Analyse de membrane de sous-sol de culture 3D : Culturing Cellules cancéreuses sur la matrice de protéine de membrane de sous-sol 3D pour étudier l’invasion cellulaire

Overview

Cette vidéo fournit une méthodologie détaillée pour cultiver les cellules cancéreuses du sein dans une matrice de protéines membranaires 3D sous-sol, ilplifiant le potentiel de la culture 3D dans l’évaluation de l’invasion cellulaire dans l’environnement environnant.

Protocol

1. Culture tridimensionnelle des cellules cancéreuses du sein dans la matrice membranaire du sous-sol (La technique d’intégration)

1. Manipulation de la matrice membranaire du sous-sol Matrigel : Décongeler sur la glace pendant la nuit à 4 °C. La matrice membranaire du sous-sol est liquide à basse température, mais se solidifie à température ambiante. Gardez la matrice membranaire dusous-sol sur la glace ( Figures 1A-B).
2. Couvrez le plat confocal no 1 à fond de verre de 50 μl de matrice membranaire du sous-sol au moyen de l’épandage de la matrice à l’aide de la pointe d’un Pipetman P-200 en spirale (figure 1C). Faire preuve de prudence lors de l’épandage de la matrice membranaire du sous-sol pour éviter la formation de bulles d’air. De même, évitez de répandre la matrice à proximité des bordures du plat à fond de verre pour empêcher la formation de ménisque. Si la matrice de membrane de sous-sol de manipulation inexpérimentée, puis précooled le plat, P-200 Pipetman et pipettes peuvent être sur la glace (alternativement laissé pendant la nuit dans un réfrigérateur à 4 °C). Cette étape offre plus de temps pour étendre la matrice membranaire du sous-sol avant la solidification. Placer le plat (es) dans un incubateur de culture cellulaire (à 37 °C avec 5 % de CO2) pendant au moins 30 min pour permettre à la matrice membranaire du sous-sol de se solidifier (figure 1D).
3. Pendant que la matrice subit une solidification, essayez de trypsiniser une plaque de cellules de 70 à 80 % confluente de 100 mm. Une fois que les cellules ont commencé à décoller de la plaque, les resuspendre dans 10 ml de RPMI 1640 milieu contenant 10% (v/ v) sérum bovin fœtal (FBS), pour inactiver la trypsine (figure 1E). Ensuite, transférez les cellules résuspendus dans un tube conique de 15 ml (Figure 1F).
4. Faites tourner les cellules (présentes dans le tube conique) à 100 x g pendant 3 min dans une centrifugeuse dédiée à la culture cellulaire (Figures 1G-H).
5. Pendant que les cellules sont filées vers le bas, aliquot 50 μl de matrice dans un tube de microcentrifugeuse de 1 ml (note : chaque plat à fond de verre se voit attribuer un tube de microcentrifugeuse; par conséquent, si l’expérience nécessite 3 plats, alors il s’ensuit que 3 tubes de microcentrifugeuse sont nécessaires aussi), puis placent le tube sur la glace (figure 1B).
6. Aspirer le milieu du tube conique de l’étape 1.4, tout en laissant la pastille intacte (Figure 1I). Resuspendez les cellules (qui ont été filées vers le bas) dans 1 ml de milieu RPMI complété par FBS (Figure 1J).
7. Une fois que les cellules sont comptées à l’aide d’un hémocytomètre (figure 1K), ou d’un compteur de particules cellulaires aliquot 2,5 x 104 cellules dans le tube de microcentrifugeuse et couronner à l’aide de supports appropriés afin d’obtenir un volume total de 50 μl (Figure 1L).
8. Mélanger les cellules de l’étape 1.7 (25.000 cellules dans 50 μl) avec le tube de microcentrifugeuse matricielle de l’étape 1.5 dans un rapport de 1:1 ; volume final sera de 100 μl (Figure 1M).
9. Plaquez délicatement 100 μl de la matrice : mélange cellulaire de l’étape 1.8 sur le plat enduire matricielle de membrane de sous-sol solidifié de l’étape 1.2 (figure 1N). Cela permet d’intégrer les cellules dans la matrice membranaire du sous-sol.
10. Transférer le plat (es) dans l’incubateur de culture cellulaire (à 37 °C avec 5 % de CO2) et permettre au mélange matrix:cell de se solidifier pendant au moins 30 min.
11. Une fois que le mélange matrix:cell est solidifié, ajouter 2 ml de supports RPMI complétés par FBS au plat (Figure 1O) et reprendre le plat de l’incubateur où il sera stocké pour le reste de l’expérience (Figure 1P).
12. Changez de média tous les jours pendant une période de 5 jours (ou selon les besoins pour un essai; la durée de l’analyse des cellules MDA-MB-231 est de 5 jours).
13. À l’aide d’un microscope léger, prendre des images différentielle de contraste d’interférence (DIC) des colonies MDA-MB-231 suspendues dans la matrice membranaire du sous-sol (figure 2A). Image 20 zones représentatives à 10X objectif une fois par jour pendant cinq jours pour déterminer la morphogenèse de la colonie (Figure 2C).
14. Analyser les images à l’aveuglette pour déterminer la formation stellaire des coloniescellulaires ( Figure 2B). Une colonie est réputée stellaire si une ou plusieurs projections du sphéroïde des cellules sont perçues. Pour déterminer le pourcentage de colonies stellaires envahissantes, divisez le nombre de colonies stellaires par le nombre total de colonies cellulaires par image acquise, puis moyennez les pourcentages de colonies stellaires des 20 images pour chaque jour.

