞集中形成一个位于管底的沉淀。</li>
	<li>吸除上清液，但保留10–15 μL，并用残留的培养基重悬细胞。或者，加入10 μL新鲜培养基以重悬细胞沉淀。</li>
	<li>确保使用干净的载玻片和盖玻片（No 1.5）。通常无需清洗，但需确保其无灰尘。</li>
	<li>从冰箱中取出一份已过滤除菌的1 mg/mL凝集素储备液。该凝集素溶液可反复冻融数次。凝集素用于将酵母细胞固定在盖玻片上。</li>
	<li>在载玻片上滴加5 μL含过滤除菌葡萄糖的EMM培养基。</li>
	<li>在盖玻片的一角滴加5 μL凝集素溶液，随后在同一位置即凝集素液滴中加入5 μL细胞培养物。通过移液器吹打数次混匀，然后用移液器吸头的长边将细胞-凝集素混合液均匀涂布至整个盖玻片表面。根据细胞混合物的密度，可保留全部液体，或在盖玻片对角处吸除多余液体。</li>
	<li>将盖玻片正面朝上，一侧置于载玻片上，另一侧置于实验台上。让盖玻片干燥数分钟。切勿使其完全干燥，但也不应残留过多液体。</li>
	<li>将盖玻片以约70°角倾斜，一端接触载玻片上的EMM液滴。松开盖玻片，使其正面朝下自然落入EMM液滴中。</li>
	<li>为用硅脂密封边缘，准备一支2 mL注射器。剪去200 μL吸头的宽端，并将其连接至注射器。向注射器中装入约1 mL硅脂。轻轻推动活塞，在盖玻片边缘均匀涂抹一条细硅脂线。此时即形成一个小型的S. pombe细胞培养腔室。</li>
</ol>
3. 显微镜检查
<ol>
	<li>通过打开汞/氙灯、显微镜和计算机来启动荧光显微镜。将酵母培养室放置在荧光显微镜载物台上。使用63倍或100倍、数值孔径（NA）≥1.3的物镜。若使用油镜，请添加镜油。</li>
	<li>使用明场观察找到细胞，并获得清晰的图像。</li>
	<li>荧光显微镜的设置取决于用于标记酵母细胞的荧光染料以及所用显微镜的型号。我们使用蔡司LSM 700激光共聚焦显微镜，配备Plan-Apochromat 63倍油镜（NA=1.4），扫描设置为16线平均平面扫描。针孔应设为1–1.1艾里单位，以获得0.8 mm的光学切片厚度。在通道1中检测GFP，使用Alexa 488滤光片组，分光镜设置为582 nm，检测波长范围为488–582 nm。在通道2中使用适用于mCherry的最佳滤光片组，分光镜设置为578 nm，检测波长范围为578–600 nm。这意味着在通道2中将同时检测到mRFP（SPB）和NM（mCherry）信号。</li>
	<li>为每种菌株采集足够数量的图像，以便能够对60个不同的细胞进行测量。通常采集15个独立显微视野的图像即可满足要求。如果显微观察时间超过60分钟，建议更换新的培养室并使用新鲜细胞。</li>
</ol>
4. 细胞内距离的定量测量
<ol>
	<li>在 Zeiss Zen Light Edition 程序中打开图片。使用测量工具测量所有信号位于同一焦平面的细胞中不同荧光染料之间以 μm 为单位的距离。调整光强和对比度以确定荧光信号的中心位置。该简化方案仅使用两种不同颜色，因此纺锤体极体（SPB）和核膜（NM）位于同一通道中。SPB 可通过其在核膜内的大型圆形结构加以区分。将测得的距离记录到记事本中。至少测量 60 个细胞。也可使用其他程序（如 ImageJ）进行距离测量，但 Zeiss Zen Light 更受推荐，因其图像分辨率更高，且该程序具有更便捷的缩放功能。在 ImageJ 中打开的 lsm 格式图片会将两个通道叠加显示。若要生成包含两个通道的图像，需先将两个通道拆分，然后合并。之后可使用直线工具按上述方法测量距离。</li>
	<li>使用统计学软件（例如 SigmaStat-3.5）比较不同菌株和处理之间的平均值或中位数亚细胞距离，可采用 t 检验或 Mann-Whitney 秩和检验。由于所有信号必须处于同一焦平面才能测量，通常会选择荧光信号间距较短的细胞，导致数据往往不符合正态分布。仅当数据符合正态分布时方可使用 t 检验，而 Mann-Whitney 秩和检验则可用于比较非正态分布的数据集。t 检验用于比较两个不同数据集的均值，而 Mann-Whitney 秩和检验则用于比较中位数。</li>
</ol>
5. 代表性结果
菌株PJ1185:h+ his7+::dis1placR-GFP Chr1[::ura4+ hphMX6 lacO] sid4-mRFP::kanMX6 cut11-mCherry::natMX6 ura4-D18 leu1-32 ade6-DN/N 在EMM培养基中培养细胞。取样后将细胞置于小型生长室中并拍摄图像（图1A +N）。随后将培养基替换为不含氯化铵的EMM（EMM-N），细胞在振荡条件下继续培养15分钟。将氮饥饿处理后的细胞置于含EMM-N的生长室中，并拍摄图像（图1A -N）。使用测量工具测定基因座（GFP）与SPB之间的距离（图1B和表1）。同时测定基因座（GFP）与核膜（NM）之间的距离（图1B和表2）。利用SigmaStat-3.5软件比较氮剥夺前后亚细胞距离的中位数（表3）。结果显示，基因簇的定位发生统计学上显著的移动，即从核膜向SPB方向迁移。GFP与SPB间距离的测量数据呈正态分布，因此采用平均距离（1.777 μm +N 和 1,587 μm -N）可使用以下方法进行比较： t-检验（表1和表3）。两个均值之间存在显著差异（P = 0.008, t-检验）。测量GFP与NM之间距离的数据不符合正态分布，因此采用中位距离（0 μm +N 和 0.390 μm - N）之间的比较采用 Mann-Whitney 秩和检验（表 2 和表 3）。两个中位数之间存在显著性差异（P &lt; 0.001，Mann-Whitney 秩和检验。
<img alt="比较氮充足与氮缺乏样本的显微图像，含距离测量；荧光分析。" src="/files/ftp_upload/3454/3454fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 名为Chr1的基因簇在氮饥饿后其定位发生改变。（A）左列，+N，为在EMM培养基中培养的细胞的代表性细胞核；右列，-N，为在EMM-N培养基中培养的细胞的代表性细胞核。绿色为标记Chr1基因簇的GFP信号，红色分别为标记SPB和NM的mRFP与mCherry信号。（B）与（A）相同的细胞核，但已测量核内距离；黄色：细胞核直径；蓝色：SPB与GFP信号之间的距离；粉色：GFP信号与核膜之间的距离。
<img alt="静态平衡数据表；GFP-SPB、GFP-NM的测量结果；实验结果分析。" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1a.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="表 1"> 
<img alt="包含数值的科研数据分析表。" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1b.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="表 1"> 
<img alt="包含数值的数据分析图表，适用于统计研究或科学研究。" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1c.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="表 1"> 
表 1. 在EMM培养基中培养的PJ1185菌株的亚核距离测量值（单位：μm）。第一行为细胞直径（d），第二行为GFP与SPB之间的距离，第三行为GFP与NM之间的距离。
<img alt="显示GFP-SPB和GFP-NM蛋白测量数据的数据表。" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2a.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Table 2"> 
<img alt="数据分析；以列格式显示的数值数据集；用于统计评估和研究。" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2b.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Table 2"> 
<img alt="包含数值的数据表，适用于统计分析或研究数据解释。" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2c.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Table 2"> 
表 2. 在EMM-N培养基中培养的PJ1185菌株的亚核距离测量值（单位：μm）。第一行为细胞直径（d），第二行为GFP与SPB之间的距离，第三行为GFP与NM之间的距离。
<img alt="细胞测量数据表；显示细胞计数、平均值、中位数、GFP-SPB/NM 分析结果。" src="/files/ftp_upload/3454/3454table3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="表 3"> 
表 3. 菌株 PJ1185 在氮充足（+N）和氮饥饿后（-N）条件下观察到的核内距离的描述性统计结果。第一行：测量的细胞数量；第二行：平均直径（d）；第三行：中位直径（d）；第四行：GFP 与 SPB 之间的平均距离；第五行：GFP 与 NM 之间的中位距离。

