3D Kültür Bodrum Membran Tahlil: Hücre İstilasını İncelemek için 3D Bodrum Membran Protein Matrisinde Kanser Hücrelerini Kültleme

Overview

Bu video, 3D bodrum membran protein matrisinde meme kanseri hücrelerini büyütmek için ayrıntılı bir metodoloji sağlar ve hücre istilasının çevreye değerlendirilmesinde 3D kültürünün potansiyelini örneklendirir.

Protocol

1. Bodrum Membran Matrisinde Meme Kanseri Hücrelerinin Üç Boyutlu Kültürü (Gömme Tekniği)

1. Matrigel bodrum membran matrisinin işlenmesi: 4 °C'de bir gecede buzda çözün. Bodrum membran matrisi düşük sıcaklıkta sıvıdır, ancak oda sıcaklığında katılaşır. Bodrum membran matrisini buz üzerinde tutun (Şekil 1A-B).
2. Bir P-200 Pipetman'ın ucunu spiral desende kullanarak matrisi yaymak suretle 50 μl bodrum membran matrisi ile Konfokal No.1 cam tabanlı tabağı örtün (Şekil 1C). Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için bodrum membran matrisini yayarken dikkatli olun. Aynı şekilde, menisküs oluşumunu önlemek için matrisi cam tabanlı kabın sınırlarına yakın bir noktaya yaymaktan kaçının. Deneyimsiz kullanım bodrum membran matrisi ise, o zaman yemeği önceden solumuş, P-200 Pipetman ve pipetler buz üzerinde olabilir (alternatif olarak bir gecede 4 ° C'de bir buzdolabında bırakılır). Bu adım, katılaşmadan önce bodrum membran matrisini yaymak için ek süre sunar. Bodrum membran matrisinin katılaşmasını sağlamak için çanağı bir hücre kültürü inkübatörüne (%5 CO2 ile 37 °C'de) en az 30 dakika yerleştirin (Şekil 1D).
3. Matris katılaşma sürecindeyken, %70-80 bir konfluent 100 mm'lik bir hücre plakası deneyin. Hücreler plakadan çıkmaya başladıktan sonra, tripini inaktive etmek için% 10 (v/v) fetal sığır serumu (FBS) içeren 10 ml RPMI 1640 ortamında yeniden biriktirin (Şekil 1E). Daha sonra yeniden biriktirilen hücreleri 15 ml'lik konik bir tüpe aktarın (Şekil 1F).
4. Hücreleri (konik tüpte bulunur) özel bir hücre kültürü santrifüjü(Şekil 1G-H)içinde 3 dakika boyunca 100 x g'da döndürün.
5. Hücreler aşağı döndürülürken, 1 ml mikrosantrifüj tüpüne aliquot 50 μl matris (not: her cam tabanlı çanağa bir mikrosantrifüj tüpü tahsis edilir; bu nedenle, deney 3 yemek gerektiriyorsa, 3 mikrosantrifüj tüpünün de gerekli olduğunu izler) ve ardından tüpü buza yerleştirir (Şekil 1B).
6. Peleti rahatsız edilmeden bırakırken, konik tüpten ortamı adım 1.4'ten itibarenepire edin ( Şekil 1I). Hücreleri (aşağı döndürülmüştür) 1 ml FBS takviyeli RPMI ortamında(Şekil 1J)yeniden biriktirin.
7. Hücreler bir hemositometre (Şekil 1K) veya bir hücre parçacık sayacı aliquot kullanılarak mikrosantrifüj tüpüne sayıldıktan sonra ve toplam 50 μl hacim elde etmek için uygun ortam kullanılarak üstünü kapatın(Şekil 1L).
8. 1.7. adımdaki hücreleri (50 μl'de 25.000 hücre) 1:1 oranında adım 1.5'ten matris içeren mikrosantrifüj tüpü ile karıştırın; son hacim 100 μl(Şekil 1M)olacaktır.
9. Matrisin 100 μl'lik kısmını hafifçe plakalayın:hücre karışımı adım 1.8'den katılaşmış bodrum membran matrisi kaplı tabağa adım 1.2'den(Şekil 1N). Bu, hücrelerin bodrum membran matrisine gömülmesini sağlar.
10. Çanağı hücre kültürü inkübatörüne (%5 CO2 ile 37 °C'de) aktarın ve matris:hücre karışımının en az 30 dakika katılaşmasına izin verin.
11. Matris:hücre karışımı katılaştıktan sonra, yemeğe 2 ml FBS takviyeli RPMI ortamı ekleyin (Şekil 1O) ve yemeği deneyin geri kalanı için saklanacağı inkübatörü geri alın (Şekil 1P).
12. Medyayı her gün 5 günlük bir süre boyunca değiştirin (veya bir tahlil için gerekli olduğu şekilde; MDA-MB-231 hücreleri için tahlil süresi 5 gündür).
13. Hafif bir mikroskop kullanarak, bodrum membran matrisinde asılı MDA-MB-231 kolonilerinin diferansiyel girişim kontrastı (DIC) görüntülerini alın (Şekil 2A). Koloni morfogenezini belirlemek için beş gün boyunca günde bir kez 10X hedefinde 20 temsili alan (Şekil 2C).
14. Hücre kolonisi yıldız oluşumunu belirlemek için görüntüleri körü körüne analiz edin (Şekil 2B). Bir koloni, hücrelerin küreselinden bir veya daha fazla projeksiyon algılanırsa yıldız olarak kabul edilir. İstilacı yıldız kolonilerinin yüzdesini belirlemek için, yıldız kolonilerinin sayısını elde edilen görüntü başına toplam hücre kolonisi sayısına bölün ve ardından her gün için 20 görüntünün yıldız kolonilerinin yüzdelerini ortalama.

