Abstract
Die Studie des Zentralnervensystems (ZNS) Reifung beruht auf genetischer Ausrichtung der neuronalen Populationen. Allerdings hat die Aufgabe, die Beschränkung der Expression von Genen von Interesse spezifischen neuronalen Subtypen bemerkensanspruchs aufgrund der relativen Knappheit von spezifischen Promotorelemente bewährt. GABAergen Interneuronen bilden einen neuronalen Population mit umfangreichen genetischen und morphologischen Vielfalt. Tatsächlich haben mehr als 11 verschiedene Subtypen von GABAergen Interneuronen in der Maus Kortex 1 gekennzeichnet. Hier präsentieren wir ein angepasstes Protokoll für selektive Ausrichtung der GABAergen Populationen. Wir erreicht Subtyp selektive Ausrichtung von GABAergen Interneuronen mit Hilfe der Enhancer-Element des Homeobox Transkriptionsfaktoren Dlx5 und Dlx6, Homologen des Drosophila-Distal-less (DLL)-Gen 2,3, um die Expression spezifischer Gene durch in utero Elektroporation zu fahren.
Introduction
Der Großteil der kortikalen GABAergen Interneuronen stammen aus zwei transiente embryonale Strukturen nannte die medialen und Schwanzganglien Eminenzen (MGE und CGE jeweils) 4. Parvalbumin und Somatostatin exprimierenden Inter entstehen in der Erwägung, dass MGE Calretinin (Cr), Vasointestinal Peptid (VIP) und Reelin (Re) ausdrückt Inter stammen aus der CGE. Diese Intern Subtypen können durch ihre Geburtsdaten unterschieden werden. MGE abgeleitet Subtypen zwischen embryonalen Tag 9.5 (E9.5) und E16.5 5,6 geboren. Im Gegensatz dazu CGE abgeleitet Inter aus E12.5 E18.5 durch ihre Produktionshöchststand von 6 E15.5 geboren. Die genetische Targeting dieser spät geboren Bevölkerung bleibt jedoch unklar.
Die murinen Distal-less (Dlx) Gene werden ausschließlich in den Entwicklungs ventralen Vorderhirn 3 ausgedrückt. GABAergen Interneuronen und Projektionsneuronen des Striatums, aber nicht Pyramidenzellen der Hirnrinde auszudrücken DLX1, 2,5, und 6 Gene in frühen Entwicklungsstadien 3. Tatsächlich sind die Deluxe, Gene in der MGE und CGE Subventrikularzone (SVZ) in allen GABAergen Vorläuferzellen exprimiert wird. Expression dieser Gene wird eingeschränkt, um Subtypen bei postmitotische Stufen 7-9 wählen. Vorherige experimentelle Beweismaterial zeigte, daß das Dlx5 / 6 Enhancer-Element ermöglicht die selektive Ausrichtung der GABAergen Linien in transgenen Mausmodellen 2. Wir haben die Verwendung von einer dieser Enhancer-Elementen im Rahmen der episomalen Expression in sich entwickelnden Maus-Gehirn. Wir Teil zusammen mit einem Minimalpromotor und dem enhanced green fluorescent protein (eGFP) in einen Bluescript (BS) Backbone-Plasmid (Figur 1) kloniert den Dlx5 / 6-Enhancer-Element. Wir haben das Plasmid durch Elektroporation in utero bei E15.5 selektiv auf Cr-, VIP-und Research-Subtypen 3,8,10. Unsere Technik ermöglicht spärlich Elektroporation, die erleichtertdie Rekonstruktion der morphologischen Merkmale singe Zellen. Darüber hinaus ist die außerordentlich hohe Genexpression in kortikalen GABAergen Neuronen ermöglicht funktionelle Studien. Wir führten Verlust und Gewinn von Funktionsprüfungen mit mehreren Wildtyp und dominant negative Gene 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften und Richtlinien des Institutional Animal Care und Use Committee der New York University School of Medicine behandelt.
