Name: 利用多孔膜插入物和RTddPCR分离和定量轴突mRNA (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 学习利用多孔膜插入物和RT-ddPCR技术分离和定量轴突mRNA的方法，实现神经元与神经突的分离及低丰度转录本的绝对定量，为研究mRNA运输和局部翻译提供高灵敏度工具。

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本工作获得了默金周围神经病变与神经再生中心资助（授予 P.K.S.）。

1. 准备用于接种细胞的插件
<ol>
	<li>将具有合适孔径的插入式培养小室放入6孔板中。 
	注意：使用一个1 &#956;m 孔径用于分离轴突与胞体，以及一个 3 &#956;m 孔径大小，用于将所有神经突（轴突和树突）与胞体分离。</li>
	<li>加入100 &#956;将聚-L-赖氨酸（PLL）以每孔2 mL加入6孔板中，并以每孔插入物1 mL加入插入物的底部和顶部，确保其接触插入物底部。</li>
	<li>37℃过夜孵育 &#176;C.</li>
	<li>用无菌超纯水清洗孔板（插入式培养小室底部）和插入式培养小室顶部，共清洗4次&#160;&#215; 5 分钟</li>
	<li>仅针对背根神经节（DRG）神经元，加入5 &#181;g/mL 层粘连蛋白（每孔 2 mL，每插入物 1 mL），在 37 ℃ 下孵育至少 1 小时 &#176;C. 确保插入物的顶部和底部均被均匀涂覆。</li>
	<li>用含有 100 U/mL 青霉素/链霉素的无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤，共洗涤 2 次&#160;&#215; 5 分钟</li>
	<li>继续解剖并接种约 1 &#215; 106 细胞/用于胚胎皮层的插入式培养器5, 海马体45和基底前脑胆碱能神经元31,32对于成年大鼠DRG，每个插入物接种6-8个DRG5,7 (图1).</li>
</ol>
2. 从6孔插件中收集神经元亚细胞组分
<ol>
	<li>按每个插件及6孔板中的一个孔，分别在1.5 mL离心管中分装250 µL TRIzol。置于一旁备用。</li>
	<li>在另一块6孔板中，每孔加入2 mL无菌PBS。所需孔数/板数应与插件数量成比例。</li>
	<li>吸除插件顶部和底部的培养基，并将插件转移至含有PBS的6孔板中。</li>
	<li>用镊子轻轻放置插件，并在插件上方加入2 mL PBS。吸除插件顶部和底部的液体，重复此步骤。总共用PBS洗涤两次，最后使插件浸泡于新鲜PBS中（插件顶部保留1 mL，底部保留2 mL）。</li>
	<li>全神经元组分的分离
	<ol>
		<li>使用无菌细胞刮棒，刮取全神经元组分（插件上表面）。施加适当压力，使细胞开始脱落，但避免膜破损（图1）。</li>
		<li>收集插件中的全神经元&#160;，并转移至1.5 mL离心管中。</li>
		<li>以10000–15000 g 离心2分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀重悬于250 µL TRIzol中。</li>
		<li>将此离心管标记为全神经元组分。</li>
		<li>继续进行神经突组分的收集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>神经突组分的分离
	<ol>
		<li>取一支无菌棉签，用其一端在全神经元侧从上至下缓慢地以之字形方式擦拭。将插件旋转90度，使用棉签另一端重复该操作（若为双头棉签，可使用另一头；若为单头棉签，则更换新棉签）。弃去该棉签（图1）。</li>
		<li>使用新的棉签，从插件中心开始向外以同心圆方式擦拭。确保同时清洁插件边缘（周缘）。</li>
		<li>将膜插件翻转（神经突侧朝上），用新的无菌刀片夹持镊子固定后切割膜。注意保留周边约2–3 mm边缘。</li>
		<li>将切割后的膜放入含有TRIzol的6孔板中，确保神经突侧朝下且完全浸没。</li>
		<li>收集6孔板中含神经突裂解物的TRIzol，并转移至1.5 mL离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于全神经元&#160;和神经突裂解物，可立即进行RNA提取，或将其保存于-80 °C以备后续处理。</li>
</ol>
3. RNA 的分离与定量
<ol>
	<li>RNA 提取 
	注意：此步骤需始终在无 RNase 的环境中操作，使用专用的无菌塑料器皿和手套。
	<ol>
		<li>每 1 mL TRIzol 中加入 0.2 mL 氯仿，剧烈振荡 15 秒，室温孵育 2–3 分钟。在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟，分离为三层：有机相、中间相和含有 RNA 的水相。</li>
		<li>将上层水相转移至新管中，避免接触中间相。为沉淀 RNA，加入等体积异丙醇并轻轻混匀。室温孵育 10 分钟（或在 -20 °C 孵育更长时间以提高得率）以沉淀 RNA。在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟，使 RNA 形成沉淀。</li>
		<li>弃去上清液，用 1 mL 75% 乙醇洗涤沉淀。短暂涡旋后，在 4 °C 下以 7,500 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>溶解 RNA：小心去除乙醇洗涤液，将沉淀在空气中干燥 5–10 分钟，避免完全干燥。用少量无 RNase 的水或 1× Tris-EDTA（TE）缓冲液重悬沉淀，并在 55–60 °C 下孵育以完全溶解。将纯化的 RNA 储存于 -80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 RiboGreen 检测法进行 RNA 定量 
