Summary
Time-lapse mikroskopi og billedbehandling teknikker blev brugt til at observere og analysere fibroblast-medieret gel komprimering og fibrin fiber justering i en miljøkontrolleret bioreaktor over en 48 timers periode.
Abstract
Celler indlejret i kollagen og fibrin geler vedhæfte og udøve trækkraft kræfter på fibrene i gelen. Disse kræfter kan føre til lokal og global reorganisering og justering af gelmikrostrukturen. Denne proces fortsætter på en kompleks måde, der til dels afhænger af samspillet mellem cellernes placering, gelens geometri og de mekaniske begrænsninger på gelen. For bedre at forstå, hvordan disse variabler producerer globale fiberjusteringsmønstre, bruger vi DIC-mikroskopi (time-lapse differential interference contrast) kombineret med en miljøstyret bioreaktor til at observere komprimeringsprocessen mellem geometrisk fordelte explants (klynger af fibroblaster). Billederne analyseres derefter med en brugerdefineret billedbehandlingsalgoritme for at få kort over stammen. Oplysningerne fra denne teknik kan bruges til at undersøge mekanobiologien af forskellige cellematrixinteraktioner, hvilket har vigtige konsekvenser for forståelsesprocesser i sårheling, sygdomsudvikling og vævstekniske applikationer.
Introduction
Et vigtigt redskab til at studere celle-matrix interaktioner er cellen befolket kollagen gel1,2. Gelen giver et 3D-miljø, der er tættere på vævets in vivo-karakter og bedre egnet til at forstå celleadfærd end traditionelle 2D-kulturer3. Tidlige undersøgelser, hvor fibroblaster blev homogent fordelt i en kollagen gel fandt, at cellerne hurtigt konsolidere kollagen fibre og komprimere gel4,5. Den kontraktile fibroblaster i frit flydende geler derefter overgangen til en hvilende tilstand kort efter gelen er fuldt nået komprimering1,6,7. Fibroblasterne i geler, der er begrænset ved grænserne, forbliver i en aktiv, syntetisk tilstand8, og de genererer fiberjustering på en måde, der er afhængig af gelgeometri og eksterne begrænsninger5,9. Forskelle i celleaktivitet synes at være et resultat af den interne spænding (eller mangel på samme), der udvikler sig som cellerne udøver trækkraft kræfter via integrins på kollagen fibre i gelen.
En variant af denne teknik indebærer at placere fibroblast explants(dvs. klumper af celler) en afstand fra hinanden i en kollagen gel og observere celle-matrix interaktioner og den gradvise udvikling af fiber tilpasning mellem explants (undertiden kaldet ligament-lignende stropper)10-12. Den primære fordel ved det eksplante system er, at det giver en mulighed for at arrangere cellerne i enkle geometriske mønstre, hvilket gør det lettere at visualisere og undersøge de mekanismer, der ligger til grund for celledrevet fiberjustering. Disse tilpasningsmønstre - som primært afhænger af samspillet mellem celletrækkræfter, celle rumlig distribution, gelgeometri og de mekaniske begrænsninger på gelen - er vigtige at forstå, fordi de spiller en central rolle i den globale vævsorganisation, mekanisk funktion og lokalt mekanisk miljø13.
Inden for vævsteknik involverer en strategi for fremstilling af mekanisk funktionelle, manipulerede væv at kontrollere fiberjusteringsmønsteret, der udvikler sig fra cellekomprimering, så det manipulerede væv besidder fiberjustering, der efterligner det indfødte væv14,15. En sådan tilpasning menes nødvendig for manipuleret væv til at kopiere den komplekse mekaniske adfærd indfødte væv. En ændring af denne strategi er at erstatte kollagen gel med en fibrin gel16. Fibrin gelen udvikler et lignende justeringsmønster som en kollagengel under komprimering. Over tid fibrin nedbrydes og erstattes med celle-syntetiseret ECM, der følger den oprindelige fibrin fiber justering mønster. Den resulterende konstrueret konstruktion har væsentligt forbedret mekaniske egenskaber i forhold til kollagen gel afledt konstruktioner17.
