Abstract
O estudo do sistema nervoso (CNS) central de maturação depende de orientação genética de populações neuronais. No entanto, a tarefa de restringir a expressão de genes de interesse para os subtipos neuronais específicos provou extremamente difícil devido à escassez relativa de elementos promotores específicos. Interneurônios GABAérgicos constituem uma população neuronal com ampla diversidade genética e morfológica. De facto, mais de 11 subtipos diferentes de interneurónios sensíveis a GABA têm sido caracterizadas no córtex do rato 1. Aqui apresentamos um protocolo adaptado para direcionamento seletivo das populações GABAérgicos. Conseguimos subtipo direccionamento selectivo de interneurónios sensíveis a GABA, utilizando o elemento potenciador da transcrição homeobox factores Dlx5 e DLX6, os homólogos da distal inferior (Dll) do gene de Drosophila 2,3, para dirigir a expressão de genes específicos dentro do útero por meio de electroporação.
Introduction
A maior parte dos interneurônios GABAérgicos corticais originam de duas estruturas embrionárias transitórias nomeadas as eminências ganglionares média e caudal (MGE e CGE respectivamente) 4. Parvalbumin e somatostatina expressar interneurônios origem no MGE enquanto Calretinina (Cr), Vasointestinal peptídeo (VIP) e Reelin (Re) expressando interneurônios originam do CGE. Estes subtipos Interneuron podem ser distinguidos pelas suas datas de nascimento. MGE subtipos derivados nascem entre o dia embrionário 9.5 (E9.5) e E16.5 5,6. Em contraste, interneurônios CGE derivados nascem E12.5 através E18.5 com sua produção atingindo um máximo de 6 E15.5. A orientação genética dessa população tarde nascido, no entanto, permanece indefinida.
Os (Dlx) genes distal-less murino são exclusivamente expressos no cérebro anterior ventral desenvolvimento 3. Interneurônios GABAérgicos e neurônios de projeção do estriado, mas não células piramidais corticais expressar Dlx1, 2,5, e 6 genes em estágios iniciais de desenvolvimento 3. De facto, os genes são expressos Dlx na zona MGE e CGE subventricular (SVZ), em todas as células progenitoras GABAérgicos. Expressão desses genes se torna restrita a seleccionar subtipos em fases pós-mitóticas 7-9. Evidências experimentais anteriores mostraram que o elemento potenciador Dlx5 / 6 permite o direcionamento seletivo de linhagens GABAérgicas em modelos de camundongos transgênicos 2. Foi testada a utilização de um destes elementos potenciadores no contexto da expressão episómico no cérebro do rato em desenvolvimento. Nós sub clonado o elemento potenciador Dlx5 / 6 em conjunto com um promotor mínimo e a proteína verde fluorescente melhorada (EGFP) no Bluescript (BS) plasmídeo de esqueleto (Figura 1). Nós introduzimos o plasmídeo por meio de in utero eletroporação em E15.5 para alvejar seletivamente Cr-, VIP e Re subtipos 3,8,10. A nossa técnica permite electroporação escasso, o que facilitaa reconstrução das características morfológicas de células singe. Além disso, os níveis excepcionalmente elevados de expressão de genes em neurónios GABAérgicos corticais permite estudos funcionais. Realizou-se a perda eo ganho de estudos da função utilizando vários tipo selvagem e genes dominantes negativos 11.
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Protocol
Todos os animais foram tratados de acordo com as normas e diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso da NYU School of Medicine animal Institucional.
Rato Cepas
Swiss Webster ratinhos fêmeas fornecidos por TACONIC Foram utilizados para estas experiências. A fim de orientar especificamente interneurônios camada superficial, foram utilizados embriões E15.5.
Nota: O plasmídeo utilizado no presente trabalho (Dlx5 / 6.eGFP plasmídeo 3 mg / mL) foi gerado utilizando técnicas de clonagem convencionais. O eGFP cDNA foi clonado num Dlx5 / 6-Pmin-poliA plasmídeo. Este plasmídeo está disponível mediante solicitação (demarn02@nyumc.org).
1 Preparação de microinjeção pipetas
- Defina o extrator de calor # 2-860.