	注意：RiboGreen 检测法（如下所述）采用一种对核酸具有特异性的荧光染料，相比紫外吸收法具有更高的灵敏度、特异性以及检测完整 RNA 的能力。若存在 DNA 污染问题，建议进行 DNase 处理。
	<ol>
		<li>配制 1× TE 缓冲液：将提供的 20× TE 缓冲液用无 RNase 的水稀释 20 倍。配制 RiboGreen 工作液，并用铝箔包裹以保护对光敏感的染料。在高浓度检测范围（10 ng/mL–1 µg/mL）中，将浓缩染料用 1× TE 稀释 1:200；在低浓度检测范围（2.5 ng/mL–50 ng/mL）中，稀释 1:2000。使用 1× TE 对试剂盒中的 RNA 标准品进行系列稀释，以覆盖样品的预期浓度范围。每个标准品设三个重复。</li>
		<li>将 RNA 样品用 1× TE 稀释至适合检测的动态范围内。每个样品设三个重复。</li>
		<li>加入等体积的 RiboGreen 工作液与 RNA 标准品或样品（例如各 100 µL）。室温避光孵育 2–5 分钟。使用适当参数测定荧光值（激发波长约 500 nm，发射波长约 525 nm）。测定并扣除试剂空白读数（1× TE + RiboGreen 染料）。</li>
		<li>分析与定量：以标准品的荧光值对其浓度作图，绘制标准曲线。利用该曲线确定样品中的 RNA 浓度（图 2）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. cDNA 合成
<ol>
	<li>将所有组分在冰上解冻。使用前轻轻弹击每根试管使其混匀，并短暂离心。在冰上的 PCR 管中，为每个反应加入以下组分： 
	RT 预混液 (5x)：4 µL 
	RNA 样本：可变（最多 1 µg 总 RNA） 
	无核酸酶水：加至终体积 20 µL 
	注意：对于无模板对照（NTC），用无核酸酶水替代 RNA 样本。</li>
	<li>轻轻混匀后短暂离心，使液体沉降至管底，然后运行热循环程序。 
	引物退火：25 °C 反应 2 分钟 
	cDNA 合成：55 °C 反应 10 分钟 
	热失活：95 °C 反应 1 分钟</li>
</ol>
5. 引物设计与验证
注意：RTddPCR 引物设计通常遵循与定量 qPCR 相同的原则，但需要额外注意以确保阳性与阴性液滴之间有清晰的分离。可使用 NEB、IDT 或 ThermoFisher 提供的引物设计工具来辅助此过程。成功的 RTddPCR 检测应具有高特异性和稳健的扩增效果，从而在已扩增（阳性）和未扩增（阴性）液滴之间产生明显区分。以下 PCR 引物设计所使用的 NCBI RefSeq 登录号为：
Actg: NM_001127449.1 
上游引物 1：CAGTCTAACAGGGTGGGAAAG 
下游引物 1：CCAACTCAAGGCAAGTAACAAC 
扩增子长度：98 
上游引物 2：GTAGTGATCTGTGCAGGGTATT 
下游引物 2：GACTTTCCCACCCTGTTAGAC 
扩增子长度：118
Gap43: NM_017195.3 
上游引物 1: GGAAATTCTTGCACTGTACCC 
下游引物 1: GACTCCTCAGAACGGAACAT 
扩增子长度: 122 
上游引物 2: CAGTCATCTTGGGAAATTCTTGC 
下游引物 2: CATTGCACACACACACTTGG 
扩增子长度: 116
<ol>
	<li>设计引物时，推荐引物长度为18-30个碱基对，GC含量为40%-60%。确保熔解温度（Tm）在55-65 °C之间，且正向与反向引物的Tm相差不超过2-5 °C。在3′端最后五个碱基内包含一个或两个G或C碱基（即GC夹），以增强结合特异性，但应避免出现连续多个G或C。</li>
	<li>使用比对工具（如美国国家生物技术信息中心（NCBI）的Basic Local Alignment Search Tool（BLAST））验证引物特异性，确保引物仅与目标序列结合。扩增子大小应设计在50-200个碱基对之间，以约100个碱基对为最佳，因为较短的产物扩增效率更高，同时仍可与引物二聚体区分开来。 
	注意：在本研究中，短PCR产物在RT-ddPCR中的扩增效率通常高于较长产物。</li>
	<li>通过设计GC含量为50%-60%的引物、避免二级结构和3′端互补性，以尽量减少引物二聚体的形成。在引物验证过程中，使用琼脂糖凝胶电泳，并始终设置无模板对照以评估引物二聚体情况。</li>
	<li>避免在模板中可能形成二级结构的区域设计引物，因为这会干扰扩增效率。</li>
</ol>
6. RTddPCR
注意：使用 QX200 ddPCR 系统（Bio-Rad）按照制造商说明书以及 Das 等人（2022）43 之前描述的方法进行逆转录液滴数字 PCR（RTddPCR），并进行了少量调整以提高检测的可重复性。
<ol>
	<li>使用适当的 cDNA，结合 ddPCR 即用型通用混合液和靶标特异性引物，配制 RTddPCR 反应体系。</li>
	<li>利用液滴生成仪生成微滴。</li>
	<li>使用液滴读取仪检测终点荧光信号，并通过内置软件分析数据。</li>
	<li>采用以下质量控制措施，以确保精确定量和可重复的液滴生成：
	<ol>
		<li>将同一引物组合始终置于相同的行或列中运行，以最小化孔板效应。</li>
		<li>配制预混液以减少小体积液体的移液操作。</li>
		<li>以低流速移液，防止产生气泡，并使用多通道移液器实现样品均匀分配。</li>
		<li>液滴生成后轻柔操作孔板，并立即密封，防止蒸发。</li>
		<li>所有反应均在冰上配制，避免试剂反复冻融。</li>
		<li>每对引物均设置无模板对照，以监测污染情况。</li>
		<li>分析时排除有效液滴数少于 10,000 个的孔。</li>
		<li>对所有样品进行技术重复实验，以确保结果可重复性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手动检查液滴荧光强度图，验证自动阈值设定的准确性。</li>
</ol>