Tilpasningsprocessen og efterfølgende ombygningshændelser i fibrin geler fortsætter på en kompliceret og dårligt forstået måde. For bedre at karakterisere disse interaktioner og deres virkning på celleadfærd og ECM-remodeling har vi udviklet en procedure, der er baseret på explant-metoden. I denne metode er fibroblast explants placeret på en fibrin gel i forskellige geometriske mønstre. Gelerne vedligeholdes i en miljøkontrolleret, mikroskopmonteret bioreaktor18, og komprimerings- og fiberjusteringsprocessen overvåges med time-lapse differentialinterferenskontrastkontrast (DIC) mikroskopi. Forskydningsfelter kvantificeres med brugerdefinerede algoritmer. De data, der er opnået fra disse eksperimenter, har vidtrækkende konsekvenser for en række processer, herunder optimering af vævstekniske strategier, forbedring af sårheling og behandling af patologisk vævs remodeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af stencil
Forbered en stencil på Parafilm til layout placeringen af hver explant, efter den ønskede geometri (Figur 1A og 1B). Plads hver explant ca 1-2 mm fra hinanden. Denne afstand svarer til en ideel afstand til generering af fiberjustering mellem explants. Sæt stencilen under det område af dækglasset, hvor prøven skal tilberedes med tape.
2. Sterilisering
Rengør alle komponenter i bioreaktoren grundigt ved hjælp af 70% ethanol og steriliser i 2-3 timer under UV-lys før forsøg. Hvis der anvendes et alternativt fartøj i stedet for en bioreaktor, bør der anvendes passende steriliseringsteknikker. Se trin 4.12 for kommentarer til brug af en glasbund petriskål.
3. Fibrin Gel Forberedelse
Efter at komponenterne i bioreaktoren er steriliseret, kastede et tyndt lag fibringel på overfladen af dækglasset. Nærmere oplysninger om fremstilling af fibrinogen- og thrombinbestandsopløsninger til fremstilling af 6,6 mg/ml fibringeléer er beskrevet i Sander et al. 13 En lignende protokol fra Ye et al. 19 til fremstilling af 3,3 mg/ml fibrin geler kan også ses på JoVE hjemmeside.
- Der fremstilles en opløsning af fluorescerende mikroperler i DMEM i en koncentration på 10 mio. perler/ml. Perlerne vil blive brugt til at hjælpe med at spore gelforskydninger. For at opnå denne koncentration skal der kombineres 0,017 ml mikroperlebestandsopløsning og 0,149 ml DMEM i et mikrocentrifugerør.
- Sonicate denne suspension i 10 minutter for at sprede perlerne og homogenisere opløsningen.
- Fibrinopløsning — I et 15 ml c-rør blandes 0,22 ml fibrinogenopløsning med 0,44 ml 20 mM HEPES-buffer. Der tilsættes 0,1667 ml DMEM med mikroperler, der er oprettet i trin 3.1.
- Thrombinopløsning — I et separat 15 ml c-rør blandes 0,0328 ml thrombinbestandsopløsning, 0,131 ml 20 mM HEPES-buffer og 0,00246 ml 2 M CaCl2.
- Thrombinopløsningen (trin 3.4) blandes forsigtigt med fibrinogenopløsningen (trin 3.3) ved at pipette op og ned 5-10x, indtil opløsningen er jævnt fordelt. Undgå at indføre bobler så meget som muligt. For at reducere mængden af producerede bobler skal du passe på ikke at aflade pipetten helt under blanding.
- Tilsætning af thrombin vil få opløsningen til at gel hurtigt (~ 30 sek). Den blandede opløsning pipetters så hurtigt som muligt på dækglasset. Lad gelen polymerisere på RT.
- Luk bioreaktoren, sæt varmeblokkene i, og tilslut termoelementerne til temperaturregulatoren. Gelen inkuberes ved 37 °C i 15-30 min.
