Summary
이 절차는 높은 수율로의 DNA 조각의 정화 수 있습니다.
Abstract
정화 DNA 조각은 분자 생물학에서 다양한 용도로 사용되며 그들은 몇 가지 절차로 준비하실 수 있습니다. 그들의 대부분은 관심의 밴드를 분리하기 위해 DNA 조각의 이전 전기를 필요로합니다. 그런 다음,이 밴드는 아가로 오스 또는 아크릴 아미드 겔에서 밖으로 excised 및 사용하여 정화 중입니다 유리 또는 실리카 입자, DEAE - 셀룰로오스의 점막에서 바인딩과 용출은 "방법을 호감과 흡수"electroelution 또는 매우 자주 비싼 상업 정화 키트. 따라서, 방법을 선택하면 실험실에서 사용할 수있는 무엇을 주로 따라 달라집니다. electroelution 절차는 한 응용 프로그램의 많은 (시퀀싱, radiolabeling, 효소 제한, 효소 수정, 복제 등)에 사용되는 매우 깨끗한 DNA를 정화 수 있습니다. 이 절차는 배치에 구성되어 DNA 밴드가 포함된 다음 적용 전류 electroeluter의 샘플 우물로 아가로 오스 또는 아크릴 아미드 조각하면 DNA 조각은 아가로 오스을 떠날 수 있도록하고 있으므로 에탄올 침전에 의해 나중에 복구하는 쿠션 소금에 갇혀 수 있습니다.
Protocol
- 정화가에 관심이 DNA 조각을 선택하기 위해서는 이러한 아가로 오스에서 해결되어야 또는 아크릴 아미드의 젤은 1 시간 동안 120 볼트에서 0.5X TBE 버퍼 (트리스 borate, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))를 사용 전기 영동하여 ethidium의 브로마이드 물들일 젤. 이를 위해, 플라스미드 pProEx - GdMre11S의 ~ 700 NG (6000 - BP)은 이전에 NdeI와 HindIII와 소화는 900 - BP 조각 (조각의 플라스미드와 84 NG의 560 NG)를 출시하는 데 사용되었다.
- electroeluter 탱크 (그림 1)은 중간 고원에 흘리면 안되 돌보는 마찬가지로 중간 고원의 양쪽에서 배포 0.5X TBE 가득해야합니다.
- 선택한 밴드 (또는 밴드)은 젤 도려낸, 그리고 가까이 가능한 V 채널 (물론 당 슬라이스)로 같은 샘플 챔버에 배치됩니다. 실행 버퍼는 각 챔버에 추가되어야하며 겔 슬라이스를 충당하기 위해 충분.
- 사용하는 각 V 채널은 함정에 기포를 제거하기 위해 파스퇴르 피펫로 플러시해야합니다.
- 다음 10 M NH 4 아세테이트 100 UL은 (bromophenol 파란색의 작은 금액이 충분히 그것을 컬러로, 추가 시각화를 촉진하기) 가볍게 V 채널 내부에 추가됩니다.
- 높은 소금 쿠션의 resuspension을 방지하기 위해 뚜껑이 부드럽게 폐쇄해야합니다.
- Electroelution은 25 분 동안 100 볼트에서 시작됩니다.
- electrolution가 완료되면, 400 UL은 V 채널에서 삭제, 1 시간 또는 숙박에 대해 4 추위 에탄올과 글리코겐 (DNA 복구를 개선하기 위해 권장) 2 권 ° C로 시켰던 수 microfuge 튜브에 배치됩니다.
- 20 분 동안 원심 분리기, 뜨는 제거하고 70 % 에탄올로 씻는다.
- 드라이 튜브와 OD 260 nm의에서 DNA를 계량.
- 얻은 복구 75 % (84가 NG가 V 채널에 배치했을 때 63 NG가 회복)되었습니다.
그림 1. Electroeluter 다이어그램. 음극은 슬라이스 겔에 포함된 탱크, DNA의 각 측면에 표시됩니다 (검은색 사각형으로 그림)는 부정적인 요금으로 인해 음극으로 마이 그 레이션됩니다 Anod. 그렇다면 그것은 V 채널에있는 소금 쿠션 (거꾸로 검정색 삼각형로 표시됨)에 갇혀있는 것입니다.
Discussion
실행의 기간은 최대 조각 일반적으로, 조각의 크기에 매우 달려 작은 조각을 위해 10 분마다 모니터링 자외선이 통과하기 위해 조각을 방지하기 위해 필요한 동안 1 시간 20킬로바이트 50 분, 충분 소금 쿠션과 결과적으로 복구를 감소 anodal 버퍼 챔버 있습니다. 당신은 100 볼트에서 전원 공급 장치를 설정할 때, 현재 적어도 10 mAmp있다는 것을 확인하는 것이 중요합니다. DNA 밴드는 UV - 손 램프를 사용하여 모니터링이가 젤 조각을 버리지 감지 수 있습니다. 쿠션 소금도 3 M 나 아세테이트로 만들 수 있습니다.
이 절차는 좋은 회복 (~ 80 %)과 다양한 크기의 DNA 또는 RNA 조각의 정화가 수정 효소 등 처리 제한 효소에 의해 소화, radiolabeled 수 있습니다
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
박사 Bermudez 실험실에서 작업이 Conacyt (부여 # 82622)에 의해 재정 지원되었다. 우리는 가브리엘라 구티에레즈 - 소사, Eliuth 레예스 - 마르티네스와 electroleution 절차를 녹화 비디오 Ximena로드 리게스 - 토레스. 감사합니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NdeI | New England Biolabs | R0111L | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| NH4 acetate | JT Baker | 0596 | |
| agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Biophotometer | Eppendorf | 6131 000 020 | |
| Electr–luter | IBI | UEA CAT 46000 |
References
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).