PKS 持有G3BP1细胞穿透肽用于轴突再生和神经退行性疾病的美国专利。其他作者声明无利益冲突。

&#160; &#160;多个步骤对于可重复性至关重要。插入物的包被必须均匀，以促进神经元黏附；包被不完全会导致神经突/轴突生长不良。细胞接种密度同样重要，密度过高会增加树突交叉，而密度过低则导致轴突RNA不足。刮取-擦拭操作顺序必须精确执行：压力过小会留下胞体污染，压力过大则可能损坏插入物。
引物验证是另一个关键步骤。对每种转录本运行两套独立的引物组合，可筛选出最可靠的引物对，而梯度PCR还能进一步优化退火温度。该操作可减少引物二聚体的形成，提高液滴清晰度，并确保在生物学重复样本中实现可重复的定量结果。尽管该方法能够实现较高的区室纯度，但来自体细胞材料的微量污染仍无法完全排除。轴突RNA的得率本质上较低，限制了需要高输入量的分析方法的应用，例如全转录组测序。该方法的一个关键局限性在于无法区分转录本在远端轴突与近端轴突内的定位。尽管已有文献报道在特定条件下胶质细胞或内皮细胞可通过膜孔延伸，但我们的培养体系最大限度地降低了这种可能性。在成年背根神经节（DRG）培养中，添加阿糖胞苷（cytosine β-D-arabinofuranoside, Ara-C）5,7，以及在其他神经元培养（皮层神经元、海马神经元和基底前脑胆碱能神经元，BFCNs）中使用无血清培养基5,45，可有效抑制胶质细胞和内皮细胞的增殖。此外，本研究中使用的刚性聚碳酸酯或聚对苯二甲酸乙二醇酯（PC/PET）膜不具备弹性，也不允许细胞主动迁移。另外，我们对DRG培养使用孔径为3 µm的插入式培养小室，以允许大直径轴突通过；而对于皮层神经元或BFCN培养，则使用孔径为1 µm的插入式培养小室，进一步限制胶质细胞的迁移。这些特性使我们的装置区别于基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控设备，后者因具有柔性孔道而支持内皮细胞迁移。与既往报道一致34,35,36,40，本研究的分子验证结果显示轴突转录本（如 Gap43）显著富集，而体细胞标记物（如 Actγ）几乎未被检测到，表明穿过膜的物质具有神经元特异性。由于物理屏障并不能完全阻止胶质细胞迁移，研究人员还应使用 Gfap 作为阴性标记进行检测。
与微流控装置相比，插入式系统更简单、更具可扩展性，并且与常规培养工作流程兼容。该系统无需使用专用设备，同时仍能实现可重复的轴突-胞体分离。通过将插入式装置与逆转录数字PCR（RTddPCR）相结合，该方法兼具操作便捷性和高灵敏度，能够对通常低于qPCR检测限的转录本进行绝对定量。本方案适用于研究轴突转录本定位的变化，评估发育、神经毒性或损伤刺激下局部翻译情况，以及探究与神经退行性疾病或神经发育障碍相关的RNA转运缺陷。未来改进方向可能包括采用多重RTddPCR以同时定量多种mRNA，或结合低起始量RNA测序方法以扩大转录组覆盖范围。此外，将该系统应用于人诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元，可进一步拓展其在疾病建模和再生研究中的应用。

