Overview
このビデオは、周囲の環境への細胞浸潤の評価における3D培養の可能性を例示し、3D基膜タンパク質マトリックスで乳癌細胞を成長させる詳細な方法論を提供する。
Protocol
1. 基部膜マトリックスにおける乳がん細胞の三次元培養(埋め込み技術)
- マトリゲル基質膜マトリックスの取り扱い:4°Cで一晩氷上で解凍する。 基質膜マトリックスは低温で液体であるが、室温で固化する。氷の上に基膜マトリックスを保つ(図1A-B)。
- P-200ピペットマンの先端をスパイラルパターンで広げ、50μlの基底膜マトリックスで共焦点No.1ガラス底皿を覆います(図1C)。気泡の形成を避けるために、基部膜マトリックスを広げる際には注意が必要です。同様に、半月板の形成を防ぐために、ガラス底皿の境界に近いマトリックスを広めないようにしてください。地下室膜マトリックスを扱う経験が浅い場合は、皿を予冷し、P-200ピペットマンとピペットは氷の上にすることができます(代わりに4°Cの冷蔵庫に一晩放置)。このステップは、固化前に基膜マトリックスを広げるために追加の時間を提供します。この皿を細胞培養インキュベーター(5%CO2の37°C)に少なくとも30分間置き、基質膜マトリックスを固化させる(図1D)。
- マトリックスが固化している間、細胞の70-80%コンフルエント100mmプレートをトリプシン化する。細胞がプレートから持ち上がり始めたら、10%(v/v)胎児胎児血清(FBS)を含むRPMI 1640培地の10mlで再懸濁し、トリプシンを不活性化する(図1E)。次に、再懸濁した細胞を15ml円錐管に移す(図1F)。
- 専用の細胞培養遠心分離機で細胞を100 x gで3分間回転させる(円錐形チューブ中に存在する)。
- 細胞がスピンダウンされている間、アリコート50μlのマトリックスを1mlマイクロ遠心チューブに(注:各ガラス底皿には1つのマイクロ遠心チューブが割り当てられているため、実験に3つの皿が必要な場合は、3つのマイクロ遠心チューブも必要です)、氷の上にチューブを置きます(図1B)。
- ステップ1.4から円錐管から培地を吸引し、ペレットを邪魔されずに残す(図1I)。FBS補充RPMI培地の1mlで細胞(スピンダウンされた)を再中断する(図1J)。
- ヘモサイトメーター(図1K)を用いて細胞をカウントすると、微細遠心管内に2.5 x 104細胞の細胞粒子カウンターアリコートを用いて、50μlの総体積を得るために適切な培地を使用してそれを上げた(図1L)。
- ステップ1.7(50 μlの25,000細胞)の細胞を、ステップ1.5のマトリックス含有マイクロ遠心分離管と1:1の比率で混合します。最終ボリュームは100 μlになります(図1M)。
- マトリックスの100 μlをそっとプレート:ステップ1.8から固化基膜マトリックスコーティング皿にステップ1.2(図1N)までの細胞混合物。これにより、細胞を基質膜マトリックスに埋め込む。
- 培養器に皿を移し(5%CO2で37°Cで)、マトリックス:細胞混合物を少なくとも30分間固めます。
- マトリックス:細胞混合物が固まったら、2mlのFBS補充RPMI培地を皿(図1O)に加え、残りの実験のために保存されるインキュベーターを取り戻す(図1P)。
- 培地を5日間変更します(またはアッセイに必要な場合に従って、MDA-MB-231細胞のアッセイの期間は5日間です)。
- 軽顕微鏡を用いて、基体膜マトリックスに懸濁したMDA-MB-231コロニーの微差干渉コントラスト(DIC)画像を撮る(図2A)。コロニー形態形成を決定するために10X目的で10Xの代表的領域を1日1回5日間画像化する(図2C)。
- 画像を 盲目的に 分析して細胞コロニーの星状形成を決定する(図2B)。細胞のスフェロイドからの1つ以上の突起が知覚される場合、コロニーは星状であると見なされる。侵襲的な星状コロニーの割合を決定するには、星状コロニーの数を取得した画像あたりの細胞コロニーの総数で割り、1日あたり20画像の星状コロニーの割合を平均する。
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Representative Results
図 1.MDA-MB-231乳がん細胞の基部膜マトリックスにおける三次元培養(埋め込み技術)。 A-B)実験用セットアップの模式図(ヒュームフードで行う)。C) 50 μlの基底膜マトリックスでコーティングされたガラス底皿のウェル。D)ディッシュ(es)細胞培養インキュベーター(5%CO2で37°C)に入れ、マトリックスが少なくとも30分間固化することを可能にする。F)細胞を15ml円錐管に再懸濁した。G-H)細胞(円錐管に存在する)を、遠心分離機の組織培養で3分間100xgでスピンダウンした。I) 細胞ペレット。J)細胞(スピンダウンされた)を、FBS補充RPMI培地の1mlに再懸濁した。K)細胞は、ヘモサイトメーターを用いて計数した。L) マイクロ遠心分離管に2.5 x 104細胞を取り込み、50μlの総体積を得るために適切な培地を使用してトッピングした。M) ステップ 1.7 (50 μl の 25,000 細胞) のセルと、ステップ 1.5 のマトリックス含有マイクロ遠心分離管を 1:1 の比率で混合します。最終ボリュームは100 μlになります。N)マトリックスの100μlを穏やかにプレート:ステップ8からステップ1.2から固化したマトリックスコーティング皿に細胞混合物。O)マトリックス:細胞混合物が固まったら、2mlのFBS補充RPMI培地を皿に加える。P)皿をインキュベーターに入れ、残りの実験のために保存します。
図 2.代表的な画像の画像取得とイラスト。 A) 顕微鏡で撮影した画像。B) 画像を取得するために使用される微差干渉コントラスト(DIC)イメージング顕微鏡、画像解析ソフトウェアを用いて画像解析を行う。C) MDA-MB-231細胞の代表的なDIC画像(1日1回5日間撮影)を示す。一方向の分散分析に続いて、ダネットの多重比較テスト :*、P <0.05。スケールバー、100 μm。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
| 1.5 ml tubes | VWR | CA10011-700 | CA10011-700 |
| 100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
| 15 ml Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
| 1 ml filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
| 200 μl filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
| 20 μl filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
| RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
| MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X) |
