Protocol
Все животные процедуры, описанные в данном протоколе были проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUCs) на Мемориал Слоан-Кеттеринг онкологический центр на.
1. Аспирации костного мозга (КМ) Клетки из бедренной кости
- Обезболить мышь, которая будет проходить бедренной стремление костного мозга изофлураном (1-4%), которой вводили прецизионного испарителем. Глубину анестезии следует контролировать каждые 5-10 мин в течение всей процедуры, заметив, что нет никаких изменений в частоте дыхания, связанного с хирургического вмешательства и / или уха, пальца, а хвостовой шнура. Анестезия индуцируется изофлураном а также поддерживается на протяжении всей процедуры изофлураном. Упреждающий предварительно процессуальное доза бупренорфина в дозе 0,05-0,1 мг / кг подкожно каждые 6-12 ч может быть использован для предотвращения боли, связанные с процедурой как прилАгентства ООН в Carprofen.
- Применить глазной мази для глаз мыши следующей вводного наркоза для предотвращения роговицы сушки.
- Мех тщательно вырезанные из области кожи около 150% больше, чем площадь предполагаемого аспирации сайте. Свободные мех удаляется влажной марлевой салфеткой. Пожалуйста, держать мышь на циркулирующей теплой подушки воды или другого безопасного термостатом поверхности, чтобы предотвратить переохлаждение во время процедуры.
- Лечить всю ногу, содержащий бедренную кость, которая будет проходить стремление с тремя наборами чередующихся скрабы (переменный или с повидон-йодом (Betadine) или хлоргексидином (Nolvasan) скраб и 70% изопропилового спирта или 70% этанола всасывается марлевые тампоны).
- Влажный 0,5 мл туберкулина шприц (объем: 0,5 CC; Калибр: 27,5 г) со стерильным фосфатно-солевом буфере (PBS) перед аспирации BM. Заполните шприц с 200-500 мкл PBS и немедленно изгнать PBS. Повторите эту процедуру 2-3 тРедакторы IME.
- Держите голени согнуты из бедренной кости, нажав на голени или с безымянного пальца или пятого пальца. Убедитесь, что подходит анестетик самолет была достигнута. Шприц держат используя большой палец и указательный палец. Это позволяет мыщелков быть подвержены и облегчает введение иглы.
- После смачивания шприц, вставить иглу через связки надколенника, чтобы игла подал надежно между двумя мыщелков бедренной кости. Путем проведения диафизе близко к эпифиза бедренной кости с большим пальцем и указательным пальцем, игла вставлена в бедренной кости легко.
- Поворотный иглу наружу и вверх так, чтобы он был параллелен валу бедренной кости. Это действие облегчает поиск содержимого костного мозга с бедренной вала.
- Поверните иглу по часовой стрелке и против часовой стрелки, нажимая на него медленно в бедренную полости мозга. Подтвердите правильное позиционирование иглы, осторожно перемещая сиRINGE боков.
- Осторожно потяните иглы поршень назад, создавая отрицательное давление, при перемещении иглы назад и вперед внутри полости BM. Примечание: Объем BM придыхательных будет примерно 5 мкл который обычно соответствует 0,4-0,8 х 10 6 мононуклеаров. Успешное стремление будет подтверждена визуально по внешнему виду крови в верхней части иглы в базе шприца. Если кровь не видно в шприце вполне вероятно, что небольшая кость или ткани фрагмент застрял в иглу. Это может быть удалена из иглы, перемещая поршень вверх и вниз в PBS (это одна из причин, почему шприц должен быть предварительно заполнен PBS до аспирации BM). Если ткань не может быть выбит из шприца, используйте новую иглу и шприц (снова смачивать шприц с 200-500 мкл PBS).
- После того, как Б.М. успешно отсасывают из бедренной кости, извлеките иглу и шприц из бедренной кости и мыши.
- Перемещение атмосферный BM к пробирке пр.efilled с 500 мкл PBS. Для большинства приложений, клетки BM затем следует хранить на льду до дальнейшей обработки, если это возможно.
- После завершения процедуры, управлять анальгетик с карпрофена 5 мг / кг подкожно. Затем снимите мышь от наркоза и поместить на нагретую площадку до полного восстановления. ПРИМЕЧАНИЕ: Там не должно быть никаких осложнений или теснота испытали в соответствии с процедурой аспирации если все сделано правильно.