Mausstämme
Swiss Webster-Mäuse von weiblichen TACONIC bereitgestellt wurden für diese Experimente verwendet. Um gezielt oberflächliche Schicht Inter wurden E15.5 Embryonen verwendet.
Hinweis: Die in dieser Arbeit (Dlx5 / 6.eGFP Plasmid 3 ug / ul) wurde unter Verwendung von Standardtechniken erzeugt Klonen verwendete Plasmid. Die eGFP-cDNA wurde in einer Dlx5 / 6-Pmin-Poly-A-Plasmid kloniert. Dieses Plasmid ist auf Anfrage erhältlich (demarn02@nyumc.org).
1. Herstellung der Mikroinjektion Pipetten
- Stellen Sie den Abzieher Heat # 2-860.
- Ort und sichern die Glaskapillare in der Nähe des Filaments. Überprüfen Sie, dass der Außendurchmesser (OD) der Pipette ist in etwa 30 um.
- Drücken Sie die Taste "Pull".
- Die Kapillare vorsichtig entfernen. Der untere Teil ist die Nadel. Entsorgen Sie den oberen Teil.
2. Anästhesieverfahren
- Bereiten Sie eine Isofluran enthaltenden Kammer. Hinweis: Isofluran ist die bevorzugte Betäubung, durch die schnelle Wirkung und geringe Inzidenz von Nebenwirkungen. Pentobarbital ist eine weitere Option; jedoch ist die Toleranz dieser Droge variabel und kann auf eine höhere Mortalität als Isofluran führen.
- Stellen Sie den Durchfluss von Isofluran zu 4-5% in 0,5-1 l / min O 2.
- Stellen Sie sicher, dass das Ventil für die Kammer ist offen, während die Ventiladapter für den Kopf ist geschlossen.
- Platzieren Sie die Maus schwanger in der Kammer.
- Lassen Sie die Maus, um unter der Wirkung der Narkose zu gehen. Dies wird etwa 2-3 Minuten dauern. Überprüfen Sie die Atemfrequenz. Wenn die Maus beginnt zu hyperventilieren, senken Sie die Dosis von Isofluran.
- Nachdem die Maus betäubt, umgehend entfernen es aus der Kammer. Legen Sie sie Bauchseite auf dem Heizkissen und ichnsert den Kopf in der Maske, die weiterhin in der gesamten Chirurgie Isofluran versorgen wird. Stellen Sie sicher, um den Fluss von Isofluran aus der Kammer in den Schlauch verbindet den Kopf Adapterstück zu wechseln. Geben Sie einen Tropfen Augen Schmiermittel in jedes Auge und schließen Sie die Augen.
- Stellen Sie das Heizkissen auf 36 ° C Grad zu Unterkühlung zu minimieren.
- Prüfen Sie, ob das Fehlen von Fuß und Schwanz Reflexe durch Kneifen Sie die hinteren Pfoten und den Schwanz.
3. Chirurgie
- Reinigen Sie die Haut, die den Bauch mit 70% Ethanol.
- Verwenden einer Pinzette, um die Haut nach oben ziehen. Nach jeder Operation, waschen alle Instrumente mit Reinigungsmittel und Wasser, und bei 72 ° CO / N sterilisiert.
- Einen kleinen vertikalen Einschnitt (ca. 2 cm) entlang der Mittellinie ausgehend mittig zwischen der dritten und vierten Paare von Brustdrüsen. Verwenden Sie Fein Chirurgie Schere. Achten Sie auf die Bauchwand nicht beschädigen.
- Trennen die Haut sanft von dem Bauchfell.
- Visualisieren Sie die Arterienund Venen an der Bauchwand. Machen Sie eine weitere 2 cm vertikalen Schnitt durch die Bauchfell (Vermeidung der Gefäße), um die Bauchhöhle aus.
