Ensayo de membrana del sótano de cultivo 3D: Culturing Cancer Cells on 3D Basement Membrane Protein Matrix to Study Cell Invasion

Overview

Este video proporciona una metodología detallada para cultivar células de cáncer de mama en una matriz de proteína de membrana del sótano 3D, ejemplificando el potencial del cultivo 3D en la evaluación de la invasión celular en el entorno circundante.

Protocol

1. Cultivo tridimensional de células de cáncer de mama en matriz de membrana del sótano (la técnica de inserción)

1. Manejo de la matriz de membrana del sótano Matrigel: Descongelar en hielo durante la noche a 4 °C. La matriz de membrana del sótano es líquida a baja temperatura, pero se solidifica a temperatura ambiente. Mantener la matriz de membrana del sótano sobre hielo (Figuras 1A-B).
2. Cubra el plato confocal nº 1 de fondo de vidrio con 50 μl de matriz de membrana del sótano mediante la propagación de la matriz utilizando la punta de un pipetero P-200 en un patrón espiral (Figura 1C). Tenga cuidado al extender la matriz de membrana del sótano para evitar la formación de burbujas de aire. Del mismo modo, evite extender la matriz para cerrar los bordes del plato de fondo de vidrio para evitar la formación de menisco. Si la matriz de membrana del sótano de manipulación inexperta, luego precorizó el plato, P-200 Pipetman y pipetas pueden estar en hielo (alternativamente dejado durante la noche en una nevera a 4 °C). Este paso ofrece tiempo adicional para extender la matriz de membrana del sótano antes de la solidificación. Coloque los platos en una incubadora de cultivo celular (a 37 °C con 5% de CO2) durante al menos 30 minutos para permitir que la matriz de membrana del sótano se solidifique (Figura 1D).
3. Mientras la matriz está en proceso de solidificación, pruebe con una placa de células de 100 mm confluente del 70-80%. Una vez que las células han comenzado a levantarse de la placa, las resuspendieron en 10 ml de medio RPMI 1640 que contiene 10% (v/v) suero bovino fetal (FBS), para inactivar la trippsina (Figura 1E). A continuación, transfiera las células resuspended a un tubo cónico de 15 ml(Figura 1F).
4. Gire las células (presentes en el tubo cónico) a 100 x g durante 3 minutos en una centrífuga de cultivo celular dedicada (Figuras 1G-H).
5. Mientras las células se hilan hacia abajo, aliquot 50 μl de matriz en un tubo de microcentrífuga de 1 ml (nota: a cada plato con fondo de vidrio se le asigna un tubo de microcentrífuga; por lo tanto, si el experimento requiere 3 platos, entonces se deduce que 3 tubos de microcentrífuga también son necesarios), y luego colocar el tubo sobre hielo(Figura 1B).
6. Aspirar el medio desde el tubo cónico desde el paso 1.4, dejando el pellet sin perturbar(Figura 1I). Células resuspend (que han sido hiladas hacia abajo) en 1 ml de medio RPMI complementado con FBS (Figura 1J).
7. Una vez que las células se cuentan utilizando un hemocítómetro (Figura 1K), o un contador de partículas celulares aliquot 2.5 x 104 células en el tubo de microcentrífuga y rematar utilizando medios apropiados para obtener un volumen total de 50 μl (Figura 1L).
8. Mezcle las células del paso 1.7 (25,000 células en 50 μl) con el tubo de microcentrífuga que contiene la matriz del paso 1.5 en una relación de 1:1; el volumen final será de 100 μl (Figura 1M).
9. Coloque suavemente 100 μl de la matriz: mezcla celular desde el paso 1.8 hasta el plato solidificado recubierto de matriz de membrana del sótano desde el paso 1.2 (Figura 1N). Esto permite que las células se integren en la matriz de membrana del sótano.
10. Transfiera los platos a la incubadora de cultivo celular (a 37 °C con un 5% de CO2) y permita que la mezcla matrix:cell se solidifique durante al menos 30 min.
11. Una vez solidificada la mezcla matrix:cell, agregue 2 ml de soporte RPMI complementado por FBS al plato(Figura 1O)y lleve el plato de vuelta a la incubadora donde se almacenará durante el resto del experimento (Figura 1P).
12. Cambie los medios todos los días durante un período de 5 días (o según sea necesario para un ensayo; la duración del ensayo para las celdas MDA-MB-231 es de 5 días de duración).
13. Utilizando un microscopio de luz, tome imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC) de las colonias MDA-MB-231 suspendidas en matriz de membrana del sótano (Figura 2A). Imagen 20 áreas representativas a 10X objetivo una vez al día durante cinco días para determinar la morfosis de colonia (Figura 2C).
14. Analice las imágenes a ciegas para determinar la formación de stellate de colonias celulares (Figura 2B). Una colonia se considera estelar si se perciben una o más proyecciones del esferoide de las células. Para determinar el porcentaje de colonias estelares invasoras, divida el número de colonias estelares por el número total de colonias celulares por imagen adquirida, y luego promediar los porcentajes de colonias estelares de las 20 imágenes para cada día.

