裂殖酵母的活细胞定量荧光显微镜分析
2012年1月23日
裂殖酵母，裂殖酵母，是一个很好的模型系统研究的基本细胞过程。在这里，我们描述了一种方法来执行裂殖酵母活细胞定量分析。在这个特殊的实验中，我们专注于细胞核内的基因组的组织，但该方法也可用于研究细胞质的因素。
以下实验的总体目标是定量测量酵母细胞中的亚核组织，以及它如何受到生长条件或突变变化的影响。这是通过培养酵母细胞在最大限度地减少自发荧光的条件下对数期来实现的。接下来，将细胞放入生长室中，以便在显微镜下观察。
然后拍摄图像以测量细胞中不同荧光标记结构之间的距离。获得的结果表明非核组织的差异，这取决于酵母培养物生长过程中营养条件的变化。这种方法可以帮助回答 epie 领域中关于 subar 组织或染色质与基因调控之间相互作用的关键问题。
Toul 鱼和酵母首先制备 Edinburgh 基本培养基或 EMM 和 EMM，同时还含有氯化铵以减少自发荧光，而不是高压灭菌。使用 0.2 微米过滤器对葡萄糖溶液进行消毒，并将其添加到高压灭菌器培养基中。在 30 毫升试管中接种 3 毫升 EMM，加入鱼和酵母细胞。
YEA 在富集培养基中的琼脂平板上新鲜生长，轻轻盖上试管，并在摇床中以 225 RPM 和 30 摄氏度孵育细胞。每天早晚用 birka 室计数并将它们稀释至适当的密度，将细胞保持在对数期两天。在实验当天。
细胞应该是氮工作人员的早期对数期。细胞是指书面方案中概述的程序，首先将试管旋转 2 分钟，然后将其旋转 180 度再旋转 2 分钟，将细胞收集在管式离心机底部的一个沉淀中，将 1.5 毫升细胞以最大 1.5 RCF 的比例收集在末端孤儿管中。除 10 至 15 微升外，除 10 至 15 微升上清液外，将细胞重悬于剩余的培养基中，即每毫升 1 毫克过滤灭菌凝集素的等分试样。
在盖玻片的一角加入 5 微升凝集素溶液，向凝集素滴剂中加入 5 微升培养物。要创建 S pom 基底细胞的生长室，请在干净的载玻片上吸取 5 微升 EMM，并在培养基上以 70 度角将装有培养物的盖玻片倒置，然后将其自上而下滴到 EMM 上，用硅脂密封边缘。切开 200 μL 吸头的宽端，并将窄端连接到 2 mL 注射器上。
在注射器中加入大约 1 毫升的硅脂。通过轻轻推动注射器的活塞以对生长室进行成像，在盖玻片的边缘涂上一条细线硅。首先使用 Brightfield Imaging 定位细胞并进行挖掘。
获得用于共聚焦显微镜的清晰图像。我们使用蔡司 LSM 700 激光扫描显微镜，配备平场消色差 63 倍油物镜和 16 线平均平面扫描设置。将面积单位设置为 1 到 1.1 以获得 0.8 微米的光学切片。
用检测 Alexa 4 88 和 mCherry 或 GFP 的激光器扫描细胞。记录足够的图像，以便在每个引流管的 60 个单元中进行测量。切换到带有新鲜细胞的新生长室。
成像 60 分钟后，在 Zeen Light Edition 程序中打开图像，以测量同一焦平面内不同荧光团信号之间的距离。打开测量工具并调整光强度和对比度，以识别每个荧光信号的中心，例如纺锤体极体和核膜，并测量它们之间的距离。将数据传输到记事本工作表。
使用统计软件或检验（如 T 检验或 Man Whitney Rank 和检验）比较不同菌株和处理之间的平均或中位亚细胞距离。在这个示例菌株中，PJ 1 18 5 在 EMM 中生长，并将样品放入生长室中进行成像。然后是 PJ 1 18 5 的等分试样。
将培养物转移到 EMMN 中并孵育 15 分钟，然后将样品放入生长室进行成像。该测量工具用于测量轨迹与纺锤体极体之间以及轨迹与核膜之间的距离。如此处所示，与在氮中生长的细胞相比，缺氮细胞中基因簇从核膜向纺锤体极体移动的距离存在统计学上的显着差异。
测量 GFP 和 SBP 之间距离的数据呈正态分布，因此可以使用 T 检验比较平均距离。两个平均值之间存在显著差异。测量 GFP 和 NM 之间距离的数据没有正态分布，因此使用男子惠特尼秩和检验比较中位数距离。
遵循此程序后，两个中位数之间存在显着差异。可以执行其他方法，如实时 PCR，以回答有关基因表达水平如何与亚核组织变化相关的其他问题。
概述
本研究提出了一种用于酵母细胞定量活细胞分析的方法，重点关注裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe细胞核内基因组的组织。该方法允许研究人员调查亚核组织如何受到生长条件和突变的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 遗传学
- 微生物学
背景
- 裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe作为研究细胞过程的模型生物。
- 了解基因组组织对于洞察基因调控至关重要。
- 活细胞成像技术可以揭示动态细胞结构。
- 生长条件的变化可能影响细胞组织。
研究目的
- 定量测量酵母细胞中亚核组织。
- 评估营养条件和突变对基因组组织的影响。
- 提供一种研究染色质动力学和基因调控的方法。
使用的方法
- 酵母细胞在最少培养基中生长到对数期。
- 使用生长室和共聚焦显微镜对细胞进行成像准备。
- 成像荧光标记结构以测量它们之间的距离。
- 进行统计分析以比较不同条件下的距离。
主要结果
- 在不同生长条件下观察到亚核组织的显著差异。
- 荧光信号之间的距离测量表明染色质定位的变化。
- 统计测试确认了观察到的差异的显著性。
- 该方法提供了亚核组织与基因表达关系的洞察。
结论
- 所开发的方法对于研究裂殖酵母的基因组组织是有效的。
- 结果突出了环境因素对染色质动力学的影响。
- 这种方法可以应用于进一步研究基因调控机制。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative live cell fluorescence microscopy in fission yeast enables precise measurement of subnuclear organization and its dynamic response to environmental changes. This capability is critical for de-risking early discovery hypotheses about chromatin architecture and gene regulation. The method supports predictive confidence in target validation and informs portfolio decisions at the intersection of cell biology and functional genomics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of chromatin organization and its impact on gene regulation under defined conditions.