神经元是生物学中结构最复杂且极性最强的细胞之一。它们具有细长的突起，有时可延伸超过一米的距离。这种极性以不同的方式使细胞内的通讯和蛋白质稳态变得复杂。为满足这些需求，一种精细的机制是将mRNA运输到轴突和树突等远端区室，并在局部信号的调控下实现其翻译1,2,3。局部翻译使轴突能够以时空特异性的方式合成蛋白质。该过程对于轴突发育、突触可塑性、损伤后的再生以及对发育性和细胞外刺激的响应至关重要4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15。
分析轴突中局部化mRNA功能的能力，对于理解其在正常神经元功能及病理生理学背景下的作用至关重要。轴突mRNA翻译的失调已被证实与多种神经退行性疾病相关16，例如肌萎缩侧索硬化症（ALS）17,18,19、脊髓性肌萎缩症（SMA）20,21以及阿尔茨海默病（AD）22。损伤后轴突的再生高度依赖于细胞骨架蛋白、信号分子和受体的快速而精确的翻译3,23,24,25,26,27,28。尽管这些新概念不断涌现，该领域在有效定量和捕获轴突特异性mRNA群体方面仍面临挑战。
轴突转录组学研究的挑战之一是实现胞体与轴突的清晰分离。由于大多数mRNA在胞体中富集，即使有少量胞体污染，在评估特定mRNA的轴突含量时也可能影响实验结果。传统的技术方法，包括微流控小室29,30,31,32或Campenot小室33，虽可实现轴突的定向生长以及两个区室之间的明确分离，但所获得的轴突产量往往过低，难以满足诸如大量RNA测序（RNA-seq）、RNA共免疫沉淀联合RNA测序或定量聚合酶链式反应&#160;(qPCR)等生化研究的需求。尽管大量RNA-seq和qPCR具有诸多优势，但其灵敏度常常不足以准确识别轴突中低拷贝数的转录本，从而导致对具有生理意义的转录本种类产生错误估计。
为应对这些挑战，我们及其他研究者已采用可渗透膜小室来实现轴突与胞体的物理分离34,35,36,37,38,39,40,41。这类小室允许神经元在微孔表面生长，轴突可穿过微孔延伸至下方腔室，而胞体则被阻隔在上层。这种基础但高效的设计使得大量神经元得以培养，并实现胞体与轴突之间明确的物理分离。基于膜的分离方法具有重要意义，因其避免了微流控装置带来的技术难题，同时可获得足量的轴突材料，适用于分子与生化研究。此外，该小室系统便于开展如机械损伤等操作，因而适用于多种与神经修复相关的实验场景。本文所述方法通过优化培养条件、调整膜孔特性，并结合逆转录数字液滴PCR（RTddPCR）对低丰度轴突RNA样本进行验证&#160;，进一步提高了神经元的产量与纯度。
确保轴突组分的纯度也非常重要。我们仅在仔细去除上层表面残留的胞体物质后，从下室中提取轴突。引物验证显示轴突标志物显著富集，而胞体标志物无或可忽略。分子验证进一步支持这一区分：轴突组分中富含公认的轴突mRNA，如Gap43，而Actγ42的表达水平较低。这表明该小室系统所获得的轴突样本中胞体成分极少，适合进一步分析。
在分离出富集的轴突组分后，接下来的难点在于检测那些拷贝数极低的mRNA。由于轴突组分的起始材料量很少，且轴突中mRNA的拷贝数本身较低，这已接近常规逆转录定量PCR（RT-qPCR）的检测灵敏度极限，而RT-qPCR依赖标准曲线进行定量。此外，RT-qPCR也无法提供特定转录本的绝对拷贝数。相比之下，数字滴定PCR（RTddPCR）可将cDNA样本分割成数千个微滴，利用泊松统计学实现对转录本的精确定量。这使得即使在每纳克总RNA中仅存在少数几个拷贝的转录本，也能被可靠地检测到5,6,7,43。
在本研究中，我们提供了一种简化的实验流程，包括在插入式培养小室上培养不同来源的成年或胚胎啮齿类动物神经元的方法、从整体神经元与轴突富集区室中分离RNA、检测轴突纯度，以及基于RTddPCR的mRNA拷贝数绝对定量。这些方法可用于确定在基础条件下定位于轴突的特定mRNA水平，以及在轴突切断后或受到生长因子刺激或神经毒性信号作用时这些mRNA的变化情况。将该方法与蛋白质共免疫沉淀技术结合，还可用于评估轴突内核糖核蛋白（RNP）复合物的动态变化。例如，我们已广泛使用该方法研究存在于轴突Ras GTP酶激活蛋白结合蛋白1（G3BP1）颗粒中的mRNAs。G3BP1是应激颗粒的核心组分44，我们先前的研究表明，它可抑制轴突局部的蛋白质合成，从而阻碍周围神经系统（PNS）和中枢神经系统（CNS）轴突的再生5。此外，该方法还可用于研究轴突翻译失调在多种病理生理状态中的作用，包括肌萎缩侧索硬化症（ALS）、脊髓性肌萎缩症（SMA）和阿尔茨海默病（AD）。
本研究的目标是建立并验证一种用于检测轴突mRNA的高灵敏度、可重复且可扩展的方法。通过将隔室化插入式培养系统与基于RTddPCR的定量技术相结合，我们为轴突转录组学领域长期存在的难题提供了解决方案。该方法不仅将推动关于局部翻译机制的关键性发现，还将为针对神经修复和神经退行性病变的治疗干预转化研究奠定基础。