4. Celle explant forberedelse
- Medium fjernes fra T-75 kolben, der indeholder de menneskelige dermale fibroblasterceller.
- Skyl forsigtigt overfladen med ca. 5 ml fosfatbufferet saltvand (PBS) for at fjerne serumproteiner. Der tilsættes 1 ml trypsin-EDTA og inkuberes i 3 min., eller indtil cellerne er løftet.
- Når cellerne er blevet løftet, drejes suspensionen ned i en centrifuge ved 200 x g i 5 min. Supernatanten fjernes, og pelletpen genbruges i et volumen af DMEM, som vil muliggøre en endelig koncentration på 20 millioner celler/ml.
- Mens cellerne drejer ned i centrifuge afbryde bioreaktoren fra varmeblokke og termoelementer. Overfør bioreaktoren til et biosikkerhedsskab, og fjern forsigtigt låget efter asceptiske teknikker.
- Der skal skabes explants ved at pipetter 0,3 μl af celleaffjedringen på den polymeriserede fibringel efter mønsteret på stencilen. Hver explant skal indeholde ca. 6.000 celler. Sørg for, at der anvendes mikropipettespidser med lavt volumen (0,1-10 μl).
- Lad cellerne sætte sig ned og fastgøres til fibrinmatrixen i 1 time ved 37 °C.
- Når bioreaktoren stadig er åben, tilsættes ca. 5 ml DMEM suppleret med 10% føtalt kvægserum (FBS), 1% penicillin-streptomycin, 0,1% amphotericin B og 10 mg/a mlprotinin direkte ind i bioreaktorkammeret. DMEM er bicarbonat buffered og kræver 5% CO2 for at opretholde en neutral pH. Da bioreaktoren ikke leveres med CO2, konditioneres mediet i en inkubator med 5% CO2 i 2-3 timer før brug. Aprotinin er en serin protease-hæmmer, der i vid udstrækning bruges til at reducere satsen for fibrinforringelse20.
- Reseal bioreaktoren. Brug en sprøjte til at levere yderligere 5 ml CO2-konditioneret medium via pigtrådsbeslaget på indløbsporten. Dispenser mediet langsomt og sørg for, at hele volumenet af bioreaktorkammeret er fyldt. Fjern forsigtigt bobler, der dannes i bioreaktoren.
- Tilfør frisk, 5% CO2 konditioneret medium til bioreaktoren under hele eksperimentet for at opretholde pH, levere næringsstoffer og fjerne affaldsprodukter. Opsæt en sprøjtepumpe med en 10 ml eller 30 ml sprøjte fyldt med 5% CO2 konditioneret medium. Tilslut sprøjten direkte til indløbsporten på bioreaktorlåget med Luer-lock monteret steril slange. Hannbeslaget tages af, og slangen fastgøres til pigtrådsbeslaget på bioreaktoren (se figur 1C).
- Perfusionshastigheden indstilles til 0,01 ml/min. Tilslut modificerede stykker slange til begge udløbsporte, og placer enderne i et 100 ml bægerglas for at indsamle affald.
- Brug et laboratoriestik til at indstille indløbs- og udløbsfeedsenes højder, så der ikke opstår en trykforskel i bioreaktoren (se figur 1D som reference).
- Hvis der ikke findes en bioreaktor, skal prøverne fremstilles i 35 mm petriskåle i glasbunden med glasplader. Brug en med en coverlip størrelse, der er optimeret til det specifikke sæt af mål, der skal anvendes. Prøver, der tilberedes i petriskåle, skal opbevares i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2.
Bemærk: Polystyren afpolariserer lys og vil forstyrre DIC-billeddannelse, så der skal anvendes glasplader, hvis der udføres DIC-billeddannelse. Fasekontrast er en passende alternativ billedmodalitet. Overførsel af retter mellem inkubatoren og mikroskopet vil gøre billedregistrering vanskelig. Hvis billederne ikke er korrekt registreret, vil den stamme, der beregnes i afsnit 6, ikke være nøjagtig.