- Supports functional target validation by quantifying spatial genome dynamics in response to perturbations.
- Provides mechanistic de-risking for hypotheses linking nuclear architecture to gene expression changes.
Screening & Assay Development
- Establishes validated live cell imaging systems for reproducible measurement of subcellular distances.
- Facilitates assay standardization through quantitative, statistically analyzable outputs.
- Enables screening of genetic or environmental modifiers affecting nuclear organization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns subnuclear localization changes with gene induction events relevant to disease models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by linking chromatin dynamics to functional readouts.
- Provides predictive de-risking for translational biomarker development when chromatin positioning is implicated.
Pipeline & Workflow Integration
This quantitative imaging method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to preclinical model validation, supporting both mechanistic studies and translational research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on chromatin organization and gene regulation relationships.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for comparing genetic or environmental conditions.
- Analytics: Delivers statistically robust measurements (mean, median distances) for cross-condition analysis.
- Translational Research: Connects nuclear architecture changes to gene induction relevant for disease modeling.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for live cell imaging and quantitative analysis across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies.
- Operational Value: Standardizes live cell imaging workflows and ensures reproducibility of quantitative outputs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing robust data on chromatin dynamics and gene expression relationships.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and pathways based on quantitative nuclear organization data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live cell imaging, fluorescence microscopy, and quantitative image analysis.
- Demands access to confocal microscopy and compatible analytical software for distance measurements.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and statistical analysis methods.
- Adaptation may be needed for different yeast strains or model systems with varying genetic backgrounds.
- Practical limitations include autofluorescence management and ensuring sufficient sample size for statistical power.
