Primäre Kultur der erwachsenen Ratte Herz Myozyten

Teil I. Vorbereitung für die Chirurgie

1. Am Tag vor der Ratte Chirurgie, stellen Sie sicher, dass alle Lösungen hergestellt werden, aber fügen Sie keine Enzyme noch. Puffer A, B und der Waschpuffer sollten alle für die Sterilität gefiltert werden, bevor Lagerung. Die Puffer sollten alle bei 4 ° C gelagert werden
2. 6-well-Zellkulturplatten muss mit 10-20 pg / mL Laminin in 2 mL 1XSFM am Vortag sowie beschichtet werden, und sollte bei 37 ° C in einem CO _2-Inkubator gelagert werden.
3. Am Tag der Operation, bereiten die chirurgischen Instrumente durch Sterilisieren der Klemme, Schere, Pinzette und mit 70% Ethanol und lassen Sie sie auf Küchenpapier trocknen.
4. Einer 1 ml Spritze mit 0,5 ml Heparin-Lösung (90 U / ml) gefüllt ist fertig.
5. Nun ist es gute Praxis, die Perfusionsapparatur, indem Sie durch 70% Ethanol, mit der Schlauchpumpe in umgekehrter waschen. Sobald Sie fertig sind Spülen mit Ethanol, spülen Sie die Geräte mit doppelt destilliertem Wasser und schließlich mit Puffer A. spülen Der Durchfluss wird in einem Becherglas in einem 37 ° C Wasserbad gestellt gesammelt.
6. Zur Vorbereitung der Reinigung Perfusionsapparatur, füllen Sie die richtige Spritze Rohr mit 40 ml Puffer A und die linke Spritze Rohr mit 40 ml Puffer B
7. Prime der Infusionsschlauch an der Spitze des Katheters, indem Buffer A durch die Vorrichtung fließen. Refill, um den Puffer Eine Spritze, die 40 mL Ebene. Stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblasen in den Schlauch nach diesem Schritt gefangen.
8. Jetzt, in der Nähe des Puffers A Spritze Absperrhahnventil und wiederholen Sie den Vorgang mit Puffer B, so dass die Infusionsschlauch ist jetzt mit Puffer B grundiert
9. Schließlich ist die Perfusionsapparatur mit dem Buffer B Absperrhahn offen gelassen, aber mit der Strömung gestoppt mit dem Regler auf der IV-Leitung.
10. Entsorgen Sie die Puffer fließen, wenn auch in der Sammlung Becher.
11. Das letzte, was vor der Operation besteht darin, die benötigten Enzyme zu Ihrem Stammlösung hinzufügen und dann filtern Sie die Enzymlösung ebenso wie die anderen Lösungen wurden filtriert am Vortag. Sobald gefiltert, kann diese Lösung bei Raumtemperatur stehen gelassen werden.

Part II. Der Rat Herzen Dissektion

1. Nach Standardprotokoll euthanize der Ratte mit Isofluran in einer Gaskammer.
2. Sterilisieren der Schnitt-Bereich auf den Brustkorb mit 70% Ethanol.
3. Öffnen Brust mit einer Schere und setzen Herzen.
4. Inject linken Ventrikel mit 0,5 mL Heparin-Lösung (90 U / mL).
5. Nehmen Sie Herz mit großer Teil der Aorta intakt, in eiskaltem Puffer B