5. Time-lapse Imaging
- Når prøven er fremstillet, skal du genforstå bioreaktoren, tilslutte varmeblokkene og termoelementerne igen og indstille bioreaktortemperaturen til 37 °C.
- Indstil bioreaktoren på det mikroskopmonterede motoriserede stadie. Placer 20X DIC-målet under visningsporten. Et lavere forstørrelsesmål er acceptabelt, især hvis der ikke findes et præcisionsmotoriseret stadie. Sørg for, at polarisator, analysator og prisme alle er på plads. Alternativt kan eksempler også afbildes ved hjælp af fasekontrast.
- Åbn billedbehandlingssoftwaren.
- Fokuser målet på området mellem de tre explants.
- Gem koordinaterne (x, y og z) for denne placering i billedbehandlingssoftwaren.
- For at afbilde hele området mellem og omkring explants skal du vælge muligheden for at erhverve et stort billede og angive størrelsen på området. Dette vil gøre det muligt at erhverve flere billeder omkring det angivne område og oprette et flisebelagt billede, der repræsenterer et større område af prøven.
- Indstil eksponeringstiden og lysintensiteten til de lavest mulige værdier for at undgå celledød forårsaget af fototoksicitet, samtidig med at der stadig gives tilstrækkelig opløsning til at skelne mellem celler, mikroperler og fibrinfibre.
6. Sporing af belastning
For detaljer og instruktioner om stammesporingssoftwaren (Figur 2), der anvendes, se Raghupathy et al. 21 Algoritmen er en brugerdefineret MATLAB-kode, der kan hentes fra http://www.license.umn.edu/default.aspx. Bemærk, at DIC-billeder ofte har nok tekstur til belastningssporing. Mikroperlerne er inkluderet for at tjene som en kontrol af de beregnede stammefelter. Hvis stammesporing vil blive gjort, er det vigtigt, at de opnåede billeder tages på nøjagtig samme sted, så billederne registreres. Uregistrerede billeder vil producere falske stammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vævs remodeling er en kompleks proces, der til dels drives af gensidige fysiske interaktioner mellem celler og den omgivende matrix. Cellerne reorganiserer de omkringliggende fibre og genererer spændinger i fibernetværket. Tilpasningen af fibre og mekanisk miljø styrer igen celleadfærd, så både celler og matrix globalt reorganiseres for at producere ombygget væv. I dette eksperiment begyndte explanternes celler, oprindeligt runde i morfologi, at strække sig ind i gelen og overholde de fibrinfibre (Figur 3). Cellerne udøvede trækkraftkræfter, der formerede sig gennem gelen og inducerede fiberjustering parallelt med aksen mellem explants. Inden for få timer blev "stropperne" synlige (figur 3A). Stammemålinger viste også, at de største stammer er tværgående på aksen mellem explants (Figur 3D og 3E). Stammerne er højest i denne region, fordi fibrene i denne region frit kan oversættes til aksen.
Denne protokol giver en enkel model for studiet af celle-induceret matrix remodeling og virkningerne af fiber tilpasning på celle adfærd. Brugen af celle explants giver et middel til let at kontrollere den rumlige fordeling af klynger af celler(dvs. explants). Explanterne koncentrerer også cellegenererede kræfter, så fiberjustering hurtigt genereres i et lille område, der let kan afbildes. Højopløsnings flisebilleder af explanterne og det omkringliggende område bruges derefter til at kvantificere matrixomorganisering (Figur 3B og 3C) som reaktion på variationer i eksperimentelle forhold.
Figur 1. (A) Skematisk over en trekantet explant konfiguration på en fibrin gel. (B) En parafilmstencil, der er tapet fast til undersiden af bioreaktorens udsynsport, kan bruges til at styre den eksplante placering. (C) Den samlede bioreaktor er (D) placeret på den præcisionsmotoriserede fase til time-lapse-billeddannelse. En sprøjtepumpe leverer konditioneret medium i et konstant tempo. Et bægerglas samler udstrømningsmediet. Den er placeret i en passende højde for at minimere trykforskelle i bioreaktoren.
