Overview
וידאו זה מספק מתודולוגיה מפורטת לגדל תאים סרטניים בשד במטריצת חלבון קרום מרתף 3D, מדגים את הפוטנציאל של תרבות 3D בהערכת פלישת תאים לסביבה שמסביב.
Protocol
1. תרבות תלת מימדית של תאי סרטן השד במטריצת קרום מרתף (טכניקת ההטבעה)
- טיפול מטריצת קרום מרתף Matrigel: להפשיר על קרח לילה ב 4 מעלות צלזיוס. מטריצת קרום מרתף היא נוזלית בטמפרטורה נמוכה אך מתגבשת בטמפרטורת החדר. שמור מטריצת קרום מרתף על קרח(איורים 1A-B).
- מכסים את המנה Confocal No.1 תחתית זכוכית עם 50 μl של מטריצת קרום מרתף באמצעות הפצת המטריצה באמצעות קצה של P-200 Pipetman בתבנית ספירלה (איור 1C). נקוט זהירות בעת הפצת מטריצת קרום המרתף כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר. כמו כן, הימנעו מהפצת המטריצה קרוב לגבולות המנה התחתונה מזכוכית כדי למנוע היווצרות מניסקוס. אם טיפול לא מנוסה מטריצת קרום מרתף, אז precooled את המנה, P-200 Pipetman ופיפטות יכול להיות על קרח (לחילופין נשאר לילה במקרר ב 4 מעלות צלזיוס). שלב זה מציע זמן נוסף כדי להפיץ את מטריצת קרום המרתף לפני התגבשות. מניחים את הכלים באינקובטור של תרבות התאים (ב-37°C עם 5% CO2) למשך 30 דקות לפחות כדי לאפשר למטריצת קרום המרתף להתמצק(איור 1D).
- בזמן שהמטריצה עוברת התמצקות, נסו צלחת תאים של 70-80% 100 מ"מ. לאחר שהתאים החלו להרים את הצלחת, יש להשתמש בהם מחדש ב-10 מ"ל של RPMI 1640 בינוני המכיל 10% (v/v) סרום שור עוברי (FBS), כדי להשבית את הנסיון (איור 1E). לאחר מכן העבירו את התאים שעברו שימוש חוזר לצינור חרוט של 15 מ"ל(איור 1F).
- לסובב את התאים (נוכח צינור חרוט) ב 100 x g במשך 3 דקות בצנטריפוגה תרבות התא ייעודי(איורים 1G-H).
- בזמן שהתאים מסתובבים למטה, aliquot 50 μl של מטריצה לתוך צינור microcentrifuge 1 מיליליטר (הערה: כל צלחת תחתית זכוכית מוקצה צינור microcentrifuge אחד; ומכאן, אם הניסוי דורש 3 מנות, אז המסקנה היא כי 3 צינורות microcentrifuge נחוצים גם כן), ולאחר מכן למקם את הצינור על קרח(איור 1B).
- שאפו את המדיום מהצינור החרוטי משלב 1.4, תוך השארת גלולה באין מפריע (איור 1I). שימוש חוזר בתאים (שסובבו למטה) במיליליטר אחד של מדיום RPMI בתוספת FBS(איור 1J).
- לאחר ספירת התאים באמצעות המוציטרומטר (איור 1K), או מונה חלקיקי תאים aliquot 2.5 x 104 תאים לתוך צינור microcentrifuge ומעל אותו באמצעות מדיה מתאימה כדי להשיג נפח כולל של 50 μl (איור 1L).
- מערבבים את התאים משלב 1.7 (25,000 תאים ב 50 μl) עם צינור microcentrifuge המכיל מטריצה משלב 1.5 ביחס 1:1; הנפח הסופי יהיה 100 μl(איור 1M).
- צלחת בעדינות 100 μl של המטריצה:תערובת תאים משלב 1.8 אל צלחת מטריצת ממברנת מרתף מוצק מצופה משלב 1.2 (איור 1N). זה מאפשר לתאים להיות מוטבעים במטריצת קרום מרתף.
