Overview
يقدم هذا الفيديو منهجية مفصلة لزراعة خلايا سرطان الثدي في مصفوفة بروتين غشاء الطابق السفلي ثلاثي الأبعاد ، مما يجسد إمكانات الثقافة ثلاثية الأبعاد في تقييم غزو الخلايا في البيئة المحيطة.
Protocol
1. ثقافة ثلاثية الأبعاد من خلايا سرطان الثدي في مصفوفة غشاء الطابق السفلي (تقنية التضمين)
- التعامل مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي Matrigel: ذوبان الجليد بين عشية وضحاها في 4 °C. مصفوفة غشاء الطابق السفلي سائلة في درجة حرارة منخفضة ولكنها تتماسك في درجة حرارة الغرفة. الحفاظ على مصفوفة غشاء الطابق السفلي على الجليد (الأرقام 1A-B).
- تغطية كونفوجكال No.1 طبق الزجاج القاع مع 50 ميكرولتر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي عن طريق نشر المصفوفة باستخدام غيض من P-200 Pipetman في نمط حلزوني (الشكل 1C). توخي الحذر عند نشر مصفوفة غشاء الطابق السفلي لتجنب تشكيل فقاعات الهواء. وبالمثل، تجنب انتشار المصفوفة لإغلاق حدود طبق الزجاج القاع لمنع تشكيل الغضروف المفصلي. إذا كان عديم الخبرة التعامل مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي، ثم تبريد الطبق، P-200 Pipetman وماصة يمكن أن يكون على الجليد (بدلا من ذلك تركت بين عشية وضحاها في الثلاجة في 4 درجة مئوية). توفر هذه الخطوة وقتا إضافيا لنشر مصفوفة غشاء الطابق السفلي قبل التجسيد. ضع الطبق (es) في حاضنة زراعة الخلايا (عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2) لمدة 30 دقيقة على الأقل لتمكين مصفوفة غشاء الطابق السفلي من ترسيخ(الشكل 1D).
- في حين أن المصفوفة تمر التصلب، جرب لوحة التقاء 70-80٪ 100 ملم من الخلايا. مرة واحدة وقد بدأت الخلايا رفع قبالة لوحة, resuspend لهم في 10 مل من RPMI 1640 المتوسطة التي تحتوي على 10٪ (v/v) مصل البقر الجنيني (FBS), لتثبيط تريبسين (الشكل 1E). ثم نقل الخلايا resuspended في أنبوب مخروطي 15 مل (الشكل 1F).
- تدور الخلايا (موجودة في أنبوب مخروطي) في 100 × ز لمدة 3 دقائق في جهاز الطرد المركزي ثقافة الخلية مخصصة(الأرقام 1G-H).
- في حين يجري نسج الخلايا إلى أسفل، aliquot 50 ميكروغرام من مصفوفة في أنبوب 1 مل microcentrifuge (ملاحظة: يتم تخصيص كل طبق الزجاج القاع أنبوب واحد microcentrifuge؛ وبالتالي، إذا كانت التجربة تتطلب 3 أطباق، ثم يترتب على ذلك أن 3 أنابيب الطرد المركزي الدقيق ضرورية كذلك)، ومن ثم وضع أنبوب على الجليد(الشكل 1B).
- يستنشق المتوسط من الأنبوب المخروطي من الخطوة 1.4 ، مع ترك بيليه دون عائق(الشكل 1I). Resuspend الخلايا (التي تم نسج أسفل) في 1 مل من FBS تستكمل RPMI المتوسطة (الشكل 1J).
- مرة واحدة يتم حساب الخلايا باستخدام مقياس الدم (الشكل 1K)، أو مضاد الجسيمات الخلية aliquot 2.5 × 104 خلايا في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وأعلى تشغيله باستخدام وسائل الإعلام المناسبة وذلك للحصول على الحجم الإجمالي من 50 ميكرولتر (الشكل 1L).
- مزج الخلايا من الخطوة 1.7 (25000 خلية في 50 ميكرولتر) مع أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على مصفوفة من الخطوة 1.5 في نسبة 1:1؛ وسيكون الحجم النهائي 100 ميكرولتر(الشكل 1M).
- لوحة بلطف 100 ميكرولتر من المصفوفة: خليط الخلية من الخطوة 1.8 على طبق غشاء الطابق السفلي الصلبة المغلفة مصفوفة من الخطوة 1.2(الشكل 1N). وهذا يسمح للخلايا أن تكون جزءا لا يتجزأ من مصفوفة غشاء الطابق السفلي.