Klik her for at se større billede.
Figur 2. Gui for sporing af belastning. Til venstre: Der oprettes et gitter over det område af DIC-billedet, der analyseres. Til højre: Algoritmen, som er baseret på rumlig korrelation, finder pixelforskydningerne mellem billeder, der resulterer i den højeste korrelation (dvs. toppen).
Klik her for at se større billede.
Figur 3. Time-Lapse mikroskopi og strain tracking af Fibrin reorganisering mellem explants. (A) Fiber justering blev observeret mellem explants ved at fange flisebelagte billeder ved hjælp af en 20X DIC mål. Individuelle rammer blev udvundet fra flisebilledet ved (B) t = 0 timer og (C) t = 24 timer for at analysere fiberomorganisering i området mellem cellefudplanter. (D) Konturområderne viser fordelingen af den maksimale hovedbelastning i det område, der svarer til "gjorden".
Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol blev udviklet med det formål at observere og kvantificere de mekanikere, der er involveret i cellemedieret ECM-ombygning. Sådanne processer ligger til grund for en række biologiske fænomener og har stor betydning for vævevæv2,22, hvilket reducerer ar1,23og forstår patologisk vævs remodeling12,24. Brugen af time-lapse DIC mikroskopi giver en mulighed for at løse og kvantificere forskydning og tilpasning af fibrin fibre, der opstår som følge af celle trækkraft kræfter. Den reorganisering, der observeres her, er den første fase af ombygningsprocessen, og den følger de organisatoriske mønstre, der observeres i kollagen11. Reorganisering efterfølges af en kombination af fibrin nedbrydning og ECM syntese. Mens den reorganiserende fase af ombygningen finder sted over et par timer til et par dage, tager den sammenfattende fase af ombygningsprocessen uger at udfolde13. Det her beskrevne system er i stand til at fungere i ugevis, og derfor kan det tilpasses til at overvåge disse senere begivenheder.
Mulige ændringer af denne teknik kan indebære varierende placering, antal og størrelse af explants at skabe forskellige geometrier og observere forskelle i tilpasning mønstre. Explants kan også indlejres i gelen i stedet for på overfladen ved at placere explants mellem fibrin lag. Andre modifikationer kan indebære brug af andre fiberdannende geler i stedet for fibrin, såsom kollagen, eller tilsætning af andre ekstracellulære matrixproteiner, såsom fibronectin eller hyaluronsyre.
Uanset hvilket sæt eksperimentelle variabler der vælges, afhænger eksperimentsucces kritisk af celletilbehør. Derfor er det vigtigt, at man bruger mikroskopet til at kontrollere, at explanterne har fastgjort til geloverfladen, før man tilføjer dyrkningsmedie, da væskeforskydning kan fjerne explanterne fra fibringelen. En anden udfordring, man kan støde på, er at holde cellerne i explant sammen, når pipetter dem på gelen. Hvis dette bliver et problem, kan man ændre trin 4.4, således at cellepillen genbruges i lige store mængder DMEM og friskblandet 0,5 mg/ml rekonstitueret type I-kollagen. Tilføjelse af en fortyndet mængde kollagen kan hjælpe med at holde cellerne i explant sammen. Denne procedure kan sammenlignes med den indlejrede kollagen matricer metode udviklet af Grinnell et al., hvor celle migration og ændringer i kollagen mikrostruktur kan også studeres ved at placere celle-befolkede kollagen geler i acellulære kollagen geler25,26. Det er også meget vigtigt at få fokuserede billeder gennem hele eksperimentet. Det kan være svært at bevare fokus, fordi explanterne bevæger sig nedad, når gelen komprimerer og falder i tykkelse. Som følge heraf vil refokusering være påkrævet, så længe gelen komprimerer. Endelig kan explanterne løsne sig fra gelen under forsøget på grund af overdreven mekanisk spænding27, fibrin nedbrydning eller en kombination af de to. Hvis fibre rive på grund af mekanisk spænding kan man prøve at reducere antallet af celler i en explant og øge koncentrationen af fibrin i gelen. Vi har observeret løsrivelsesproblemer på grund af fibrin nedbrydning omkring explant, der forsvinder, når plasmin hæmmere såsom aprotinin (som brugt her) eller epsilon-aminocaproinsyre (ACA) er inkluderet i mediet.
