使用定量实时PCR检测大鼠腹膜中的微小RNA表达
2017年6月27日
在这里，我们提出了使用定量实时逆转录聚合酶链反应检测大鼠腹膜中microRNA表达的方案。该方法适用于在几种病理条件下研究大鼠腹膜中的microRNA表达谱。
该程序的总体目标是成功纯化和检测大鼠腹膜中的 miRNA。要开始此程序，请在用 4% 异氟醚吸入麻醉后。用 70% 乙醇喷洒大鼠的腹部皮肤，并将其安装在软木板上，在其背部。
接下来，使用剪刀和镊子在动物的腹部皮肤、肌肉和腹膜上做一个纵向切口。用镊子夹起腹膜，沿着横膈膜下的最低肋骨在其上部做水平切口。并在其下侧使用手术剪刀在外侧区域。
接下来，使用手术剪刀做横向纵向切口，从体内去除腹膜。然后在培养皿中用 PPS 洗涤。切下并修剪 20 毫克腹膜样本。
在此过程中，将 20 毫克腹膜样品放入玻璃匀浆器中。并加入 700 μL 苯酚胍基裂解试剂。之后，通过扭转将研杵缓慢压在样品上，将腹膜样品在冰上匀浆。
重复此过程数十次，直到腹膜样品完全溶解到基于苯酚胍的裂解试剂中。为了进一步均质化，将均质化的裂解物转移到 2 毫升收集管中微量离心离心柱中的生物聚合物切碎系统中。然后在 4 摄氏度下以 14， 000 倍 G 离心 3 分钟。
接下来，将匀浆裂解物转移到新的微量离心管中。向匀浆裂解物中加入 140 μL 氯仿，并盖紧试管。随后，倒置混合试管 15 秒。
然后，在室温下孵育样品 2 到 3 分钟。之后，在 4 摄氏度下以 12， 000 倍 G 离心 15 分钟。将 300 μL 上清液转移到新的微量离心管中，不要干扰沉淀剂。
并加入 450 微升 100% 乙醇。然后涡旋混合样品 5 秒钟。接下来，将多达 700 微升样品移液到基于硅膜的离心柱中，置于 2 毫升收集管中，然后盖上盖子。
然后以 15， 000 倍 G 离心 15 秒。离心后，丢弃收集管中的流出物。然后将 700 微升洗涤缓冲液 1 添加到基于硅膜的离心柱中，以严格洗涤样品并盖上盖子。
以15， 000 倍 G 离心 15 秒。离心后，丢弃收集管中的流出物。向基于硅胶膜的离心柱中加入 500 μL 洗涤缓冲液 2，以去除任何痕量盐，然后盖上盖子。
然后以 15， 000 倍 G 离心 15 秒。离心后，丢弃流过液和收集管，然后再次重复此过程。接下来，将基于硅胶膜的离心柱再次以 15， 000 倍 G 离心 1 分钟。
离心后，丢弃收集管和任何流过的液体。将基于硅胶膜的离心柱放入新的单点 5 mL 收集管中。然后将 25 μL 不含 RNase 的水转移到色谱柱上并盖上盖子。
将样品在室温下放置 5 分钟。以 15， 000 倍 G 离心 1 分钟。之后，将含有总 RNA 的 25 μL alouette 转移到新的微量离心管中，并在使用前将其储存在零下 80 摄氏度。
在此过程中，制备一种预混液，其中包含 2 微升 10x 核酸混合物、2 微升逆转录酶混合物和 4 微升 5x Hispec 缓冲液，每管总共 8 μL。然后将 8 μL 预混液分配到每个试管中。使用分光光度计测量总 RNA 的数量。
然后，向每个试管中加入 1 微克从腹膜样品中纯化的分离总 RNA。之后，向每根试管中加入不含 RNase 的水，使其总量达到 20 微升。然后通过移液充分混合并离心 15 秒。
然后，将样品在 60 摄氏度下孵育 37 分钟。然后在 95 摄氏度下孵育 5 分钟。将新生成的 cDNA 转移到新的微量离心管中，并用不含 RNase 的水稀释 10 倍。
在本程序中，为每个孔制备含有 12 点 5 微升 2x PCR 预混液、2 点 5 微升 5 微摩尔溶于无核酸酶水的每种 miRNA 引物，以及 1 点 2 5 微升 10x 通用引物。将 22 点 5 微升这种预混液分配到 96 孔板的每个孔中。然后向每个孔中加入 2 点 5 微升模板 cDNA。
用一张薄膜密封 96 孔反应板。然后以 1， 000 倍 G 离心 30 秒。要运行 PCR 循环程序，请在实时 PCR 仪器中设置板。
在实时荧光定量 PCR 软件中，定义实验特性。接下来，为每个孔中的样品和目标 miRNA 分配名称。然后在实时 PCR 软件中，根据说明输入 20 μL 的反应体积和以下 PCR 循环条件。
在 95 摄氏度下预孵育 15 分钟。然后在 94 摄氏度下进行 40 次变性 15 秒，然后在 55 摄氏度下跪下 30 秒，然后在 70 摄氏度下延长 30 秒。基于 miRNA，微阵列筛选，发现与模拟大鼠和对照大鼠相比，腹膜纤维化大鼠腹膜中 6 个 miRNA 的水平显着增加，使用 QRTCPR，遵循本手稿中提出的方案。
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概述
本协议概述了使用定量实时逆转录聚合酶链反应检测大鼠腹膜膜中microRNA表达的方法。它旨在研究各种病理条件下microRNA表达谱。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- microRNA研究
背景
- microRNA在基因调控中起着关键作用。
- 了解它们在病理条件下的表达至关重要。
- 大鼠腹膜膜作为研究这些表达的模型。
- 定量实时PCR是一种可靠的检测方法。
研究目的
- 纯化并检测大鼠腹膜膜中的miRNA。
- 分析各种条件下microRNA表达谱。
- 为该领域的研究人员提供详细的协议。
使用的方法
- 使用4%异氟烷进行吸入麻醉。
- 用70%乙醇准备腹部区域。
- 通过外科切口接触腹膜。
- 使用剪刀和钳子提取膜。
主要结果
- 成功从腹膜中纯化miRNA。
- 实现了microRNA表达的定量检测。
- 协议已验证可用于各种病理研究。
- 潜在应用于理解疾病机制。
结论
- 该协议对研究大鼠模型中的microRNA是有效的。
- 它提供了microRNA在病理学中作用的洞见。