<ol><li>Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-802 (1994).</li>
<li>Robinett, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator%2Frepressor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> J. Cell. Biol. 135, 1685-1685 (1996).</li>
<li>Bahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14, 943-943 (1998).</li>
<li>Asakawa, H., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+fluorescence+imaging+of+meiotic+chromosome+dynamics+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Live-cell fluorescence imaging of meiotic chromosome dynamics in Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods. Mol. Biol. 558, 53-53 (2009).</li>
<li>Alfredsson-Timmins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+chromatin+is+an+early+response+to+nitrogen+starvation+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Reorganization of chromatin is an early response to nitrogen starvation in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 118, 99-99 (2009).</li>
<li>Kristell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+depletion+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe+causes+nucleosome+loss+in+both+promoters+and+coding+regions+of+activated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Res%22%5BJournal%5D)">Nitrogen depletion in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe causes nucleosome loss in both promoters and coding regions of activated genes.</a> Genome. Res. 20, 361-361 (2010).</li>
<li>West, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cut11%28%2B%29%3A+A+gene+required+for+cell+cycle-dependent+spindle+pole+body+anchoring+in+the+nuclear+envelope+and+bipolar+spindle+formation+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">cut11(+): A gene required for cell cycle-dependent spindle pole body anchoring in the nuclear envelope and bipolar spindle formation in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol. Biol. Cell. 9, 2839-2839 (1998).</li>
<li>Tomlin, G. C., Morrell, J. L., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+pole+body+protein+Cdc11p+links+Sid4p+to+the+fission+yeast+septation+initiation+network%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The spindle pole body protein Cdc11p links Sid4p to the fission yeast septation initiation network.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 1203-1203 (2002).</li>
<li>Funabiki, H., Hagan, I., Uzawa, S., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-dependent+specific+positioning+and+clustering+of+centromeres+and+telomeres+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-dependent specific positioning and clustering of centromeres and telomeres in fission yeast.</a> J. Cell. Biol. 121, 961-961 (1993).</li>
<li>Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+analysis+of+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods. Enzymol. 194, 795-795 (1991).</li>
<li>Soto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+centrifugation-induced+gravity+forces+through+mitogen-activated+protein+kinase+pathways+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transduction of centrifugation-induced gravity forces through mitogen-activated protein kinase pathways in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Microbiology. 153, 1519-1519 (2007).</li>
<li>Hagan, I. M., Ayscough, K. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHagan%2C+IM+%22Fluorescence+microscopy+in+yeast%22">Fluorescence microscopy in yeast</a>. Allan, V. J. , University Press. Oxford. (2000).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+and+exploiting+the+fluorescent+protein+paintbox+%28Nobel+Lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 5612-5612 (2009).</li>
<li>Mackay, D. R., Ullman, K. S., Rodesch, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+Imaging+of+Mitosis+After+siRNA+Transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection.</a> J. Vis. Exp. (40), e1878-e1878 (2010).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

