Overview
本视频提供了在 3D 基膜蛋白质基质中生长乳腺癌细胞的详细方法，体现了 3D 培养在评估细胞入侵到周围环境中的潜力。
Protocol
1. 地下室膜矩阵中乳腺癌细胞的三维培养（嵌入技术）
- 处理甲基基膜矩阵：在4°C的冰上过夜解冻。 地下室膜基质在低温下是液体，但在室温下凝固。将地下室膜基质保留在冰上（图1A-B）。
- 使用 P-200 Pipetman 尖端在螺旋模式（图 1C）中展开矩阵，用 50 μl 的地下室膜矩阵覆盖 1 号玻璃底盘。在铺开地下室膜基质时要小心，避免形成气泡。同样，避免将基质扩散到靠近玻璃底盘的边界，以防止半月板形成。如果缺乏处理地下室膜基质的经验，然后预冷的菜，P-200 Pipetman和移液器可以在冰上（或者留在冰箱过夜在4°C）。此步骤提供了额外的时间来在凝固之前展开地下室膜基质。将菜放在细胞培养孵化器中（37 °C，二氧化碳为5%）至少30分钟，使地下室膜基质凝固（图1D）。
- 当基质进行凝固时，尝试将 70-80% 的汇流 100 mm 板细胞进行脱脂。一旦细胞开始从盘子中取出，在含有10%（v/v）胎儿牛血清（FBS）的RPMI 1640介质中再吸收它们，以激活肌氨酸（图1E）。然后将再悬复的细胞转移到15毫升圆锥管（图1F）中。
- 在专用细胞培养离心机（图1G-H）中以100 x g旋转细胞（目前在圆锥管中）3分钟。
- 当细胞被剥离下来时，将50μl的基质加入一个1毫升的微中轴管（注意：每个玻璃底盘被分配一个微中轴管;因此，如果实验需要3个菜，那么它遵循3微中轴管也是必要的），然后把管子放在冰上（图1B）。
- 从步骤1.4中吸气从圆锥管的介质，同时保持颗粒不受干扰（图1I）。在 1 毫升 FBS 补充的 RPMI 介质 （图 1J）中恢复细胞（已剥离）。
- 一旦细胞使用血细胞仪（图1K）或细胞粒子计数器将2.5 x 104细胞倒入微中流管中，并使用适当的介质将其顶部关闭，从而获得总体积为50μl（图1L）。
- 将步骤 1.7 （50 μl 中的 25，000 个细胞） 中的细胞与包含矩阵的微中轴管（从步骤 1.5 中以 1：1 的比例混合）：最终音量为100μl（图1M）。
- 矩阵的轻轻板 100 μl：细胞混合物从步骤 1.8 到凝固的地下室膜矩阵涂层盘从步骤 1.2 （图 1N）.这允许细胞嵌入在地下室膜基质中。
- 将菜（es）转移到细胞培养孵化器（在37°C与5%的二氧化碳），并允许矩阵：细胞混合物凝固至少30分钟。
- 矩阵：细胞混合物凝固后，将2毫升的BBS补充RPMI介质加入菜（图1O），并将菜带回孵化器，储存在实验的剩余部分（图1P）。
- 每天更换介质5天（或根据检测要求;MDA-MB-231细胞的检测持续时间为5天）。
- 使用光显微镜，拍摄悬挂在地下室膜基质（图2A）中的MDA-MB-231殖民地的微分干扰对比度（DIC）图像。图像 20 代表区域在 10 倍目标每天一次，为期五天，以确定殖民地形态形成 （图 2C）。
- 盲目分析图像以确定细胞群落恒星形成（图2B）。如果从细胞球体中感知到一个或多个投影，则认为殖民地是恒星状的。要确定侵入性恒星群落的百分比，将恒星群落的数量除以每个获得图像的细胞群落总数，然后平均每天 20 张图像中的恒星群落百分比。
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Representative Results
图1。地下膜基质（嵌入技术）中MDA-MB-231乳腺癌细胞的三维培养。 A-B） 实验设置的示意图（在烟罩中执行）。C） 涂有 50μl 地下室膜基质的玻璃底盘井。D） 将 Dish （es） 放置在细胞培养孵化器中 （在 37 °C 与 5% CO2） 中， 允许基质凝固至少 30 分钟 E. 细胞被尝试穿刺。F） 细胞被重新插入15毫升的圆锥管。G-H） 细胞（存在于圆锥管中）在组织培养离心机中以 100 x g 的速度旋转 3 分钟。I） 细胞颗粒。J） 细胞（已剥离）在 1 毫升 FBS 补充的 RPMI 介质中恢复。K） 细胞使用血细胞计进行计数。L） 2.5 x 104 个细胞被引用到微中心管中，并使用适当的介质加满，从而获得总容量为 50 μl。M） 将步骤 1.7 （50μl 中的 25，000 个细胞） 中的细胞与包含矩阵的微中轴管以 1：1 的比例从步骤 1.5 混合：最终卷将是100μl。N） 矩阵的轻轻板 100 μl：从步骤 8 到凝固矩阵涂层盘从步骤 1.2 的细胞混合物。O） 矩阵：细胞混合物凝固后，在菜中加入 2 毫升 FBS 补充的 RPMI 介质。P） 将菜放在孵化器中，存放在实验的剩余部分。
图2。图像采集和代表性图像的插图。A） 用显微镜拍摄的图像。B） 用于获取图像的微分干扰对比 （DIC） 成像显微镜，随后使用图像分析软件进行分析的图像。C） 显示 MDA-MB-231 细胞的样本代表 DIC 图像（连续五天每天拍摄一次）。单向 ANOVA 紧随其后的是邓内特的多重比较测试：*，P&0.05。 比例杆，100微米。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
| 1.5 ml tubes | VWR | CA10011-700 | CA10011-700 |
| 100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
| 15 ml Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
| 1 ml filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
| 200 μl filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
| 20 μl filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
| RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
| MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X) |