- نقل الطبق (es) إلى حاضنة ثقافة الخلية (في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2) والسماح للخليط مصفوفة: الخلية لترسيخ لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- مرة واحدة في مصفوفة: يتم ترسيخ خليط الخلية، إضافة 2 مل من الوسائط RPMI FBS المكملة للطبق(الشكل 1O)وتأخذ الطبق مرة أخرى الحاضنة حيث سيتم تخزينها لبقية التجربة (الشكل 1P).
- تغيير الوسائط كل يوم لمدة 5 أيام (أو حسب الحاجة لإجراء الفحص؛ مدة الفحص لخلايا MDA-MB-231 هي 5 أيام في الطول).
- باستخدام المجهر الخفيف ، واتخاذ تباين التداخل التفاضلي (DIC) صور المستعمرات MDA - MB - 231 علقت في مصفوفة غشاء الطابق السفلي(الشكل 2A). صورة 20 مناطق تمثيلية في الهدف 10X مرة واحدة في اليوم لمدة خمسة أيام لتحديد مورفوجينيسيس مستعمرة (الشكل 2C).
- تحليل الصور بشكل أعمى لتحديد تشكيل خلية مستعمرة ستيلاتي (الشكل 2B). تعتبر المستعمرة ستيلاتية إذا تم إدراك إسقاط واحد أو أكثر من كروية الخلايا. لتحديد النسبة المئوية للمستعمرات النجمية الغازية، قسم عدد المستعمرات النجمية على العدد الإجمالي لمستعمرات الخلايا لكل صورة مكتسبة، ثم قم بتوغل النسب المئوية للمستعمرات النجمية من الصور العشرين لكل يوم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام التي يمكن أن ثقافة ثلاثية الأبعاد من خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 في مصفوفة غشاء الطابق السفلي (تقنية التضمين). A-B) تخطيطي للإعداد التجريبي (يتم تنفيذه في غطاء الدخان). ج) بئر الطبق ذو القاع الزجاجي المغلف ب 50 ميكرولتر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي. د) طبق (es) وضعت في حاضنة ثقافة الخلية (في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2) للسماح للمصفوفة لترسيخ لمدة 30 دقيقة على الأقل. E) تم تجريب الخلايا. F) تم إعادة إنفاق الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل. تم نسج الخلايا G-H (الموجودة في أنبوب مخروطي) إلى أسفل في 100 × ز لمدة 3 دقائق في جهاز الطرد المركزي ثقافة الأنسجة. I) بيليه الخلية. J) تم إعادة إنفاق الخلايا (التي تم نسج أسفل) في 1 مل من المتوسطة RPMI المكملة FBS. K) تم عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. L) 2.5 × 104 الخلايا aliquoted في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وتصدرت قبالة باستخدام وسائل الإعلام المناسبة وذلك للحصول على الحجم الإجمالي من 50 ميكرولتر. م) مزج الخلايا من الخطوة 1.7 (25000 خلية في 50 ميكرولتر) مع أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على مصفوفة من الخطوة 1.5 في نسبة 1:1؛ سيكون الحجم النهائي 100 ميكرولتر. N) لوحة بلطف 100 ميكرولتر من المصفوفة: خليط الخلية من الخطوة 8 على طبق صلب المغلفة مصفوفة من الخطوة 1.2. O) مرة واحدة في مصفوفة: يتم ترسيخ خليط الخلية، إضافة 2 مل من وسائل الإعلام RPMI FBS المكملة إلى الطبق. P) ضع الطبق في الحاضنة حيث سيتم تخزينه لبقية التجربة.
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم ال الحصول على الصور وتوضيح الصور التمثيلية. أ) الصور التي التقطت بالمجهر. ب) تباين التداخل التفاضلي (DIC) مجهر التصوير المستخدمة للحصول على الصور والصور التي تم تحليلها في وقت لاحق باستخدام برامج تحليل الصور. ج) يتم عرض عينة من الصور التمثيلية DIC لخلايا MDA-MB-231 (التي يتم التقاطها مرة واحدة في اليوم لمدة خمسة أيام). في اتجاه واحد ANOVA تليها دونيت اختبار المقارنة المتعددة : * ، ف و 0.05. شريط المقياس، 100 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
| 1.5 ml tubes | VWR | CA10011-700 | CA10011-700 |
| 100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
| 15 ml Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
| 1 ml filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
| 200 μl filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
| 20 μl filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
| RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
| MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X) |