在过去的十年中，利用活细胞成像技术监测细胞事件变得越来越普遍。该技术最初使用来自水母Aequorea victoria的绿色荧光蛋白，如今已有多种不同的荧光染料可供使用，其发射光谱覆盖从青色（475 nm）到远红光（648 nm）的广泛范围11。与免疫荧光相比，活细胞成像的一个主要优势在于，显微观察前细胞无需经过甲醛或乙醇/丙酮处理进行固定，从而避免了固定过程可能带来的假象。此外，活细胞成像能够对单个细胞进行连续追踪，并在数小时甚至数天的培养过程中频繁拍摄图像，从而获得细胞事件的动态影像12。哺乳动物细胞的优势在于其体积较大，直径约为100 μm，相比之下，酵母细胞较小，直径仅为3–4 μm。而酵母的优势则在于其基因组易于操作。酵母中的同源重组效率很高，常被用于将目标蛋白与不同的荧光染料融合3。此外，通过靶向整合lacO序列并随后表达LacR-GFP蛋白，可在细胞核内特异性地检测基因组的特定区域2。使用S. pombe细胞进行显微观察具有额外的优势，因为它们是天然的单细胞生物，在低成本的细胞培养条件下即可快速增殖。此外，S. pombe是一种优秀的真核模式生物，因其含有与后生动物同源的基因。
该技术的主要局限性之一是酵母细胞中的自发荧光会干扰真实信号的检测。通过使用经滤膜除菌的葡萄糖替代高压灭菌的葡萄糖，并采用最低限度培养基，可克服这一问题。此外，酵母细胞在制片前应在对数生长期培养2天。本文所介绍的方案提供了一种相对简单但具有定量性的方法，用于确定蛋白质在酵母细胞内的亚细胞定位。此外，通过在不同时间点拍摄图像，我们可以追踪细胞内的动态过程。