<table><tbody><tr><td>适用于6孔板的细胞培养小室，1.0&amp;nbsp;&amp;mu;m孔径，无菌</td><td>Corning</td><td>353102</td><td>耗材</td></tr><tr><td>适用于6孔板的细胞培养小室，3.0&amp;nbsp;&amp;mu;m孔径，无菌</td><td>CELLTREAT</td><td>230603</td><td>耗材</td></tr><tr><td>窄刃细胞刮刀</td><td>VWR</td><td>76036-006</td><td>耗材</td></tr><tr><td>CELLSTAR 6孔组织培养板</td><td>VWR</td><td>82050-842</td><td>耗材</td></tr><tr><td>ddPCR 96孔板&amp;nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>12001925</td><td>耗材</td></tr><tr><td>ddPCR液滴读取仪用油&amp;nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>1863004</td><td>试剂</td></tr><tr><td>用于QX200/QX100液滴生成仪的DG8微流控芯片</td><td>Bio-rad</td><td>1864008</td><td>耗材</td></tr><tr><td>层粘连蛋白（Laminin）</td><td>Gibco/Fisher Scientific</td><td>23017-015</td><td>试剂</td></tr><tr><td>LunaScript RT SuperMix试剂盒</td><td>NEB</td><td>E3010L</td><td>试剂</td></tr><tr><td>基于荧光检测的96孔黑色微孔板</td><td>Thermo Fisher</td><td>M33089</td><td>耗材</td></tr><tr><td>PCR板热封膜，铝箔材质，可穿刺</td><td>Bio-rad</td><td>1814040</td><td>耗材</td></tr><tr><td>多聚赖氨酸（Poly-Lysine）</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td>试剂</td></tr><tr><td>PTC Tempo 96梯度PCR仪</td><td>Bio-rad</td><td>12015382</td><td>设备</td></tr><tr><td>QuantaSoft软件</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>PCR数据分析软件</td></tr><tr><td>Quant-it RiboGreen试剂及RNA定量检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>R11490</td><td>试剂</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-rad</td><td>1864034</td><td>试剂</td></tr><tr><td>用于EvaGreen的QX200液滴生成油</td><td>Bio-rad</td><td>1864005</td><td>试剂</td></tr><tr><td>QX200液滴生成仪</td><td>Bio-rad</td><td>17005227</td><td>设备</td></tr><tr><td>QX200液滴读取仪</td><td>Bio-rad</td><td>17005228</td><td>设备</td></tr><tr><td>TRIzol试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15-596-026</td><td>试剂</td></tr></tbody></table>