Vi valgte at bruge DIC som vores billedbehandling modalitet for disse eksperimenter, fordi DIC giver en til at billedet fibre og fiber justering proces over længere tid på en måde, der minimerer celleskader fra eksponering for lys(dvs. fototoksicitet). Fase kontrast imaging kan også bruges, men opløsningen af de enkelte fibre er ringere end DIC. Ingen af disse billeddannelsesmetoder giver imidlertid oplysninger om fiberjustering, der forekommer uden for flyet(dvs. gennem prøvens tykkelse), og derfor bør fortolkningen af dataene tage hensyn til denne begrænsning. Sådanne oplysninger kan indhentes med konfokal mikroskopi, forudsat at potentielle problemer med fototoksicitet behandles ved oprettelsen af eksperimentet. Endelig indeholder DIC-billeder en kontrastgradient(dvs. forskydningsakse), der påvirker synligheden af fibre på en vinkelafhængig måde. Som et resultat vil nogle fiberretninger være lettere at visualisere end andre.
Fremtidige anvendelser af denne teknik kan indebære at observere effekten af grænseforhold, explant-to-explant afstand, og geometri af gel på fiber reorganisering. Billedanalyseteknikker som den belastningssporingsalgoritme, der bruges her, kan bruges til at kvantificere, hvordan hver af disse faktorer bidrager til gelomorganisering og ombygningsprocessen. For eksempel har vi fundet kvantificerbare forskelle i stammefeltet af trekantede explants med faste og frie in-plane grænser28. Denne teknik kan også hjælpe med at dissekere mekanobiologiske veje, der er involveret i cellemigration og vævsombygning, samt hvordan disse processer kan moduleres af forskellige biokemikalier. Disse data kan også bruges som værdifulde input til udvikling af beregningsmodeller og til vurdering af deres prædiktive egenskaber29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker George Giudice og Steven Eliason for at donere menneskelige dermal fibroblaster og Ramesh Raghupathy for hjælp med belastningssporingsalgoritmen. Støtte til dette arbejde blev ydet af en U. S. Department of Education Graduate Assistance i områder af National Need Fellowship (GAANN P200A120071).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sigma-Aldrich | F8630 | ||
| Sigma-Aldrich | T4648 | ||
| Gibco | 11965-092 | ||
| Gibco | 15140-122 | ||
| Sigma-Aldrich | A2942 | ||
| Sigma-Aldrich | H0887 | ||
| Sigma-Aldrich | 223506 | ||
| Gibco | 25200-056 | ||
| Invitrogen | 3000 | ||
| Lonza | DE14-701F | ||
| Molecular Probes | F8858 | ||
| GIBCO | A10483-01 | ||
| GIBCO | 11430-030 | ||
| Fisher-Scientific | SS264-1 | ||
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | ||
| Biotense Bioreactor | ADMET | ||
| Ti-Eclipe Microscope | Nikon | ||
| # 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish | MatTek | P35G-0-20-C | |
| # 0 35 mm Glass Top Petri Dish | MatTek | P35GTOP-0-20-C | |
| Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends | Cole-Parmer | 30600-65 |
References
- Grinnell, F., Petroll WM, Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2001).
- Sander, E. A., Barocas, V. H. Biomimetic collagen tissues: collagenous tissue engineering and other applications. In: Collagen: Structure and Mechanics. , Springer. New York. (2008).