<table><tbody><tr><td>凝集素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1395</td><td></td></tr><tr><td>硅脂</td><td>道康宁</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;激光扫描显微镜&lt;/p&gt;LSM 700</td><td>卡尔·蔡司股份有限公司</td><td>LSM 700</td><td>其他共聚焦显微镜也可使用。</td></tr><tr><td>SigmaStat&lt;sup&gt;&lt;/sup&gt;3.5</td><td>Statcon</td><td>SigmaStat&lt;sup&gt;&lt;/sup&gt;3.5</td><td>任何可用于统计分析的软件均可使用。</td></tr></tbody></table>

裂殖酵母的定量活细胞荧光显微镜分析

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

目前有多种显微技术可用于检测细胞内特定蛋白质。在过去十年中，利用绿色荧光蛋白（GFP）等荧光染料直接标记目标蛋白进行活细胞成像的方法日益普及1。通过使用GFP及类似的荧光染料，可在荧光显微镜下观察蛋白质的亚细胞定位及其运动情况。此外，该技术也可用于研究染色体某一区域在细胞核内的亚核定位。将GFP与Lac阻遏蛋白（LacR）融合，并在染色体上已插入lacO序列串联重复片段的目标区域的细胞中异位表达2。LacR-GFP会结合到lacO重复序列上，从而使基因组的该区域在荧光显微镜下呈现为绿色荧光点。酵母特别适用于此类操作，因为其同源重组效率很高，能够实现lacO重复序列以及与GFP构建的融合蛋白的靶向整合3。本文描述了一种用于裂殖酵母活细胞分析的定量方法。其他关于裂殖酵母活细胞分析的实验方案也可参考，例如如何制作减数分裂过程中染色体行为的动态影像4。在本实验中，我们重点关注亚核结构组织及其在基因诱导过程中的变化。我们通过在基因附近引入lacO结合位点，对一个名为Chr1的基因簇进行了标记。该基因簇富含在裂殖酵母氮源饥饿早期即被诱导表达的基因5。在实验菌株中，通过将mCherry标记到核膜蛋白Cut11上，使核膜（NM）呈现红色荧光信号。纺锤极体（SPB）组分Sid4与红色荧光蛋白融合（Sid4-mRFP）6。在营养生长状态的酵母细胞中，着丝粒始终与嵌入核膜中的SPB相连7。SPB在核膜上表现为一个较大的圆形结构。通过在氮源耗尽前及耗尽后20分钟进行成像，可测定基因簇（GFP）与核膜/SPB之间的距离。比较氮源耗尽前后基因簇与核膜/SPB的平均或中位距离，即可定量分析氮源耗尽后该基因簇的亚细胞定位是否发生改变。

裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）是研究基本细胞过程的良好模式系统。本文介绍了一种对裂殖酵母进行定量活细胞分析的方法。在本实验中，我们重点关注细胞核内基因组的组织结构，但该方法也可用于研究胞质因子。

目前有多种显微技术可用于检测细胞内特定蛋白质。在过去十年中，利用活细胞成像……

以下实验的总体目标是定量测量酵母细胞中核内结构的组织方式，以及生长条件变化或突变对其造成的影响。该目标通过在可最大限度降低自发荧光的条件下将酵母细胞培养至对数生长期来实现。随后，将细胞置入显微镜观察用的培养室中进行显微观察。然后拍摄图像以测量细胞中不同荧光标记结构之间的距离。获得的结果显示了非核结构组织的差异，这种差异取决于酵母培养物生长过程中营养条件的改变。该方法有助于回答表观遗传学领域中关于亚细胞结构组织或染色质与基因调控之间相互作用的关键问题。将裂殖酵母和酵母接种到30毫升试管中的3毫升EMM培养基中。首先准备爱丁堡最低限度培养基（EMM），或含有氯化铵的EMM培养基，以降低自发荧光，而不是对培养基进行高压灭菌。使用0.2微米滤器对葡萄糖溶液进行除菌，然后将其加入已高压灭菌的培养基中。在富含营养的YEA培养基平板上新鲜培养后，轻轻盖上试管盖，将细胞置于30摄氏度、225 RPM的摇床中培养。每天早晚使用血球计数板计数细胞，并稀释至适当密度，以保持细胞处于对数生长期两天。实验当天。细胞应处于对数生长早期阶段，以应对氮饥饿。将细胞按照书面实验方案中所述步骤进行处理：通过离心将细胞收集至离心管底部形成一个沉淀，使用1.5毫升细胞悬液置于一个eend orph管中，在最大1.5 RCF条件下，先以两分钟离心，然后将管子旋转180度，再进行额外两分钟的离心。弃去上清液，仅保留10至15微升，用剩余的培养基重悬细胞，并加入一等分体积的、经滤膜除菌的、浓度为每毫升含一毫克的凝集素。在盖玻片的角落加入五微升凝集素溶液，并在凝集素液滴中加入五微升培养物。为创建 S. pombe 细胞的生长腔室，用移液器吸取五微升 EMM 滴于洁净载玻片上，将带有培养物的盖玻片以 70 度角倒置在培养基上方，然后自上而下轻轻放下，使其落入 EMM 中，并用硅脂密封边缘。剪去 200 微升枪头的宽端，将窄端连接至 2 毫升注射器上。用注射器吸取约一毫升硅脂。通过轻轻推动注射器活塞，在盖玻片边缘涂上一条细硅脂线，以密封成像生长室。首先使用明场成像来定位细胞并进行观察。获得共聚焦显微镜的清晰图像。我们使用配备63倍油镜（plan apochromat）的蔡司LSM 700激光扫描显微镜，并设置16线平均平面扫描模式。将面积单位设为1至1.1，以获得0.8微米的光学切片。使用激光扫描细胞，检测Alexa 488和mCherry或GFP。每种条件下记录足够数量的图像，以对60个细胞进行测量。更换新的生长室并使用新鲜细胞。成像60分钟后，在Zeen Light Edition程序中打开一幅图像，测量同一焦平面上不同荧光团信号之间的距离。打开测量工具，调节光强和对比度以识别每个荧光信号的中心位置，例如纺锤体极体和核膜，并测量它们之间的距离。将数据转录至记事本表格中。使用统计软件或统计检验方法（如 T 检验或 Mann-Whitney 秩和检验）比较不同菌株和处理之间的亚细胞距离的均值或中位数。在此示例中，菌株 PJ 1 18 5 在 EMM 培养基中培养，并取一份样品置于生长室中进行成像。然后取一份 PJ 1 18 5 的等分试样。将培养物转移至EMMN培养基中，孵育15分钟后取样品放入生长室进行成像。使用测量工具测量基因座与纺锤极体之间的距离，以及基因座与核膜之间的距离。如图所示，在氮饥饿细胞中，基因簇从核膜向纺锤极体移动的距离与在含氮培养基中生长的细胞相比，存在统计学上的显著差异。测量GFP与SBP之间距离的数据呈正态分布，因此可使用T检验比较平均距离。两个均值之间存在显著差异。测量GFP与NM之间距离的数据不符合正态分布，因此使用Mann-Whitney秩和检验比较中位数距离。采用该程序后，两个中位数值之间存在显著差异。还可进行其他方法，如实时 PCR，以进一步探究基因表达水平如何与核内亚结构组织的变化相关联。