Representative Results

Figure 1. Culture tridimensionnelle des cellules cancéreuses du sein MDA-MB-231 dans la matrice membranaire du sous-sol (la technique d’intégration). A-B) Un schéma de la configuration expérimentale (effectuée dans le capot de fumée). C) Le puits du plat à fond de verre recouvert de 50 μl de matrice membranaire du sous-sol. D) Plat(es) placé dans un incubateur de culture cellulaire (à 37 °C avec 5% de CO2) pour permettre à la matrice de se solidifier pendant au moins 30 min. E) Les cellules ont été trypsinisées. F) Les cellules ont été résuspendus dans un tube conique de 15 ml. G-H) Les cellules (présentes dans le tube conique) ont été filées vers le bas à 100 x g pendant 3 min dans une centrifugeuse de culture de tissu. I) Granule cellulaire. J) Les cellules (qui ont été filées vers le bas) ont été résuspendées dans 1 ml de milieu RPMI FBS-complété. K) Les cellules ont été comptées à l’aide d’un hémocytomètre. L) 2,5 x 104 cellules aliquoted dans le tube de microcentrifugeuse et complété à l’aide de supports appropriés afin d’obtenir un volume total de 50 μl. M) Mélanger les cellules de l’étape 1.7 (25.000 cellules dans 50 μl) avec le tube de microcentrifugeuse matricielle de l’étape 1.5 dans un rapport 1:1 ; le volume final sera de 100 μl. N) Plaquez doucement 100 μl de la matrice : mélange cellulaire de l’étape 8 sur le plat solidifié enduit de matrice de l’étape 1.2. O) Une fois que le mélange matrix:cell est solidifié, ajouter 2 ml de supports RPMI complétés par FBS au plat. P) Placez le plat dans l’incubateur où il sera stocké pour le reste de l’expérience.

Figure 2. Acquisition d’images et illustration d’images représentatives. A) Images prises au microscope. B) Microscope d’imagerie à contraste différentiel de brouillage (DIC) utilisé pour acquérir des images et, par la suite, des images analysées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. C) Des images représentatives du DIC échantillonnées de cellules MDA-MB-231 (prises une fois par jour pendant cinq jours) sont affichées. ANOVA à sens unique suivi du test de comparaison multiple de Dunnett : *, P < 0,05. Barre d’échelle, 100 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Precooled before use
Bovine serum albumin (BSA)	BioShop	ALB003.100	Used at 3% for IF
1.5 ml tubes	VWR	CA10011-700	CA10011-700
100-mm culture dish BD353003	VWR	CABD353003	Sterile, disposable
15 ml Falcon tube	VWR	CA21008-918	Sterile, disposable
1 ml filtered tips	VWR	10011-350	Sterile, disposable
200 μl filtered tips	VWR	22234-016	Sterile, disposable
20 μl filtered tips	VWR	22234-008	Sterile, disposable
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F1051	Used at 10% (v/v)
RPMI 1640 Medium with Glutamine	Life Technologies	11875-119	Used for culturing of MDA-MB-231 cells
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136)	Lonza	CC-3150	Used for culturing of MCF10A cells
Olympus IX-81 microscope	Olympus		Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)