- Pedersen JA,, Swartz MA,
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (3), 1274 (1979).
- Guidry, C., Grinnell, F. Studies on the mechanism of hydrated collagen gel reorganization by human skin fibroblasts. J. Cell. Sci. 79 (1), 67-81 (1985).
- Fluck, J., Querfeld, C., Cremer, A., Niland, S., Krieg, T., Sollberg, S. Normal human primary fibroblasts undergo apoptosis in three-dimensional contractile collagen gels. J. Invest. Dermatol. 110 (2), 153-157 (1998).
- Rosenfeldt, H., Grinnell, F. Fibroblast quiescence and the disruption of ERK signaling in mechanically unloaded collagen matrices. J. Biol. Chem. 275 (5), 3088-3092 (2000).
- Nakagawa, S., Pawelek, P., Grinnell, F. Long-term culture of fibroblasts in contracted collagen gels: Effects on cell growth and biosynthetic activity. J. Invest. Dermatol. 93 (6), 792-798 (1989).
- Harris, A. K., Stopak, D., Wild, P. Fibroblast traction as a mechanism for collagen morphogenesis. Nature. 290, 249-251 (1981).
- Stopak, D., Harris AK, Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction: I. tissue culture observations. Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).
- Sawhney, R. K., Howard, J. Slow local movements of collagen fibers by fibroblasts drive the rapid global self-organization of collagen gels. J. Cell. Biol. 157 (6), 1083-1092 (2002).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys. J. 95 (11), 5374 (2008).
- Sander, E., Barocas, V., Tranquillo, R. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39 (2), 714-729 (2011).
- Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. J. Biomech. Eng. 119, 137-146 (1997).
- Neidert, M. R., Tranquillo, R. T. Tissue-engineered valves with commissural alignment. Tissue Eng. 12 (4), 891-903 (2006).
- Robinson PS,, Robinson PS, Planar biaxial behavior of fibrin-based tissue-engineered heart valve leaflets. Tissue Eng. Part A. 15 (10), 2763-2772 (2009).
- Grassl, E., Oegema, T., Tranquillo, R. Fibrin as an alternative biopolymer to type I collagen for the fabrication of a media equivalent. J. Biomed. Mater. Res. 60 (4), 607-612 (2002).
- Paten, J. A., Zareian, R., Saeidi, N., Melotti, S. A., Ruberti, J. W. Design and performance of an optically accessible, low-volume, mechanobioreactor for long-term study of living constructs. Tissue Eng. Part C Methods. 17 (7), 775-788 (2001).
- Ye KY,, Sulli van KE,, Black LD, Encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3261-3270 (2010).
- Raghupathy, R., Witzenburg, C., Lake, S. P., Sander, E. A., Barocas, V. H. Identification of regional mechanical anisotropy in soft tissue analogs. J. Biomech. Eng. 133, (2011).
- Robinson, P. S., Johnson, S. L., Evans, M. C., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Functional tissue-engineered valves from cell-remodeled fibrin with commissural alignment of cell-produced collagen. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 83-95 (2008).
- Gabbiani, G. The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases. J. Pathol. 200 (4), 500-503 (2003).
- PaszeK, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Grinnell, F., Rocha L, B., Iucu, C., Rhee, S., Jiang, H. Nested collagen matrices: A new model to study migration of human fibroblast populations in three dimensions. Exp. Cell. Res. 312 (1), 86-94 (2006).
- Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices. Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).
- Wakatsuki, T., Kolodney MS,, Zahalak GI,, Elson EL, Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue. Biophys. J. 79 (5), 2353-2368 (2000).
- De Jesus, A., Aghvami, M., Sander, E. Fibroblast-mediated fiber realignment in fibrin gels. ASME Summer Bioengineering Conference, 2013 Jun 26-29, Sunriver, OR, , (2013).
- Aghvami, M., Barocas, V. H., Sander, E. A. Multiscale mechanical simulations of cell compacted collagen gels. J. Biomech. Eng. 135, (2013).