使用多孔膜插入物和rtddpcr分离与定量轴突mrna

Isolation and Quantification of Axonal mRNAs Using Porous Membrane Inserts and RTddPCR

mRNA在神经元内的定位与翻译的空间动态对于多种神经元功能机制至关重要，包括神经元连接性、突触可塑性以及对损伤的响应。由于神经元具有极强的极性，许多此类功能依赖于轴突局部翻译特定转录本的能力。然而，对这些亚细胞RNA群体进行定量仍面临技术上的挑战。本文介绍了一种可重复的方法，用于从培养的啮齿类动物神经元中分离出胞体和富含轴突的区室，并对区室特异性的mRNA表达进行定量分析。将原代啮齿类胚胎或成年神经元培养在带有1-3 µm孔径多孔膜的插入式培养装置上。该膜仅允许轴突通过，从而实现胞体与轴突区室的物理分离。随后分别从全神经元和富含轴突的组分中提取RNA，并进一步用于基因特异性引物的逆转录数字液滴PCR（RTddPCR）。该系统可在亚细胞区室之间进行绝对定量比较，实现对定位转录本的高灵敏度检测。该方法可测量稳态RNA丰度，并便于研究在神经营养因子、应激或损伤模型作用下轴突RNA随时间发生的变化。物理区室化与RTddPCR分析相结合，减少了交叉污染，能够精确测定稀有转录本的拷贝数，具有高灵敏度、可重复性，并可检测调控轴突生长与再生的低拷贝数mRNA。该方法还可与下游实验结合使用，例如蛋白质合成测定、RNA稳定性研究，以及利用siRNA或阻断特定蛋白的药物开展干扰实验。重要的是，该技术可适用于不同神经元亚型、发育阶段或损伤模型。总体而言，该方法是一种灵活、灵敏且可重复的研究轴突mRNA定位分子基础及其对神经元功能和疾病机制影响的有效手段。