Teil III. Myozyten Isolation

1. Eine typische Ratte Herz sollte einen hohen Anteil an stäbchenförmigen Myozyten (im Gegensatz zu toten Zellen abgerundet Gegensatz), wenn die folgende Prozedur ist korrekt eingehalten werden.
2. Um zu beginnen, Klemme Aorta, um den Katheter. Die Spitze des Katheters sollte nicht zu weit in das Herz geschoben werden, um gute Durchblutung des Herzens durch die Herzkranzgefäße zu gewährleisten.
3. Einmal eingespannt, binden die Aorta, den Katheter mit einer Naht.
4. Dann öffnen Sie den IV-Leitung Regler, um eine schnelle Tropfgeschwindigkeit (~ 60 Tropfen / min) ermöglichen und damit Buffer B zum Auswaschen des Herzens.
5. Während Buffer B waschen, verwenden Sie die kleine Schere und Pinzette, um den Vorhöfen und keine Fett-oder Lungengewebe Festhalten an dem Herzen zu entfernen.
6. Nach Buffer B beendet ist, schalten Sie den Fluss, um Buffer A.
7. Während Buffer A darf für 5 Minuten fließen, sollten mehrere kleine Aufgaben schnell durchgeführt werden.
8. First, warm die Enzymlösung in einem 37 ° C Wasserbad.
9. Schließlich, als Puffer A von der Spritze (aber immer noch im Schlauch) aufgebraucht ist, laden Sie 50 mL der Enzymlösung in Spritze A der Perfusionsapparatur
10. Es ist nun notwendig, alle Flow-Through aus der Sammlung Becherglas im Wasserbad (mit einer Pipette) zu verwerfen, bis die Enzymlösung perfundiert Herzen.
11. Sobald der Enzymlösung Herzen durchblutet, aktivieren Sie die Schlauchpumpe, die bis zum Enzymlösung aus dem Sammelbehälter Becher Transfer Spritze A. aufzufüllen eingestellt
12. Lassen Sie die Enzymlösung durch das Herz für 10 min fließen. Als Herzstück verdaut, beginnt es zu sehen aufgedunsen.
13. Add 37,5 &mgr; l 0,1 M CaCl ₂ der Enzymlösung in Spritze A, um eine wirksame Konzentration von 0,1 mM Ca ^{2 +} geben.
14. Nach 10 Minuten erhöhen die Konzentration von Calcium bis 0,2 mM, indem eine zusätzliche 50 &mgr; l 0,1 M CaCl ₂ bis Spritze A und lassen Sie die Perfusion für weitere 10 Minuten gehen.
15. Schneiden Sie die Herzkammern und den Transfer zu einem kleinen sterilen Becherglas mit 20 mL Enzymlösung.
16. In das Becherglas Erhöhung der Calcium-Konzentration auf 0,4 mM durch Zugabe von 40 mehr &mgr; l 0,1 M CaCl _2.
17. Gently mince das Herz in 10 oder mehr Stücke mit ein Paar kleinen sterilen Schere.
18. Inkubieren Sie die Becher für 5 Minuten bei 37 ° C unter leichtem Schütteln.
19. 40 ml von 0,1 M CaCl ₂ zugeben wirksame Konzentration von 0,6 mM Ca ^{2 +} und sanft verreiben Herzen Stücke mit einer Kunststoff-Transfer-Pipette 3-5 mal.
20. Nach Inkubation für weitere 5 Minuten bei 37 ° C, 40 ml von 0,1 M CaCl ₂ und sanft wie zuvor verreiben.
21. Separate verdaut einzelnen Myozyten aus nicht verdaut Bindegewebe mit Filtration durch einen sterilen 500 um Maschenweite.
22. Lassen Sie die Zellen in einer 50 ml Tube für 10 Minuten bei Raumtemperatur zu regeln.
23. Überstand mit einer Pipette übertragen.
24. Vorsichtig die Zellen in Waschpuffer # 1 und damit die Zellen für 10-20 min bei Raumtemperatur zu regeln.
25. Während die Zellen Abrechnung sind, nehmen Sie eine kleine Teilmenge, und diese Zeit nutzen, als Chance, die Qualität und die Lebensfähigkeit der Zellen in Suspension unter einem inversen Mikroskop zu beurteilen. Eine gute Vorbereitung haben einen hohen Anteil (> 80%) der Stange, wie Zellen mit knusprigen Streifen.
26. Sobald die Zellen angesiedelt haben, den Überstand verwerfen und sanft die Zellen in Waschpuffer # 2. Lassen Sie die Zellen bei Raumtemperatur zu regeln, sollte die wiederum zu 10-20 Minuten, und den Überstand verwerfen.
27. Wiederholen Sie den Waschvorgang noch einmal mit Waschpuffer # 3, und die Zellen werden bereit sein für die Kultur.

Teil IV. Myozyten Zellkultur

1. Vorsichtig die Zellen in 5% Serum Media. Vor der Übertragung der Zellen auf Zellkulturplatten, waschen Sie die Platten mit 1x SFM. Übertragen Sie die Zellen in eine gewünschte Dichte und inkubieren in einer CO _{2-Gewebekultur-Inkubator} für 3-5 Stunden.
2. Schalten Sie die Medien auf 1x SFM.
3. Die Zellen können kultiviert werden für bis zu vier Tage und wird als für Experimente benötigt.

Teil V. repräsentative Ergebnisse / Outcome

Es sollten mehr als 70% leben Herzen Myozyten unter inversen Mikroskop, wenn das Protokoll korrekt durchgeführt werden.

Tabelle 1: Lösung Rezept für 1 L 10x Ca ^{2 +-freien} KH Buffer:

Tabelle 2: Lösung Rezept für 1 L Puffer A:

Add 1,98 g Glucose in 100 ml 10x KH Buffer und bringen bis zu einem Endvolumen von 1 L. Adjust Osmolarität in der Nähe Physiologie Bedingung (~ 300) mit Glucose. Bringen Sie auf pH 7,4 mit NaOH.

Tabelle 3: Lösung Rezept für Enzyme Buffers

Tabelle 4: Lösung Rezept für 25X BDM / Taurin / BSA (B / T / B)

Tabelle 5: Lösung Rezept für Buffer B und Waschpuffer

Tabelle 6: Lösung Rezept für Kulturmedien

A critical step is the speed with which the isolated heart is hung up on the perfusion system. The length of the enzymatic digestion period may be a little different for each rat. The adjustment depends on how soft the heart becomes after the regular period of digestion. The slowly recovery of Ca²⁺ after enzyme digestion is essential for obtaining Ca²⁺-tolerant healthy cells.

For guinea pig, the protocol is the same except hyaluronidase is used instead of Protease XIV. Typically, we find the that initial percentage of living cells is lower for guinea pig compared to rat, although they survive just as long in culture.