- Перед возвращением мышей в области жилищного строительства, чтобы они в состоянии передвигаться и достичь пищу и воду. Соблюдайте мышей на наличие признаков бедствия или процедуры инфекция сообщению в следующем 24 часов. Симптомы включают в себя: постоянной кровотечения, анемия, вялость. Если какие-либо из этих признаков видны сообщению процедуру, животное (ы) должны быть умерщвлены. Примечание: BM стремление / отбора проб может быть повторен, но процедура повтор должна быть выполнена на противоположной бедренной кости, чтобы предотвратить повторное травму той же ноги. Существует мало информации относительно фрequency, что БМ стремление может быть выполнена. Бедренной стремление костного мозга как правило, не повторяются не чаще, чем раз в 2 недели.
2. Оценка Cellular Материалы в засос BM клеток
- Гранул клетки, извлеченные из БМ аспирации и место в пробирке путем центрифугирования при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С или комнатной температуры.
- Аспирируйте супернатант и затем ресуспендируют осадок в 500 мкл ACK красных кровяных буфера для лизиса клеток (лизирующего буфера "аммоний-хлорида калия»).
- Инкубируйте клетки в красной буфера для лизиса клеток в течение 10 мин, а затем добавить 1 мл PBS и спином вниз смесь снова при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С или комнатной температуры. Примечание: красных кровяных клеток лизируют гранул в настоящее время состоит из БМ мононуклеаров. Они могут быть ресуспендировали для FACS окрашивания, подсчета клеток, трансплантации, анализа Cytospin и / или любого другого использования (так же, как BM клетки, собранные из жертвенных мышей будет использоваться).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Бедренной БМ стремление живого C57/B6 мыши была использована для получения мононуклеарных клеток BM следуют обычным урожая BM того же мыши после жертвоприношения. BM мононуклеарные клетки, полученные обоими методами затем анализировали (1) цитологического анализа BM клеток, (2) определения относительной частоты гемопоэтических стволовых клеток / клеток-предшественников (HSPCs) и (3) экс виво культура отсортированных HSPCs. В последнем эксперименте, Lineage-отрицательных СЦА1 + C-KIT + (LSK) клетки были классифицированы от мононуклеарных клеток, полученных путем аспирации BM, а также от обычного урожая BM. 150 LSK клетки, полученные по каждому методу затем высевали в метилцеллюлозы полутвердых сред, содержащих миелоидных-эритроидных цитокинов в течение 7 дней в техническом экземплярах. Данные, приведенные на рисунке 1 A, B показывает, что подобные типы и пропорции сыпучих клеток и HSPCs были замечены морфологических и анализа проточной цитометрии с использованием либо бедренной BM стремление или обычное урожай BM.
Для того, чтобы количественно определить процент LSK и миелоидных клеток-предшественников видно с обычным урожаем костного мозга бедренной кости по сравнению с аспирации костного мозга, сравнивали процент LSK и MP субпопуляций как частота общего живых клеток в 3-х независимых стремлений и обычных урожаев мозга. Эти данные, отображаются в фиг.1С, показывает снижение LSK и МП субпопуляции из костного мозга, собранных бедренной стремление сравнению с обычным урожая мозга (хотя это различие не было статистически значимым для любого населения).
Сортировка LSK клеток с последующим экс естественных условиях культуры в метилцеллюлозы привело похожи цифры колонии и типы клеток, полученные бедренной стремление костного мозга и обычного урожая BM (как показано на рисунке 1D). Типы колонии наблюдаемые и перечисленные включают КОЕ-GEMM (гранулоцитов, эритроцитов, моноцитов, megakaryocyte колониеобразующих единиц), КОЕ-ГМ (гранулоцитов, моноцитов колониеобразующих единиц), и БОЕ-Э (эритроидных ворвались формирования блока).