- Colocar e fixar o capilar de vidro perto do filamento. Verificar que o diâmetro externo (OD) da pipeta é cerca de 30 um.
- Pressione o botão "puxar".
- Retire cuidadosamente o capilar. A parte inferior é a agulha. Descartar a parte superior.
2 Anestesia Procedimento
- Prepare uma câmara contendo isoflurano. Nota: O isoflurano é o anestésico preferido devido a sua ação rápida e baixa incidência de efeitos colaterais. Pentobarbital é outra opção; No entanto, a tolerância deste fármaco é variável e pode levar a uma taxa de mortalidade maior do que o isoflurano.
- Definir o fluxo de isoflurano a 4-5% em 0,5-1 L / min O 2.
- Certifique-se de que a válvula para a câmara é aberta enquanto que a válvula para a placa de cabeça está fechado.
- Posicione o mouse grávida na câmara.
- Deixe o mouse para ir sob o efeito da anestesia. Isso levará cerca de 2-3 min. Verifique a taxa de respiração. Se o rato começa a hiperventilar, reduzir a dose de isoflurano.
- Após o mouse está anestesiado, imediatamente removê-lo da câmara. Coloque-o lado ventral em cima da almofada de aquecimento e iNSERT a cabeça na máscara que continuará a fornecer isoflurano durante toda a cirurgia. Certifique-se de mudar o fluxo de isoflurano da câmara para a mangueira que liga a peça adaptador cabeça. Coloque uma gota de lubrificante ocular em cada olho e fechar os olhos.
- Ajuste a almofada de aquecimento a 36 ° C graus para minimizar hipotermia.
- Verificar a ausência de pé e cauda reflexos, beliscar as patas traseiras ea cauda.
3. Cirurgia
- Limpe a pele que cobre o abdômen com etanol 70%.
- Use uma pinça para puxar a pele para cima. Após as cirurgias, lavar todos os instrumentos com detergente e água, e esterilizou-se a 72 ° CO / N.
- Fazer uma pequena incisão vertical (cerca de 2 cm) ao longo da linha média de partida a meio caminho entre o terceiro e quarto pares de glândulas mamarias. Use a tesoura cirurgia finas. Tome cuidado para não danificar a parede abdominal.
- Separe cuidadosamente a pele do peritônio.
- Visualize as artériase nervuras na parede abdominal. Adicione outro dois centímetros incisão vertical através do peritoneu (evitando os vasos) para expor a cavidade abdominal.
- Prenda a pele ea parede abdominal de cada lado evitando pinçamento das artérias. Nota: Se as artérias são acidentalmente perfurada, sacrificar o animal imediatamente ao realizar deslocamento cervical ou overdose isoflurano.
- Pré aqueça o PBS estéril a 37 ° C. Cubra os grampos com PBS úmidos Kim toalhetes.
- Hidratar a cavidade abdominal exposta com PBS. Repita este passo várias vezes durante a realização da cirurgia.
- Utilizando uma pinça redondas, puxe a cadeia embrionárias (E15.5) fora da cavidade. Deixe o resto da cadeia sobre os lenços umedecidos. Iniciar expondo metade do útero primeiro. Uma vez que os embriões em que são electroporados, trazê-lo de volta para dentro, em seguida, trabalhar no segundo semestre.
4. Eletroporação
- Continue a usar fórceps redondas para manipular os embriões.
- Visualize os ventrículos laterais. Os ventrículos laterais correm ao longo da linha média (Figura 1b).
- Adicionar Verde Rápido (Banco: 10% w / v) à solução de DNA de uma mistura 01:20 de visualizar que durante a injecção. Preparar a solução de DNA através da dissolução do sedimento obtido a partir de um protocolo padrão de purificação de maxi-prep em água destilada.
