使用多孔膜插入物和RTddPCR分离与定量轴突mRNA

我们的研究探讨局部蛋白质合成的调控机制及其在神经修复、发育和退变中的作用。近期进展包括高灵敏度的 mRNA 检测技术（如 gdPCR），可用于鉴定丰度较低的轴突 mRNA，以及区室化神经元培养技术。开始时，将三唑溶液每份 250 微升分装至若干 1.5 毫升微量离心管中，每管对应六孔板中一个小室或孔。

将离心管置于一旁备用。向第二个六孔板的每个孔中加入 2 mL 无菌 PBS，确保所用孔数或板数与插入式培养小室的数量一致。用移液器吸出插入式培养小室上层和下层的培养基，然后将该小室转移至含有 PBS 的六孔板中。

现在，使用镊子轻轻放入插入物，然后在其上方加入两毫升 PBS。从两侧吸去 PBS，重复一次，洗涤两次。随后将插入物置于新鲜的 PBS 中。

接下来，使用无菌细胞刮刀从插入物表面刮取全部神经元组分。收集插入物中的胞体裂解液，并将其转移至1.5毫升微量离心管中。

将离心管在 10,000 至 15,000 G 条件下离心两分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于 250 微升 Trizol 中。将此离心管标记为全神经元组分。

为收集神经突起组分，将无菌棉签的一端在插入物的整个神经元侧表面从上至下缓慢以之字形模式移动。将插入物旋转90度，使用棉签的另一端重复该操作。然后丢弃棉签。

使用新的拭子，从插入物的中心开始向外做同心圆运动，确保同时清洁边缘部分。将插入物翻转，使神经突侧朝上。使用新的无菌手术刀片切割膜。

将切割后的膜放入含有Trizol的六孔板中，神经突一侧朝下。确保膜完全浸没。随后从孔中收集含有神经突裂解物的Trizol。

将其转移至一个1.5毫升的微量离心管中。随后进行RNA提取，或将胞体和神经突裂解物在-80摄氏度下保存以备后续处理。使用Droplet Digital PCR即用型通用预混液和针对适当互补DNA的目标特异性引物，制备逆转录微滴数字PCR反应体系。

用移液器将反应混合物转移至液滴生成卡盒中。然后将生成油加入卡盒的指定孔中。接着，用垫圈密封卡盒。

使用液滴生成器生成液滴。液滴生成后，将其转移至96孔PCR板中，用铝箔密封，然后将PCR板放入热循环仪中。打开QX Manager软件以开始分析。

单击“浏览”选项并打开要分析的文件。文件加载完成后，仪表板视图将显示在左侧面板中。在单击时按住 Control 键以选择感兴趣的孔位。

单击“1D 振幅”以查看点状图。选择“多孔阈值”可将同一阈值应用于多个孔。根据阳性与阴性液滴之间出现明显分离的位置输入阈值数值。

现在查看数据部分，其中显示了样本描述、浓度值、被接受的液滴数量，以及阳性和阴性液滴计数。点击“保存”以记录阈值设定结果。使用核糖绿检测法进行RNA定量结果显示，全神经元组分每插入孔可获得212.85纳克RNA，而神经突组分每插入孔可获得42.75纳克RNA。

PCR 验证结果显示，引物组一对于 Gap43 转录本具有最高的特异性，仅扩增出一条清晰的单一条带。Gamma-actin 的 PCR 结果不明确，因此使用引物组二进行了温度梯度实验，结果表明在 55 摄氏度时扩增信号最强。RT-ddPCR 振幅图显示，在全神经元和神经突样品中，Gamma-actin 均表现出清晰的液滴分离，证实了转录本的可靠检测。

对于 Gap43，神经突中几乎存在约 23% 的 mRNA 池，而 Gamma-actin 的神经突中仅存在 5% 的 mRNA 池，相较于整个神经元组分。我们已证明在生理条件下轴突中存在应激颗粒结构，这些结构可抑制局部蛋白质合成。我们的方案提供了一种可靠且一致的方法，用于分离神经元区室并检测低丰度环境下的 mRNA。

未来的分析将聚焦于分离和表征不同的轴突亚区，例如生长锥以及轴突主干，而不仅仅局限于整体分析。