Super-Resolution Imaging der Bakterien Abteilung Machinery

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine super-resolution imaging Methode, um die strukturelle Organisation des bakteriellen FtsZ-Ring, ein wesentlicher Vorrichtung zur Zellteilung zu untersuchen. Diese Methode basiert auf quantitativen Analysen von photoaktivierten Lokalisierungs-Mikroskopie (PALM) Bilder und kann auf andere bakterielle Proteine ​​des Zytoskeletts angewendet werden.

Zusammenfassung

Bakterielle Zellteilung erfordert die koordinierte Anordnung von mehr als zehn essentiellen Proteine ​​bei midcell ^1,2. Im Mittelpunkt dieses Verfahrens ist die Bildung eines ringähnlichen Suprastruktur (Z-Ring) durch die FtsZ Protein bei der Teilung Plan ^3,4. Der Z-Ring besteht aus mehreren einsträngige FtsZ Protofilamenten, und das Verständnis der Anordnung der Protofilamente innerhalb der Z-Ring wird einen Einblick in den Mechanismus der Z-Ring Montage und ihrer Funktion als Krafterzeuger ^5,6 geben. Diese Information ist bisher unklar in herkömmlichen Fluoreszenz-Mikroskopie und Elektronenmikroskopie aufgrund der aktuellen Einschränkungen. Konventionellen Fluoreszenzmikroskop ist nicht ein hochauflösendes Bild des Z-Ring aufgrund der Beugungsgrenze des Licht (~ 200 nm) bereitzustellen. Electron cryotomographic Bildgebung erkannt hat FtsZ Protofilamente in kleinen C. verstreut crescentus Zellen ^7, ist jedoch schwierig, zu größeren Zellen wie geltenE. coli oder B. subtilis. Hier haben wir die Anwendung eines Super-Resolution-Fluoreszenz-Mikroskopie-Methode zu beschreiben, Photoaktiviertes Localization Microscopy (PALM), quantitativ zu charakterisieren die strukturelle Organisation des E. coli Z-Ring ^8.

PALM Bildgebung bietet sowohl eine hohe räumliche Auflösung (~ 35 nm) und spezifische Kennzeichnung für die eindeutige Identifizierung von Zielproteinen zu ermöglichen. Wir markierten FtsZ mit dem photoaktivierbaren Fluoreszenzprotein mEos2, die von grünen Fluoreszenz (Anregung = 488 nm) nach rot schaltet Fluoreszenz (Anregung = 561 nm) bei Aktivierung bei 405 nm ^9. Während eines Experiments PALM werden einzelne FtsZ-mEos2 Moleküle stochastisch aktiviert und die entsprechenden Zentroidpositionen der einzelnen Moleküle sind mit <20 nm Genauigkeit bestimmt. Ein Super-Resolution-Bild der Z-Ring wird dann durch die Überlagerung der Zentroidpositionen aller erkannten FtsZ-mEos2 Moleküle rekonstruiert. <p class = "jove_content"> Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde festgestellt, dass der Z-Ring einen festen Breite von ~ 100 nm aufweist und aus einem Bündel von losen FtsZ Protofilamenten, die miteinander überlappen, in drei Dimensionen besteht. Diese Daten liefern ein Sprungbrett für weitere Untersuchungen der Zellzyklus abhängigen Veränderungen der Z-Ring ¹⁰ und kann auf andere Proteine ​​von Interesse angewendet werden.

Protokoll

Ein. Probenvorbereitung

1. Beimpfen LB Medium mit einer Einzelkolonie des Stammes JB281 [BW25113 / pJB042 (P _Lac: FtsZ-mEos2)]. Über Nacht wachsen in einem Schüttler bei 37 ° C.
2. Verdünnen Sie die Kultur 1:1,000 in M9 ⁺ minimal media [M9 Salze, 0,4% Glucose, 2 mM MgSO _4, 0,1 mM CaCl _2, MEM Aminosäuren und Vitamine] und wachsen bis zur mittleren logarithmischen Phase (OD ₆₀₀ = 0,2-0,3) in Gegenwart von Chloramphenicol (150 ug / ml) bei Raumtemperatur (RT).
3. Erbrechen Kultur mit 20 uM IPTG für 2 Stunden (siehe Anmerkung Nr. 1).
4. Pellet Kultur in Mikrozentrifuge (8.000 UpM, 1 min) ....

Ergebnisse

Veranschaulicht in 3Aiv ist eine zweidimensionale, Superauflösung Rendering der Z-Ring aus der PALM Bildgebungsverfahren oben beschrieben erzeugt. Im Folgenden fassen wir qualitative und quantitative Informationen, die von ihnen gewonnen werden können.

Qualitativ beobachteten wir, dass die Z-Ring ein unregelmäßiger Struktur, die mehrere Konfigurationen (einzelnes Band oder schraubenförmigen Lichtbogens), die nicht in herkömmlichen unterscheidbar Fluoreszenzbilder (vergleiche.......

Diskussion

PALM Bilder enthalten Informationen über Molekül Zählungen und Positionen innerhalb einer Zelle, so dass detaillierte Analyse der Verteilung und Anordnung der Target-Protein-Moleküle, die nur schwer mit anderen Mitteln erreichen. Nachfolgend skizzieren wir Vorsichtsmaßnahmen getroffen, um eine genaue quantitative Informationen zu extrahieren und gleichzeitig die biologische Relevanz der PALM Bilder werden sollte. Wir auch die Informationen, die am besten erhalten werden kann mit live vs fixierten Zellen. Schließlich sch.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenz / Material	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
50 x MEM Amino Acids	Sigma	M5550
100 x MEM Vitamine	Sigma	M6895
IPTG	Mediatech	46-102-RF
16% Paraformaldehyd	Electron Micrsocopy Sciences	15.710-S
SeaPlaque GTG Agarose	Lonzo	50111
50 nm Gold Perlen	Microspheres-Nanospheres	790113-010
FCS2 Imaging Chamber	Bioptechs
Stufe Adapter	ASI	I-3017
Inverses Mikroskop	Olymp	IX71
1,45 NA, 60x Objective	Olymp
IXON EMCCD Kamera	Andor Technology	DU897E
488-nm Sapphire Laser	Kohärent
561-nm Sapphire Laser	Kohärent
405-nm CUBE Laser	Kohärent