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生物学

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获取芽殖酵母荧光延时成像并利用GRAFTS分析单细胞动态

本文介绍了基于流式细胞术和显微镜技术的两种互补方法，可在单细胞水平上定量分析酵母中由MAPK通路激活所诱导的基因表达动态变化。...

单个酵母细胞中MAPK诱导表达的时间定量分析

我们提供了一种可重复的基本方法，用于裂殖酵母有性生命周期的长期显微观察。通过文中所述的少量调整，该方案可使研究聚焦于生殖过程的不同阶段。...

裂殖酵母有性生命周期的显微观察

准确量化囊泡运输事件通常可为特定蛋白质的功能及突变效应提供关键见解。本文介绍了利用对pH敏感的GFP变体——超 ecliptic...

pHluorin在芽殖酵母内吞作用的定量、动力学及高通量分析中的应用

裂殖酵母中细胞分裂事件的时空分析

该单分子荧光原位杂交实验方案经过优化，可用于定量营养生长和减数分裂期间芽殖酵母中的RNA分子数量。...

单分子荧光 原位 芽殖酵母营养生长与减数分裂过程中的杂交（smFISH）分析

本方案描述了利用多色4D（延时3D）共聚焦显微镜对出芽酵母中荧光标记的细胞内区室进行分析的方法。成像参数的选择旨在获取足够信号的同时尽量减少光损伤。通过定制的ImageJ插件，可对标记结构进行追踪和定量分析。...

酵母的4D显微成像

本文介绍了一种非毒性显微成像技术——活细胞成像，该方法可使研究人员在活体裂殖酵母细胞的有丝分裂和减数分裂过程中，观察蛋白质行为及核动态变化。...

利用荧光活细胞显微镜观察裂殖酵母有丝分裂和减数分裂的核动态

活性荧光染料是现代真菌细胞生物学中活细胞成像分析的重要工具。本文详细介绍了已知及较少使用的荧光染料在丝状真菌中用于追踪质膜动态、内吞/外排作用以及细胞壁形态发生的应用方法。...

膜和细胞壁选择性荧光染料在丝状真菌活细胞成像中的应用

此处使用裂殖酵母作为异源宿主，表达与GFP构成融合蛋白的细菌细胞骨架蛋白（如FtsZ和MreB），以观察其聚合行为。同时，通过荧光显微镜成像鉴定影响这些蛋白聚合的化合物。...

以裂殖酵母作为靶向细菌细胞骨架蛋白的抗菌药物筛选平台

本方案详细介绍了两种酵母细胞周期阻滞及可选释放的方法，并阐述了如何利用荧光显微镜研究酿酒酵母（S.

芽殖酵母中细胞周期依赖性过程的操作与分析

学习使用定量活细胞荧光显微镜技术分析裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe的亚核基因组组织结构，探究不同生长条件和突变对染色质动态与基因调控的影响机制。

裂殖酵母的定量活细胞荧光显微镜分析

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