使用定量实时PCR检测大鼠腹膜中的微小RNA表达

该程序的总体目标是成功纯化和检测大鼠腹膜中的 miRNA。要开始此程序，请在用 4% 异氟醚吸入麻醉后。用 70% 乙醇喷洒大鼠的腹部皮肤，并将其安装在软木板上，在其背部。

接下来，使用剪刀和镊子在动物的腹部皮肤、肌肉和腹膜上做一个纵向切口。用镊子夹起腹膜，沿着横膈膜下的最低肋骨在其上部做水平切口。并在其下侧使用手术剪刀在外侧区域。

接下来，使用手术剪刀做横向纵向切口，从体内去除腹膜。然后在培养皿中用 PPS 洗涤。切下并修剪 20 毫克腹膜样本。

在此过程中，将 20 毫克腹膜样品放入玻璃匀浆器中。并加入 700 μL 苯酚胍基裂解试剂。之后，通过扭转将研杵缓慢压在样品上，将腹膜样品在冰上匀浆。

重复此过程数十次，直到腹膜样品完全溶解到基于苯酚胍的裂解试剂中。为了进一步均质化，将均质化的裂解物转移到 2 毫升收集管中微量离心离心柱中的生物聚合物切碎系统中。然后在 4 摄氏度下以 14， 000 倍 G 离心 3 分钟。

接下来，将匀浆裂解物转移到新的微量离心管中。向匀浆裂解物中加入 140 μL 氯仿，并盖紧试管。随后，倒置混合试管 15 秒。

然后，在室温下孵育样品 2 到 3 分钟。之后，在 4 摄氏度下以 12， 000 倍 G 离心 15 分钟。将 300 μL 上清液转移到新的微量离心管中，不要干扰沉淀剂。

并加入 450 微升 100% 乙醇。然后涡旋混合样品 5 秒钟。接下来，将多达 700 微升样品移液到基于硅膜的离心柱中，置于 2 毫升收集管中，然后盖上盖子。

然后以 15， 000 倍 G 离心 15 秒。离心后，丢弃收集管中的流出物。然后将 700 微升洗涤缓冲液 1 添加到基于硅膜的离心柱中，以严格洗涤样品并盖上盖子。

15， 000 倍 G 离心 15 秒。离心后，丢弃收集管中的流出物。向基于硅胶膜的离心柱中加入 500 μL 洗涤缓冲液 2，以去除任何痕量盐，然后盖上盖子。

然后以 15， 000 倍 G 离心 15 秒。离心后，丢弃流过液和收集管，然后再次重复此过程。接下来，将基于硅胶膜的离心柱再次以 15， 000 倍 G 离心 1 分钟。

离心后，丢弃收集管和任何流过的液体。将基于硅胶膜的离心柱放入新的单点 5 mL 收集管中。然后将 25 μL 不含 RNase 的水转移到色谱柱上并盖上盖子。

将样品在室温下放置 5 分钟。以 15， 000 倍 G 离心 1 分钟。之后，将含有总 RNA 的 25 μL alouette 转移到新的微量离心管中，并在使用前将其储存在零下 80 摄氏度。

在此过程中，制备一种预混液，其中包含 2 微升 10x 核酸混合物、2 微升逆转录酶混合物和 4 微升 5x Hispec 缓冲液，每管总共 8 μL。然后将 8 μL 预混液分配到每个试管中。使用分光光度计测量总 RNA 的数量。

然后，向每个试管中加入 1 微克从腹膜样品中纯化的分离总 RNA。之后，向每根试管中加入不含 RNase 的水，使其总量达到 20 微升。然后通过移液充分混合并离心 15 秒。

然后，将样品在 60 摄氏度下孵育 37 分钟。然后在 95 摄氏度下孵育 5 分钟。将新生成的 cDNA 转移到新的微量离心管中，并用不含 RNase 的水稀释 10 倍。

在本程序中，为每个孔制备含有 12 点 5 微升 2x PCR 预混液、2 点 5 微升 5 微摩尔溶于无核酸酶水的每种 miRNA 引物，以及 1 点 2 5 微升 10x 通用引物。将 22 点 5 微升这种预混液分配到 96 孔板的每个孔中。然后向每个孔中加入 2 点 5 微升模板 cDNA。

用一张薄膜密封 96 孔反应板。然后以 1， 000 倍 G 离心 30 秒。要运行 PCR 循环程序，请在实时 PCR 仪器中设置板。

在实时荧光定量 PCR 软件中，定义实验特性。接下来，为每个孔中的样品和目标 miRNA 分配名称。然后在实时 PCR 软件中，根据说明输入 20 μL 的反应体积和以下 PCR 循环条件。

在 95 摄氏度下预孵育 15 分钟。然后在 94 摄氏度下进行 40 次变性 15 秒，然后在 55 摄氏度下跪下 30 秒，然后在 70 摄氏度下延长 30 秒。基于 miRNA，微阵列筛选，发现与模拟大鼠和对照大鼠相比，腹膜纤维化大鼠腹膜中 6 个 miRNA 的水平显着增加，使用 QRTCPR，遵循本手稿中提出的方案。