Representative Results

Şekil 1. Bodrum membran matrisinde (gömme tekniği) MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinin üç boyutlu kültürü. A-B) Deneysel kurulumun şeması (duman kaputunda gerçekleştirilir). C) 50 μl bodrum membran matrisi ile kaplanmış cam tabanlı çanağın kuyusu. D) Matrisin en az 30 dk katılaşmasını sağlamak için bir hücre kültürü inkübatörüne (%5 CO2 ile 37 °C'de) yerleştirilen çanak(lar) Hücreler denendi. F) Hücreler 15 ml'lik konik bir tüpe yeniden itildi. G-H) Hücreler (konik tüpte mevcuttur) bir doku kültürü santrifüjde 3 dakika boyunca 100 x g'da aşağı döndürüldü. I) Hücre saçması. J) Hücreler (aşağı döndürülmüştür) 1 ml FBS takviyeli RPMI ortamında yeniden formüle edilmiştir. K) Hücreler hemositometre kullanılarak sayıldı. L) 2.5 x 104 hücre mikrosantrifüj tüpüne aliquoted ve toplam 50 μl hacim elde etmek için uygun ortam kullanarak tepesinde. M) Adım 1.7'den (50 μl'de 25.000 hücre) hücreleri matris içeren mikrosantrifüj tüpü ile adım 1.5'ten 1:1 oranında karıştırın; son hacim 100 μl olacaktır. N) Matrisin 100 μl'lik kısmını hafifçe plakalayın: 8. adımdan katılaşmış matris kaplı tabağa 1.2 adımdan hücre karışımı. O) Matris:hücre karışımı katılaştıktan sonra, yemeğe 2 ml FBS takviyeli RPMI ortamı ekleyin. P) Çanağı, deneyin geri kalanı için saklanacağı inkübatöre yerleştirin.

Şekil 2. Resim edinimi ve temsili görüntülerin illüstrasyonu. A) Mikroskopla çekilen görüntüler. B) Görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edilen görüntüleri ve daha sonra görüntüleri elde etmek için kullanılan diferansiyel girişim kontrastı (DIC) görüntüleme mikroskobu. C) MDA-MB-231 hücrelerinin örnek temsili DIC görüntüleri (beş gün boyunca günde bir kez alınır) gösterilir. Tek yönlü ANOVA ve ardından Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi: *, P < 0.05. Ölçek çubuğu, 100 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Precooled before use
Bovine serum albumin (BSA)	BioShop	ALB003.100	Used at 3% for IF
1.5 ml tubes	VWR	CA10011-700	CA10011-700
100-mm culture dish BD353003	VWR	CABD353003	Sterile, disposable
15 ml Falcon tube	VWR	CA21008-918	Sterile, disposable
1 ml filtered tips	VWR	10011-350	Sterile, disposable
200 μl filtered tips	VWR	22234-016	Sterile, disposable
20 μl filtered tips	VWR	22234-008	Sterile, disposable
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F1051	Used at 10% (v/v)
RPMI 1640 Medium with Glutamine	Life Technologies	11875-119	Used for culturing of MDA-MB-231 cells
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136)	Lonza	CC-3150	Used for culturing of MCF10A cells
Olympus IX-81 microscope	Olympus		Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)