Representative Results

Figura 1. Cultivo tridimensional de células de cáncer de mama MDA-MB-231 en matriz de membrana del sótano (la técnica de incrustación). A-B) Un esquema de la configuración experimental (realizado en el capó del humo). C) El pozo del plato con fondo de vidrio recubierto con 50 μl de matriz de membrana del sótano. D) Se intentaron colocar platos en una incubadora de cultivo celular (a 37 °C con 5% de CO2) para permitir que la matriz se solidificara durante al menos 30 min. F) Las células se resuspendieron en un tubo cónico de 15 ml. G-H) Las células (presentes en el tubo cónico) se hilaron a 100 x g durante 3 minutos en una centrífuga de cultivo tisular. I) Pellet celular. J) Las células (que han sido hiladas hacia abajo) fueron resuspended en 1 ml de medio RPMI complementado con FBS. K) Las células se contaron usando un hemociclo. L) 2,5 x 104 células alícitas en el tubo de microcentrífuga y rematadas con medios adecuados para obtener un volumen total de 50 μl. M) Mezclar células del paso 1.7 (25,000 células en 50 μl) con el tubo de microcentrífuga que contiene la matriz desde el paso 1.5 en una relación de 1:1; volumen final será de 100 μl. N) Coloque suavemente 100 μl de la matriz: mezcla celular desde el paso 8 hasta el plato solidificado recubierto de matriz desde el paso 1.2. O) Una vez solidificada la mezcla matrix:cell, agregue 2 ml de soporte RPMI complementado con FBS al plato. P) Coloque el plato en la incubadora donde se almacenará durante el resto del experimento.

Figura 2. Adquisición de imágenes e ilustración de imágenes representativas. A) Imágenes tomadas con un microscopio. B) Microscopio de imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC) utilizado para adquirir imágenes y posteriormente imágenes analizadas mediante software de análisis de imágenes. C) Se muestran imágenes DIC representativas de muestra de celdas MDA-MB-231 (tomadas una vez al día durante cinco días). ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett: *, P < 0.05. Barra de escala, 100 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Precooled before use
Bovine serum albumin (BSA)	BioShop	ALB003.100	Used at 3% for IF
1.5 ml tubes	VWR	CA10011-700	CA10011-700
100-mm culture dish BD353003	VWR	CABD353003	Sterile, disposable
15 ml Falcon tube	VWR	CA21008-918	Sterile, disposable
1 ml filtered tips	VWR	10011-350	Sterile, disposable
200 μl filtered tips	VWR	22234-016	Sterile, disposable
20 μl filtered tips	VWR	22234-008	Sterile, disposable
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F1051	Used at 10% (v/v)
RPMI 1640 Medium with Glutamine	Life Technologies	11875-119	Used for culturing of MDA-MB-231 cells
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136)	Lonza	CC-3150	Used for culturing of MCF10A cells
Olympus IX-81 microscope	Olympus		Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)