- Klemmen Sie die Haut und Bauchwand auf jeder Seite die Vermeidung von Einklemmen der Arterien. Hinweis: Wenn die Arterien versehentlich punktiert, opfern das Tier sofort, indem Genickbruch oder Isofluran Überdosis.
- Vor erwärmen die sterile PBS auf 37 ° C. Decken Sie die Klemmen mit PBS feucht Kim wischt.
- Befeuchten die freiliegenden Bauchhöhle mit PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt mehrmals während der Durchführung der Operation.
- Verwendung von Rundzangen, ziehen Sie den embryonalen Kette (E15.5) weg von der Kavität. Lassen Sie die Kette auf den Rest Feuchttücher. Starten, indem die eine Hälfte der Gebärmutter zuerst. Sobald die Embryonen in ihr elektroporiert werden, bringen sie zurück nach innen, dann auf der zweiten Hälfte zu arbeiten.
4. Elektroporation
- Weiter Rundzange verwenden, um die Embryonen zu manipulieren.
- Visualize die lateralen Ventrikel. Die lateralen Ventrikel entlang der Mittellinie (Abbildung 1b) laufen.
- Hinzufügen Fast Green (Lager: 10% w / v) zu der DNA-Lösung 1:20 Mischung, um sie während der Injektion zu visualisieren. Bereiten Sie die DNA-Lösung durch Auflösen der aus einem Standard-Maxi-Prep-Reinigungsprotokoll in destilliertem Wasser erhaltenen Pellets.
- Verwenden Sie vor gezogen Mikropipetten mit einem Stempel zu injizieren 1 ml DNA-Lösung (Dlx5 / 6-eGFP, 3 ug / ul) mit Fast Green. Schneiden Sie die Spitze der Mikropipette mit einer feinen Pinzette # 5 (Dumont) bis 6 mm Länge vom Anfang der Schulter bis zum Ende der Spitze der Nadel zu verlassen, bevor das Laden der Pipette. Halten Sie den Kopf des Embryos mit runden Pinzette. In das Gehirn mit der Pipette in einem 45 ° Winkel mit dem Ziel für den lateralen Ventrikel in der Nähe der Mittellinie angeordnet ist. Wenn die Nadel durch die Herzkammer dringt, langsam zurückziehen der Pipette, wie Sie den Kolben verwenden, um DNA zu injizieren. Der Ventrikel wird grün, wenn dieLösung beginnt, es zu füllen. An diesem Punkt nicht mehr bewegen die Pipette und spritzen 1 ml DNA. Sanft, ziehen Sie die Pipette.
- Stellen Sie die CUY21 Elektroporator zu fünf 45V Impulse von 50 ms von 950 msec Abstand.
- Verwenden Sie 5 mm Paddelelektroden für E15.5 Embryonen. Tauchen Sie die Elektroden in PBS, um eine effiziente Stromübertragung zu gewährleisten.
- Platzieren Sie die Elektrode Paddel um den Kopf des Embryos mit der positiven Paddel auf der Herzkammer, die die DNA-Lösung. Leicht senken die positive Paddel mit Bezug auf die negative, eine ventrale Strom durch die Ganglien Eminenzen erstellen. Diese Manipulation wird ektopische Expression in Pyramidenzellen zu minimieren.
- Nach der Platzierung der Elektroden, liefern einen Impuls, indem Sie das Fußpedal einmal.
- Entfernen Sie die Elektroden und wischen Sie sie sauber. Wiederholen Sie die Schritte 4,6-4,9 mit jedem Embryo.
- Nach Elektroporation alle Embryonen, pour 3 ml PBS in die Bauchhöhle und bringt sie in die Bauchhöhle.
- Erste Naht der Bauchwand mit einer gebogenen Nadel und 5-0 Seidennaht und dann die Haut. Anwenden Lidocain (4%) auf die Wunde. Verwalten 120 mg / kg Aspirin inner Peritoneum zur Analgesie.