原代胚胎大鼠皮层神经元、海马神经元及BFCN接种于PLL包被的1 µm小室膜上，5-7天后可牢固贴附并长出穿过膜的神经突 体外 （体外培养天数，DIV）。到第11天时，培养物呈现出密集的神经网络。对于成年大鼠背根神经节（DRG），在PLL包被的3 µm插入式培养小室上再包被一层层粘连蛋白（laminin），有助于在第5天达到相当的轴突延伸水平。这些结果证实，插入式培养小室能够支持神经元的长期生长，并可提供足够的轴突材料用于后续RNA提取。若需扩大规模，可联合使用多个插入式培养小室以获得充足的材料。
从单个插入物中提取TRIzol可获得足量RNA，用于逆转录及后续的数字PCR（ddPCR）。RiboGreen定量结果显示，全神经元组分的RNA产量一致（212.85 ng/插入物），而神经突组分的产量较低（42.75 ng/插入物）（图2）。通常情况下，全神经元组分的RNA产量约为神经突富集组分的5至7倍。
所有引物在进行RTddPCR实验前均经过验证。针对每个目标转录本，至少订购两对引物，并利用从相同神经元样本生成的cDNA通过常规PCR进行测试。选择产生最强且特异性最高的条带的引物对用于RTddPCR（图3A）。例如，我们为Gap43选择了引物组1。对于结果不明确的情况，如Actγ的检测结果，我们进行梯度PCR以优化退火温度（图3B）。这可确保仅使用经过充分验证的引物进行绝对定量，从而降低液滴分离中产生假象的可能性。
刮取和拭子法可有效分离胞体和神经突区室。从整个神经元组分中分离的RNA显示出转录本的富集，例如 Actγ46,47,48,49（图4）。相比之下，轴突/神经突组分的总RNA显著较低，这与其有限的体积一致，但显示出已知定位于远端突起的转录本富集，例如 Gap43（图4）。胞体限制性转录本的交叉检测极少，表明在小心操作并以最佳密度接种时，各区室纯度较高。
阳性结果的特征包括：（1）神经元形态完整，轴突延伸清晰；（2）各室之间分界清晰，膜结构无破裂；（3）经验证的引物可实现阳性与阴性液滴的明确区分；（4）轴突转录本的逆转录数字液滴PCR（RTddPCR）信号强。实验条件不理想时，可能导致RNA得率低、神经突组分中出现胞体标志物提示的交叉污染，或因引物二聚体导致液滴“雨状”背景升高（droplet "rain"）等RTddPCR异常现象。这些问题通常与插入膜损伤、刮取压力过大或引物退火温度未充分优化有关。
<img alt="神经元区室化示意图；RNA提取、cDNA合成、逆转录数字PCR、细胞碎片去除。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig1.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图1"> 
图1：利用膜插件进行区室特异性RNA提取的流程示意图。 将啮齿类动物神经元培养在孔径为1-3 µm的半透膜插件上，允许神经突延伸而限制胞体通过。对于全神经元样本制备，用无菌细胞刮刀刮取上室中的细胞，离心收集后在TRIzol中裂解，进行RNA提取、cDNA合成及逆转录数字PCR（RTddPCR）。随后用无菌棉签清除插件膜上的残留细胞碎片。对于神经突样本制备，将仅含有神经突的插件膜翻转，用手术刀片切割后直接浸入TRIzol中，随后进行RNA提取、cDNA合成及RTddPCR。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="rRNA 浓度与荧光强度关系图，含线性拟合及数据表；基因表达分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig2.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图 2"> 
图 2：使用 RiboGreen 法测定 RNA 标准浓度曲线。（A）采用 RiboGreen RNA 定量检测法，测定一系列稀释梯度的 RNA 标准品的荧光强度。线性回归分析显示 RNA 浓度与荧光信号之间具有高度相关性（R² = 0.9956）。R² 值接近 1，表明 RiboGreen 检测法在 RNA 准确定量方面具有优异的线性关系和可靠性。（B）根据 A 图所得斜率方程（y = 19.738x + 14.905），计算各组分的总 RNA 量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="凝胶电泳图、PCR结果、引物组测试、梯度温度优化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图3"> 
图3：通过PCR和琼脂糖凝胶电泳进行引物验证。（A）使用Actγ和Gap43的cDNA进行PCR扩增，产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，以评估引物特异性。针对每个基因，测试了两套独立的引物组（第1组和第2组）。相邻泳道显示DNA大小标记物（ladder），并标注了分子量（10 kb、0.5 kb、0.1 kb）。可见与预期大小一致的单一清晰条带，表明所选引物组扩增成功且具有特异性。（B）使用Actγ引物组2在梯度温度（55–65 °C）下进行PCR扩增，以确定最佳退火温度。扩增产物与DNA标记物（第2泳道，标注大小）一同在2%琼脂糖凝胶上电泳。在整个测试温度范围内均观察到与预期大小一致的单一扩增条带，其中55 °C时扩增信号最强，提示该温度为此引物组的最佳退火温度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因表达分析；Acty 和 Gap43 图表；数据比较表；RNA 定量结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig4.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：选定转录本的 RTddPCR 分析及 mRNA 拷贝数定量。（A、B）代表性的一维振幅图，显示了（A）Actγ 和（B）Gap43 的液滴分离情况。每个点代表一个单独的液滴，蓝色液滴表示阳性扩增，灰色液滴表示阴性扩增。Y 轴表示振幅，X 轴表示 ddPCR 板中的孔位。阳性（蓝色）与阴性（灰色）液滴之间的清晰分离表明，使用所示引物组可稳健地检测目标转录本。（C）总结了在全神经元和神经突组分中 Actγ 和 Gap43 转录本的拷贝数/µL 及每纳克总 RNA 的拷贝数的表格。拷贝数估计值是通过 ddPCR 液滴计数进行绝对定量获得的（见图 A、B）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本研究介绍了一种利用多孔膜插入物分离轴突mRNA的稳健方法，可实现全神经元与神经突起的分离及RNA纯化。结合RTddPCR技术，该方法能够对低拷贝转录本进行绝对定量，以高灵敏度、高重复性和广泛的实验适用性促进mRNA运输和局部翻译的研究。