- Utilize micropipetas pré puxados com um êmbolo para injetar 1 ml da solução de DNA (Dlx5 / 6-EGFP, 3 mg / mL) com Fast Green. Cortar a ponta da micropipeta com uma pinça fina # 5 (Dumont) para deixar 6 mm de comprimento a partir do início do ombro até ao final da ponta da agulha antes de colocar a pipeta. Segure a cabeça do embrião com uma pinça redondas. Entram no cérebro com a pipeta com um ângulo de 45 ° com vista para o ventrículo lateral, localizado perto da linha média. Se a agulha penetra através do ventrículo, retirar lentamente a pipeta como você usa o êmbolo para injetar DNA. O ventrículo deve ficar verde quando osolução começa a preenchê-lo. Neste ponto, param de se mover a pipeta e injectar 1 ml de ADN. Delicadamente, retire a pipeta.
- Defina o electroporator CUY21 cinco 45V pulsos de 50 ms espaçadas de 950 ms.
- Use 5 milímetros eletrodos de remo para os embriões E15.5. Mergulhe os eletrodos em PBS para garantir a transmissão de corrente eficiente.
- Coloque as pás de eléctrodos em volta da cabeça do embrião com a pá positivo sobre o ventrículo contendo a solução de ADN. Ligeiramente inferior a pá positiva com relação à negativa para criar uma corrente ventral através das eminências ganglionares. Esta manipulação irá minimizar a expressão ectópica de células piramidais.
- Após a colocação dos eletrodos, entregar um pulso, pressionando o pedal uma vez.
- Retirar os eletrodos e limpe-os. Repita os passos de 4,6-4,9 com cada embrião.
- Após electroporating todos os embriões, derrame 3 ml de PBS para dentro da cavidade abdominal e devolvê-las para a cavidade abdominal.
- Primeiro sutura da parede abdominal com uma agulha curva e sutura de seda 5-0 e, em seguida, a pele. Aplicar lidocaína (4%) na ferida. Administrar 120 mg / kg de aspirina peritônio intra para analgesia.
Nota: O procedimento completo deve ser realizado em 20 minutos ou menos. É aconselhável que os novatos só electroporate alguns embriões para manter o tempo de funcionamento curto. Cirurgias prolongadas vai diminuir a taxa de sobrevivência dos embriões. - Remover o animal da tubulação de anestesia e permitir a recuperação da almofada de aquecimento em um papel wipe.
- Voltar animais para a jaula, mantê-lo no bloco de aquecimento a 37 ° C e monitorar o estado de saúde. Os animais geralmente toleram bem a cirurgia e começam a mover-se lentamente, logo depois de terem sido removidos do tubo anestesia. Se o sangramento ou letargia excessiva é observada, sacrificar o animal imediatamente realizando IACUC aprovado procedimentos de eutanásia, como a luxação cervical ou anestesia overdose.
- Voltar gaiola para o vivarium. As fêmeas dão à luz naturalmente.
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Representative Results
Nós adaptamos a técnica de eletroporação in utero para atingir alvos específicos tipo de célula de neurônios vencimento. Para dirigir a expressão de GFP em interneurônios CGE derivados, foi utilizado o elemento potenciador Dlx5 / 6 e restrito nossas injeções para E15.5, a fase em que a maioria dos interneurônios CGE derivados são gerados. Realizou-se a análise em P8 e P15 11 (Figuras 1 e 2). Foi confirmada a origem ventral de neurônios eletroporados por co electroporating um CAG-mCherry e um Dlx5 plasmídeos / 6-EGFP em concentrações equimolares em E15.5. Neste experimento, observou-se que apenas progenitores ventrais localizados na zona subventricular (SVZ) co expressa ambas as proteínas 11. Esta expressão espaciais de proteínas fluorescentes coincide com a expressão normal de desenvolvimento da Dlx5 e seis genes, que não são expressos no ventrículo mas subventrzona icular 4. Além disso, avaliou-se a identidade de interneurônios GABAérgicos Dlx5 / 6 mCherry eletroporados em uma linha batendo rato GAD67-EGFP. Verificou-se que a grande maioria dos neurónios electroporadas expressa GAD67, uma enzima expressa por todas as células sensíveis a GABA 11. Além disso, determinou-se o subtipo identidade de interneurônios eletroporados através da realização de imunohistoquímica e análise eletrofisiológica em P15. O padrão de expressão de marcadores específicos do subtipo foi revelada por imunofluorescência em secções criostáticas 11 (Figura 2). Descobrimos que interneurônios eletroporados em E15.5 expressar quase exclusivamente NPY, Reelin, VIP e Cr, anteriormente descrito marcadores interneuron CGE derivados 6. Além disso, as propriedades eletrofisiológicas intrínsecas desses neurônios estão de acordo com o anteriormente descrito em estudos de mapeamento destino 6,11. Todos juntos, estes resultados indicam que electroporação com o Dlx5 / 6 elemento potenciador em E15.5 alvejar seletivamente subtipos interneuron CGE derivados.