Рисунок 1. Бедренная костного мозга (КМ) стремление в живых мышей, чтобы облегчить рассмотрение содержания мозга без жертв мышей. (А) Райт Гимза окрашенных cytospins мононуклеаров, полученных через BM стремление живых мышей. Приблизительно 0,4-0,8 × 10 6 мононуклеарные клетки могут быть получены в каждой отдельной бедренного аспирации. Здесь показано, как правило, Кабачок содержимое дикого типа в возрасте 6 недель C57/B6 мышей, полученные бедренной BM аспирации (справа) по сравнению с обычной изоляции BM клеток через жертву мышей (слева) (масштаб бар представляет 10 мкм). (B) бедренной BM стремление обеспечивает достаточное количество клеток для оценкиния кроветворной отсеке стволовых / предшественников, как показано здесь (Справа: клетки из БМ аспирации; левые: клетки, полученные уборки мозга от пожертвовал мышей). Lineage-отрицательных Sca-1 + с-Kit + (LSK) клетки, содержащие гемопоэтических стволовых клеток, а также линии передачи с отрицательным Sca-1-C-KIT + миелоидные клетки-предшественники и их подтипы, как это определено CD34 и FcγR экспрессии были проанализированы (родитель ворота живет , Lineage-отрицательный клетки). Проценты, показанные см. процентов клеток в ворота. (С) Количественная оценка ЛСК (клетки, миелоидный предшественники () клетки MP, общие миелоидной предшественники (линия-отрицательных SCA-1-с-KIT + CD34 + FcγR промежуточное +), гранулоцитов-макрофагов клетки-предшественники (происхождение-отрицательных Sca-1-C-KIT + CD34 + FcγR +), и мегакариоцитов-эритроидных клеток-предшественников (Lineage-отрицательных Sca-1-C-KIT + CD34-FcγR-), а частотой живых клеток от обычного сбора костного мозга (N = 3) и бедренной стремление костного мозга (п = 3). Планки погрешностей представляют стандартом де-щение. (D) Представительства фотографии метилцеллюлозы анализа колоний приводит одну неделю после посева 150 LSK клеток в миелоидной / эритроидных содержащей метилцеллюлозы (выше) и количество и типы колоний, наблюдаемых с помощью LSK клетки от каждого метода. Типы колонии наблюдаемые и перечисленные включают КОЕ-GEMM (гранулоцитов, эритроцитов, моноцитов, мегакариоцитов колониеобразующих единиц), КОЕ-ГМ (гранулоцитов, моноцитов колониеобразующих единиц), и BFU-E (эритроидных ворвались формирования блок). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Серийный БМ стремление рутинной процедурой решающее значение для клинических испытаний гематологические заболевания у человека. Возможность выполнять аналогичную серийный выборки BM у мышей для характеристики клеточного состава и составляющих BM всей длительных экспериментов также очень ценно. Эта процедура полезна для характеризации HSPC без ущерба для мыши, но и для обнаружения присутствия дополнительных типов клеток в BM в тех случаях, когда содержимое периферической крови не может быть отражающей клеток, проживающих в BM. Серийный БМ стремление был использован весьма эффективно для этого позже цели в мониторинге присутствие клеток человека ксенотрансплантированной в ослабленным иммунитетом мышей, например 3. Учитывая, что 0.4-0.8 х 10 6 клеток, как правило, получить с каждой ВМ аспирации, эти клетки могут быть использованы для различных целей, включая цитологического анализа (фигура 1А), диаметромгностической цитометрии потока (рис. 1В), разделение потока цитометрии клеток с последующим далее вниз по течению использования отсортированных клеток в том числе культуре клеток (рис. 1в), извлечение нуклеиновой кислоты, извлечение белка для анализов, направленных на протеомного характеристике ограниченном количестве клеток, и даже дальнейшее трансплантации добываемых клетки. В то же время, важно отметить, что количество ГСК, полученных в каждом бедренной аспирации ограничена общего числа клеток, полученных в этой процедуре. Например, с учетом определения ГСК как род-отрицательных СЦА1 + cKIT + CD150 + CD48-CD244-клеток, частота ГСК составляет примерно 10 HSCs/100, 000 клетки 7. Основываясь на этой частоте, примерно 40-80 ГСК, как ожидается, получить с каждой процедуры аспирации. Кроме того, как отмечено на рисунке 1С, частота LSK и клеток-предшественников ниже, хотя и не достигает статистической значимости, в костном Marroш клетки, полученные с помощью бедренной стремление костного мозга по сравнению с обычным урожаем костного мозга. Мы считаем, что это относительное снижение ЛСК и частота предшественников видели с аспирационной относительно урожая хирургического костного мозга связана с загрязнением с периферической крови, которое происходит при бедренной стремление костного мозга. Следует отметить, Эти ограничения бедренной стремление костного мозга в оценке редких клеточных популяций в костном мозге. Еще одно замечание в том, что мы, как правило, выполняется эту процедуру у мышей в возрасте 6 недель и старше. Мы считаем, что эта процедура будет более технически сложными с мышами менее 6-недельного возраста.
Этот метод также хорошо подходит для оценки химеризм БМ в отличие от периферической крови в контексте постоянной конкурентной эксперимента восстановления. В этих анализах, функциональный потенциал HSC'S из экспериментального набора мышей тестировали против множества известно числа HSC &# 8217; ы с считывания быть периферическая химеризм крови, а также химеризм из ГСК (см. обзор по Purton др. 8.). Химеризм из периферической крови может противопоставить из химеризма в БМ, если возмущения, влияющие на кроветворную результат стволовых клеток отсека в нарушенной дифференцировки HSPC'S в зрелые циркулирующих клеток крови. Учитывая, что окончательный кроветворение не установлена по крайней мере до 16 недель после трансплантации 9, и что химеризма не может измениться после даже более длительных периодов времени 10, методик, которые облегчают доступ к ранее отсеке HSPC такие как проиллюстрировано здесь могут быть особенно полезны. В одном из недавних примеров, конкурентоспособная трансплантация BM клеток от мышей с гомозиготной послеродовой удаления Dnmt3a по Challen др.. Выявлено снижение химеризма от Dnmt3a-нулевых мышей в периферической крови, но парадоксальному увеличению HSC химеризма из Dnmt3a-Нуль HSC находится в BM 11. Этот результат свидетельствует о дифференцировки дефекта Dnmt3a - / - HSC-х, несмотря на увеличение самообновления. Более того, этот результат был замечен только в своевременной жертву получателей трансплантированных мышей в серийных конкурентных экспериментов по трансплантации с интервалом в каждые 16 недель. Поэтому анализы, которые позволяют для отбора проб BM клеток параллельно с периферической крови, не требуя жертву мышей и позволяет текущее наблюдение мышей весьма полезны.