使用多孔膜插入物和RTddPCR分离与定量轴突mRNA

神经元内 mRNA 定位与翻译的空间动态对于多种神经元功能机制至关重要，包括神经元……

我们的研究探讨局部蛋白质合成的调控机制及其在神经修复、发育和退变中的作用。近期进展包括高灵敏度的 mRNA 检测技术（如 gdPCR），可用于鉴定丰度较低的轴突 mRNA，以及区室化神经元培养技术。开始时，将三唑溶液每份 250 微升分装至若干 1.5 毫升微量离心管中，每管对应六孔板中一个小室或孔。将离心管置于一旁备用。向第二个六孔板的每个孔中加入 2 mL 无菌 PBS，确保所用孔数或板数与插入式培养小室的数量一致。用移液器吸出插入式培养小室上层和下层的培养基，然后将该小室转移至含有 PBS 的六孔板中。现在，使用镊子轻轻放入插入物，然后在其上方加入两毫升 PBS。从两侧吸去 PBS，重复一次，洗涤两次。随后将插入物置于新鲜的 PBS 中。接下来，使用无菌细胞刮刀从插入物表面刮取全部神经元组分。收集插入物中的胞体裂解液，并将其转移至1.5毫升微量离心管中。将离心管在 10,000 至 15,000 G 条件下离心两分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于 250 微升 Trizol 中。将此离心管标记为全神经元组分。为收集神经突起组分，将无菌棉签的一端在插入物的整个神经元侧表面从上至下缓慢以之字形模式移动。将插入物旋转90度，使用棉签的另一端重复该操作。然后丢弃棉签。使用新的拭子，从插入物的中心开始向外做同心圆运动，确保同时清洁边缘部分。将插入物翻转，使神经突侧朝上。使用新的无菌手术刀片切割膜。将切割后的膜放入含有Trizol的六孔板中，神经突一侧朝下。确保膜完全浸没。随后从孔中收集含有神经突裂解物的Trizol。将其转移至一个1.5毫升的微量离心管中。随后进行RNA提取，或将胞体和神经突裂解物在-80摄氏度下保存以备后续处理。使用Droplet Digital PCR即用型通用预混液和针对适当互补DNA的目标特异性引物，制备逆转录微滴数字PCR反应体系。用移液器将反应混合物转移至液滴生成卡盒中。然后将生成油加入卡盒的指定孔中。接着，用垫圈密封卡盒。使用液滴生成器生成液滴。液滴生成后，将其转移至96孔PCR板中，用铝箔密封，然后将PCR板放入热循环仪中。打开QX Manager软件以开始分析。单击“浏览”选项并打开要分析的文件。文件加载完成后，仪表板视图将显示在左侧面板中。在单击时按住 Control 键以选择感兴趣的孔位。单击“1D 振幅”以查看点状图。选择“多孔阈值”可将同一阈值应用于多个孔。根据阳性与阴性液滴之间出现明显分离的位置输入阈值数值。现在查看数据部分，其中显示了样本描述、浓度值、被接受的液滴数量，以及阳性和阴性液滴计数。点击“保存”以记录阈值设定结果。使用核糖绿检测法进行RNA定量结果显示，全神经元组分每插入孔可获得212.85纳克RNA，而神经突组分每插入孔可获得42.75纳克RNA。PCR 验证结果显示，引物组一对于 Gap43 转录本具有最高的特异性，仅扩增出一条清晰的单一条带。Gamma-actin 的 PCR 结果不明确，因此使用引物组二进行了温度梯度实验，结果表明在 55 摄氏度时扩增信号最强。RT-ddPCR 振幅图显示，在全神经元和神经突样品中，Gamma-actin 均表现出清晰的液滴分离，证实了转录本的可靠检测。对于 Gap43，神经突中几乎存在约 23% 的 mRNA 池，而 Gamma-actin 的神经突中仅存在 5% 的 mRNA 池，相较于整个神经元组分。我们已证明在生理条件下轴突中存在应激颗粒结构，这些结构可抑制局部蛋白质合成。我们的方案提供了一种可靠且一致的方法，用于分离神经元区室并检测低丰度环境下的 mRNA。未来的分析将聚焦于分离和表征不同的轴突亚区，例如生长锥以及轴突主干，而不仅仅局限于整体分析。

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利用多孔膜插入物和RTddPCR分离和定量轴突mRNA

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使用多孔膜插入物和RTddPCR分离与定量轴突mRNA

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