- 未来的研究可以在此方法基础上进行更广泛的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative real-time PCR-based detection of microRNA expression in rat peritoneal membrane enables precise interrogation of gene regulation in disease-relevant tissue models. This workflow supports early discovery teams seeking to validate mechanistic hypotheses and identify translational biomarkers in fibrotic and inflammatory pathologies. Reliable miRNA quantification in preclinical models enhances predictive confidence and informs risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional assessment of miRNA-mediated regulatory pathways in disease models.
- Supports biological de-risking by quantifying miRNA changes in response to pathological stimuli.
- Facilitates target validation through quantitative comparison of miRNA expression between control and disease states.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized protocol for miRNA extraction and quantification from tissue samples.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for downstream screening and assay development.
- Establishes assay readiness for evaluating compound effects on miRNA expression profiles.
Translational & Preclinical Research
- Aligns miRNA expression data with disease-relevant preclinical models for translational biomarker discovery.
- Enables continuity from early discovery through preclinical validation by supporting mechanistic studies in vivo.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on quantitative molecular readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical biomarker validation, supporting both hypothesis testing and translational research.
- Discovery Biology: Quantitative miRNA profiling clarifies regulatory pathways and supports hypothesis-driven research.
- Screening: Standardized qRT-PCR outputs enable reproducible comparison across experimental conditions.
- Analytics: Provides robust quantitative measurements for statistical analysis of miRNA expression changes.
- Translational Research: Connects molecular findings in animal models to potential clinical biomarkers.
- Enterprise Reuse: Protocol can be adapted for diverse tissue types and disease models, supporting broad R&D needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable miRNA quantification workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and translational biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, RNA handling, and qRT-PCR analysis.
- Needs access to real-time PCR instrumentation and validated reagents.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data analysis.
- Adaptation may be necessary for different tissue types or disease models.
- Sample quality and RNA integrity are critical for reliable quantification.