- מעבירים את הכלים לחממה של תרבית התאים (ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2) ומאפשרים לתערובת התאים להתמצק לפחות 30 דקות.
- לאחר שהמטריקס:תערובת התאים מתמצתת, הוסיפו 2 מ"ל של מדיית RPMI בתוספת FBS למנה(איור 1O)והחזירו את המנה לאינקובטור שבו היא תאוחסן למשך שארית הניסוי(איור 1P).
- שינוי מדיה מדי יום לתקופה של 5 ימים (או לפי הצורך לבדיקה; משך ההסתעפות לתאי MDA-MB-231 הוא 5 ימים).
- באמצעות מיקרוסקופ אור, צלם תמונות ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) של מושבות MDA-MB-231 התלויות במטריצת קרום מרתף(איור 2A). תמונה 20 אזורים מייצגים ב 10X המטרה פעם ביום במשך חמישה ימים כדי לקבוע morphogenesis המושבה (איור 2C).
- לנתח תמונות באופן עיוור כדי לקבוע היווצרות כוכבי מושבת תאים (איור 2B). מושבה נחשבת כוכבית אם הקרנות אחת או יותר מהספרואיד של התאים נתפסות. כדי לקבוע את אחוז המושבות הכוכביות הפולשניות, חלק את מספר המושבות הכוכביות במספר הכולל של מושבות תאים לכל תמונה נרכשת, ולאחר מכן תעמיד בממוצע את אחוזי המושבות של 20 התמונות עבור כל יום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1. תרבות תלת מימדית של תאי סרטן השד MDA-MB-231 במטריצת קרום מרתף (טכניקת ההטבעה). A-B) סכמטי של ההתקנה הניסיונית (מבוצע במכסה המנוע אדים). ג) הבאר של המנה עם תחתית הזכוכית מצופה 50 מיקרומטר של מטריצת קרום מרתף. D) Dish(es) ממוקם באינקובטור תרבות התא (ב 37 °C (70 °F עם 5% CO2) כדי לאפשר את המטריצה להתמצק לפחות 30 דקות. E) תאים היו טריפסיניזציה. ו) תאים הוכנסו לצינור חרוט של 15 מ"ל. G-H) תאים (נוכח צינור חרוט) סובבו למטה ב 100 x g במשך 3 דקות בצנטריפוגה תרבית רקמה. I) גלולת תא. J) תאים (כי כבר סובבו למטה) היו בשימוש חוזר ב 1 מ"ל של בינוני RPMI בתוספת FBS. K) תאים נספרו באמצעות המוציטרומטר. L) 2.5 x 104 תאים aliquoted לתוך צינור microcentrifuge ומעליו באמצעות מדיה מתאימה כדי להשיג נפח כולל של 50 μl. M) מערבבים תאים משלב 1.7 (25,000 תאים ב 50 μl) עם צינור microcentrifuge המכיל מטריצה משלב 1.5 ביחס 1:1; הנפח הסופי יהיה 100 μl. N) צלחת בעדינות 100 μl של המטריצה: תערובת תאים משלב 8 אל צלחת מטריצה מוצק מצופה משלב 1.2. O) לאחר מטריצה:תערובת התא הוא מוצק, להוסיף 2 מ"ל של מדיה RPMI בתוספת FBS למנה. P) מניחים את המנה באינקובטור שבו היא תהיה מאוחסנת למשך שארית הניסוי.
איור 2. רכישת תמונה ואיור של תמונות מייצגות. A) תמונות שצולמו במיקרוסקופ. ב) מיקרוסקופ הדמיה של ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) המשמש לרכישת תמונות ולאחר מכן תמונות שנותחו באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. ג) מוצגות תמונות DIC מייצגות לדוגמה של תאי MDA-MB-231 (שצולמו פעם ביום במשך חמישה ימים). ANOVA בכיוון אחד ואחריו מבחן ההשוואה המרובות של דאנט: *, P < 0.05. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
| 1.5 ml tubes | VWR | CA10011-700 | CA10011-700 |
| 100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
| 15 ml Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
| 1 ml filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
| 200 μl filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
| 20 μl filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
| RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
| MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X) |