Hinweis: Das gesamte Verfahren sollte in 20 min oder weniger durchgeführt werden. Es ist ratsam, dass Anfänger nur elektroporieren einige Embryonen, um die Betriebszeit kurz zu halten. Längerer Operationen wird die Überlebensrate der Embryonen zu verringern. - Nehmen Sie das Tier aus der Narkose Schläuche und eine Wiederherstellung auf dem Heizkissen auf einem Papier zu wischen.
- Zurück Tier in den Käfig, halten Sie es auf dem Heizkissen bei 37 ° C und den Gesundheitszustand überwachen. Die Tiere in der Regel gut vertragen und die Operation beginnen sich langsam zu bewegen, kurz nachdem sie aus der Narkose Schlauch entfernt werden. Wenn übermäßige Blutungen oder Lethargie beobachtet wird, zu opfern das Tier sofort, indem IACUC genehmigt Euthanasie Verfahren wie Genickbruch oder Anästhesie Überdosis.
- Zurück zu dem Käfig vivarium. Die Weibchen werden Geburt natürlich geben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wir passten die in utero Elektroporation Technik, um Zelltyp-spezifische Ausrichtung der Reifung Neuronen zu erreichen. Um die Expression von eGFP in CGE-abgeleitete Inter zu fahren, haben wir die Dlx5 / 6 Enhancer-Element und beschränkt unsere Injektionen E15.5, die Bühne, wenn die Mehrheit der CGE-abgeleitete Inter erzeugt. Wir führten die Analyse auf P8 und P15 11 (Abbildungen 1 und 2). Wir bestätigten die ventrale Ursprung elektroporiert Neuronen durch Co Elektroporation eine CAG-mCherry und eine Dlx5 / 6-eGFP Plasmide in äquimolaren Konzentrationen an E15.5. In diesem Experiment beobachteten wir, dass nur ventralen Vorläuferzellen in der Subventrikularzone (SVZ) Co befindet ausgedrückt beide Proteine 11. Diese räumlich zeitliche Expression von fluoreszierenden Proteinen mit dem normalen Entwicklungs Expression des Dlx5 und 6 Gene, die in der ventrikulären aber subventr exprimiert werden einstimmticular Zone 4. Ferner beurteilten wir die Identität der GABAergen Dlx5 / 6-mCherry elektroporiert Inter in einem GAD67-eGFP Knockin Mauslinie. Wir haben festgestellt, dass die große Mehrheit der Elektroporation Neuronen exprimiert GAD67, ein Enzym von allen GABAergen Zellen 11 ausgedrückt. Zusätzlich bestimmten wir die Identität der Untertyp elektroporiert Inter indem Immunhistochemie und elektrophysiologische Analyse auf P15. Das Muster der Expression von spezifischen Markern Subtyp wurde durch Immunfluoreszenz in Kryostatschnitten 11 (Figur 2) zeigte. Wir fanden, dass bei Inter E15.5 elektroporiert fast ausschließlich Ausdruck NPY, Reelin, VIP-und Cr, zuvor beschriebenen CGE-Marker abgeleitet Intern 6. Darüber hinaus sind die intrinsischen elektrophysiologischen Eigenschaften dieser Neurone im Einvernehmen mit dem zuvor in Studien Schicksal Mapping 6,11 beschrieben. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass electroporation mit der Dlx5 / 6 Enhancer-Element bei E15.5 selektiv auf CGE-Interneuron-Subtypen abgeleitet.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Experimente Elektroporation. a) Subklonierung Strategie für die Dlx5 / 6-eGFP Plasmid. b) Schematische Darstellung des experimentellen Strategie.