Figura 1 representação esquemática dos experimentos de electroporação. a) estratégia Subclonagem para o Dlx5 / 6-EGFP plasmídeo. b) Diagrama ilustrando a estratégia experimental.
Figura 2. electroporados interneurónios são delineadas pela expressão de marcadores de subtipos CGE-derivados. A) derivado de interneurónios CGE electroporadas com um Dlx5 / 6-eGFP plasmídeo. Note-se a electroporação de diversos subtipos esparso CGE. B) A-expressando VIP interneurónio a P8. eGFP delineia a expressãotoda árvore dendrítica e axonal caramanchão de neurônios individuais. C) Um interneuron expressando NPY em P8. Expressão do NPY delineia células neurogliaform. D) Uma interneuron expressando NPY no P15. A barra de escala, com 100 mm; BD, 50 milímetros
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Discussion
Limitações da técnica
Embora esta técnica permite a célula de análise autônoma de processos celulares, não é adequado para análise da população. Os electroporations são muito escassos com menos de mil células eletroporados por cérebro. Como consequência, a técnica não pode ser utilizada para avaliar as consequências comportamentais resultantes da manipulação genética de interneurónios CGE-derivados.
Enquanto electroporações realizadas em subtipos alvo E13.5 E14.5-MGE-derivados, a eficiência é baixo 10. Especulamos que a Dlx5 / 6 potenciador é menos activo em subtipos MGE pós-mitóticas, pelo menos no contexto de expressão episómico.
Significativas relativamente aos métodos existentes
A técnica representa avanço de métodos anteriormente eletroporação 12,13 para o estudo de interneurônios. Devido à sua relativa escassez e embrião ventralorigem nic, esta população de neurônios tem sido difícil de atingir. Nossa técnica fornece os meios para realizar análise de células-autônoma de interneurônios CGE derivados. Os elevados níveis de expressão eGFP permitir a visualização e análise de interneurónios individuais.
Aplicações Futuras
Através da combinação da utilização de plasmídeos e as linhas específicas de rato geneticamente modificados, é possível alcançar o controlo temporal e espacial da expressão de genes de interesse. Por exemplo, usamos um Dlx5 / 6 Tta plasmídeo para ligar a expressão de transgenes tetO induzíveis. Nesses experimentos, nós fomos capazes de silenciar a expressão do transgene por meio da administração de doxiciclina 8. Estamos actualmente a desenvolver um protocolo para usar a técnica em combinação com o sistema de creer.
Passos críticos dentro do Protocolo
Para alcançar eletroporação eficiente e sobrevivência, para tentar evitar excessive manipulação dos embriões e / ou órgãos. Além disso, evitar artérias e veias beliscar. O rato vai rapidamente tornar-se hipovolêmico se ocorrer sangramento. Após a eletroporação é concluída, coloque os embriões e órgãos nas mesmas posições onde você os encontrou, para evitar a criação de torções que podem causar hipóxia. Apontar para 20 minutos ou menos tempo de cirurgia. Hidratar a cavidade abdominal com PBS várias vezes durante a cirurgia. Durante a electroporação, tentar perfurar o ventrículo apenas uma vez com a agulha capilar. Punção repetitivo diminuirá a taxa de sobrevivência. Após o período de formação, a taxa de sobrevivência deve ser de 80% ou superior.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Somos gratos a Lihong Yin para assistência técnica. NVD é um destinatário de um NARSAD Young Investigator Award e também é apoiada por doações da NIH (5 K99 MH095825-02). Pesquisa no laboratório Fishell é apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde, Instituto Nacional de Saúde Mental (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) e da Fundação Simons.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5 mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
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