Как упоминалось ранее, этот метод показал, здесь аналогична методике, используемой для intrafemoral инъекции непосредственно в полости костного мозга мышей пространстве 2,3. Прямая intrafemoral впрыска оказалась очень полезной в содействии исследования человека ксенотрансплантатов у мышей, где было показано, чтобы обеспечить улучшенную приживление в прямом сравнении с внутривенной инъекции 6,12,13. Этот метод даже позволяютред для идентификации ранее неизвестному классу быстро заполнение человека ГСК.
В настоящее время неизвестно, влияет ли повторный отбор из BM у мышей через тот же бедренной кости клеточный состав БМ или количества клеток костного мозга, полученных при повторных стремлений. Кроме того, минимальное количество времени, желательно выполнять процедуры аспирации повторных из того же бедренной кости не известно. При выполнении повторных бедренных устремления костного мозга в той же мыши, чередовать бедренную кость, используемый для BM стремления и выполнять последовательные аспираты BM с интервалом> 2 недель. Дальнейшие усилия направлены на понимание потенциальных последствий, если таковые имеются, серийных бедренных процедур аспирации BM у мышей через определенные промежутки времени по типам и количеству клеток, полученных из BM или архитектуры BM необходимы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| Bovine serum albumin | PAA | K41-001 | |
| ACK lysis buffer | Homemade | in 1 L. Adjust pH 7.2 ~ 7.4 and filter sterile with 0.22 μm vacuum filter. | |
| 8.3 g Ammonium chloride | Fisher Scientific | A661-500 | |
| 1 g Potassium bicarbonate | Fisher Scientific | P184-500 | |
| 200 μl 0.5 M EDTA pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| 0.5 ml Tuberculin syringe 27.5 G | Becton Dickinson | 305620 | |
| Sterile cell strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Isoflurane, USP | Attane | NDC:66794-014-25 | |
| Blunt-end needle | Stemcell Technologies | 28110 | |
| PrecisionGlide needle 23 G | Becton Dickinson | 305193 | |
| 3 ml Syringe Luer-Lok tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| Non-tissue culture treated plate, 6 Well | Becton Dickinson | 351146 | |
| 12 x 75 mm 5 ml tubes | Becton Dickinson | 352054 | FACS staining |
| 12 x 75 mm 5 ml tubes with cell-strainer cap | Becton Dickinson | 352235 | FACS staining |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | 100222 | |
| Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7 | Biolegend | 108423 | |
| Ter119 APC-Cy7 | Biolegend | 116223 | |
| CD19 APC-Cy7 | Biolegend | 302217 | |
| CD4 APC-Cy7 | BioLegend | 317417 | |
| CD117 (c-KIT) PE | BioLegend | 105808 | |
| Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7 | Biolegend | 122513 | |
| CD34 APC | Biolegend | 128612 | |
| CD16/32 e450 | eBioscience | 48-0161-82 | |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | For methocellulose culture |
| Carprofen | Crescent Chemical Company | C11045850 | 1 dose (5mg/kg) |
| Flow cytometer, LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Puralube vet ointment (sterile petrolatum ophthalmic ointment) | Dechra-US | 17033-211-38 |
References
- Sundberg, R., Hodgson, R. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, 557-561 (1949).
- Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).
- Warner, J. K., et al. Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells. Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).
- Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance. Blood. 116, 5268-5279 (2010).
- Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML). Blood. 101, 3142-3149 (2003).
- Nolta, J. A. The gold standard improves: a better assay for HSCs. Blood. 106, 1141-1142 (2005).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Purton, L., Scadden, D. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).
- Dykstra, B., et al. Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo. Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).
- Jordan, C., Lemischka, I. Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes & development. 4, 220-232 (1990).
- Challen, G., et al. Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation. Nature genetics. 44, 23-31 (2012).
- Hess, D. A., et al. Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood. 107, 2162-2169 (2006).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med. 9, 959-963 (2003).