Abbildung 2. Elektroporierte Inter werden durch die Expression von CGE-Subtyp abgeleitet Markierungen abgegrenzt. A) CGE-abgeleitete Inter mit einem Dlx5 / 6-eGFP Plasmid elektroporiert. Beachten Sie die spärlich Elektroporation von verschiedenen Subtypen CGE. B) eine VIP-exprimierenden Intern auf P8. eGFP-Expression umreißt diegesamten dendritischen Baum und axonalen Laube von einzelnen Neuronen. C) Ein NPY-exprimierenden Intern auf P8. NPY Ausdruck umreißt neurogliaform Zellen. D) eine NPY-exprimierenden Intern auf P15. Maßstab A, 100 mm; BD, 50 mm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Grenzen der Technik
Während diese Technik ermöglicht Zelle autonom Analyse von Zellprozessen, ist es nicht geeignet für die Populationsanalyse. Die Elektroporationen sind sehr spärlich mit weniger als tausend Zellen elektroporiert pro Gehirn. Als Folge kann die Technik nicht verwendet werden, um Verhaltenskonsequenzen durch die genetische Manipulation von CGE abgeleiteten Inter bewerten.
Während Elektroporationen durchgeführt bei E13.5 E14.5-Ziel MGE-Subtypen abgeleitet, ist der Wirkungsgrad gering 10. Wir vermuten, dass die Dlx5 / 6 Verstärker zumindest in Zusammenhang mit episomalen Expression in postmitotischen MGE Subtypen weniger aktiv.
Bedeutung gegenüber den bestehenden Methoden
Die Technik stellt Weiterentwicklung von vorher Elektroporationsverfahren 12,13 für die Untersuchung von Inter. Aufgrund ihrer relativen Knappheit und ventralen Embryonic Herkunft, hat sich diese Population von Neuronen schwer zu zielen bewährt. Unsere Technik bietet die Möglichkeit zur Durchführung von zellautonome Analyse der CGE-abgeleitete Inter. Die hohen eGFP-Expression ermöglichen die Visualisierung und Analyse von einzelnen Inter.
Zukünftige Anwendungen
Durch die Kombination der Verwendung von spezifischen Plasmide und genetisch veränderte Mauslinien ist es möglich, zeitliche und räumliche Steuerung der Expression von Genen von Interesse zu erreichen. Zum Beispiel haben wir eine Dlx5 / 6-Tta Plasmid auf der induzierbaren Expression von Transgenen tetO drehen. Bei diesen Experimenten konnten wir die Transgen-Expression durch Verabreichung von Doxycyclin 8 abzustellen. Wir entwickeln derzeit ein Protokoll, um die Technik in Kombination mit der Creer System zu verwenden.
Kritischen Schritte im Protokoll
Um eine effiziente Elektroporation und das Überleben zu erreichen, versuchen Sie zu vermeiden excessive Manipulation der Embryos und / oder Organe. Darüber hinaus vermeiden Kneifen Arterien und Venen. Die Maus wird schnell hypovolämischen werden, wenn Blutungen auftreten. Nach der Elektroporation abgeschlossen ist, legen Sie die Embryonen und Organe in den gleichen Positionen, wo man sie gefunden zu schaffen, die Knicke Hypoxie führen könnten, zu vermeiden. Ziel für 20 Minuten oder weniger OP-Zeit. Befeuchten die Bauchhöhle mit PBS mehrmals während der Operation. Während der Elektroporation, versuchen, die Ventrikel nur einmal mit der Kapillare Punktion. Wiederholende Punk wird die Überlebensrate zu verringern. Nach der Ausbildungszeit, sollte die Überlebensrate von 80% oder höher sein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir sind dankbar, dass Lihong Yin für technische Unterstützung. NVD ist ein Empfänger einer NARSAD Young Investigator Award und wird auch durch Zuschüsse aus NIH (5 K99 MH095825-02) unterstützt. Forschung im Labor Fishell wird durch das National Institute of Health, National Institute of Mental Health (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (5 R01 NS081297-02 unterstützt, 1 P01 NS074972 -01A1) und der Simons Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5 mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis. J Neurosci. 23, 167-174 (2003).
- Eisenstat, D. D., et al. DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).
- Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors. J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).
- Bulfone, A., et al. The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos. Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).
- Bulfone, A., et al. Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries. J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).
- Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain. The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).
- Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472, 351-355 (2011).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239 (2007).
