Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

قياس الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية الكلوية بواسطة التدفق الخلوي

Published: October 28, 2014 doi: 10.3791/51857
Automatic Translation
1, 2
1Institute for Physiology, Pathophysiology, & Toxicology, Centre for Biomedical Research and Training (ZBAF), University of Witten/Herdecke, 2Institute for Immunology & Experimental Oncology, Centre for Biomedical Research and Training (ZBAF), University of Witten/Herdecke

Summary

ويشارك الكالسيوم في العديد من مسارات الإشارات الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض. تصوير الخلايا الحية يتطلب معدات متخصصة ويمكن أن يكون مضيعة للوقت. تم تحسين A، طريقة بسيطة سريعة باستخدام عداد الكريات تدفق لتحديد التغيرات النسبية في الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية ملتصقة جلبت الى تعليق.

Introduction

الكالسيوم هو رسول الثاني المهم مسؤولة عن نقل الإشارات الخلوية والفسيولوجية المرضية 1. يتم الاحتفاظ تركيزات الكالسيوم عصاري خلوي منخفض من خلال نشاط مضخات الكالسيوم والمبادلات الكالسيوم. و/ هيولي باطني أتباز شبكية الهيولى العضلية الكالسيوم (SERCA) الغيارات الشبكة الإندوبلازمية (ER) تخزين الكالسيوم كجزء من نظام "تسرب مضخة" في حين أن أتباز الكالسيوم غشاء البلازما (PMCA) يقذف الكالسيوم إلى الخلية مقصورة، سواء في الأدب ATP التي تعتمد على 2. رسل الفسيولوجية، مثل الهرمونات أو الناقلات العصبية، نقل إشارات من خلال مستقبلات البروتين G-جانب، وتفعيل فسفوليباز C، والتي تتحلمأ فوسفتيدلينوستول 4،5-bisphosphate (PIP2) في الغشاء البلازمي لتوليد مادة ال diacylglycerol واينوزيتول ثلاثي الفوسفات (IP3) 3. في حين لا تزال مادة ال diacylglycerol في غشاء البلازما، IP3 ينشر في العصارة الخلوية وتربط لمستقبلات IP3يتم تحريرها ل (IP3Rs)، والتي يتم تفعيلها يجند قنوات الكالسيوم، وجدت في الغشاء ER والكالسيوم من مخزن ER اللمعية وبلغت ذروتها في زيادة تركيز الكالسيوم عصاري خلوي 4. طريق بديل للكالسيوم للوصول إلى العصارة الخلوية هو من خلال قنوات الكالسيوم والمبادلات موجودة في غشاء البلازما. وقد وصفت الحديث المتبادل بين هذين القسمين: الإفراج الكالسيوم الناجم عن الكالسيوم (CICR) حيث يدفع الكالسيوم خارج الخلية إطلاق الكالسيوم من ER 5 مخازن، ومتجر يعمل دخول الكالسيوم (SOCE) حيث تفريغ مخازن ER هو الذي تشعر به STIM ويسبب افتتاح Orai قنوات الكالسيوم في غشاء البلازما لتعزيز إعادة تعبئة مخازن ER 6.

في ظل الظروف المرضية في جسم المريض، والاستجابة الخلوية هي زيادة الكالسيوم الكالسيوم تحرير سعر وعصاري خلوي في غياب محفزات الفسيولوجية 1. قد تتأثر الاستجابة الكالسيوم في عدد من الطرق: لفترة طويلة الكالسيومإشارة، تأخر إزالة الكالسيوم من العصارة الخلوية، ونضوب مخازن الكالسيوم أو تغيرات محلية في الكالسيوم. وعلاوة على ذلك، الميتوكوندريا تأخذ على دور مركزي في التخزين المؤقت والإفراج عن الكالسيوم 7. لفترات طويلة و / أو فوق الأعظمي زيادة الكالسيوم عصاري خلوي يؤدي إلى موت الخلايا. في الحقيقة، الكالسيوم هو في كثير من الأحيان لا تشارك في الاستجابة المرضية الخلوية ويعد حدثا رئيسيا في مجموعة واسعة من الأمراض، مثل أمراض الاعصاب، أمراض القلب، والسرطان، وأمراض العظام وأمراض الكلى، والتي ترتبط بشكل رئيسي مع موت الخلايا وفقدان أو تغيير الجهاز أو الأنسجة ظيفة 8-10. وعلاوة على ذلك، وقد تم ربط اضطراب الإشارات الكالسيوم إلى التكيف الخلوي والتغيرات في الوظائف الخلوية والاستجابات.

تقليديا، يتم قياس اشارات الكالسيوم مع مؤشر الكالسيوم الفلورسنت سالبة الشحنة التي يتم تحميلها إلى الخلايا في خلية acetoxymethyl نفاذية (AM) شكل استر. مرة واحدة من قبل المشقوق esteras الخلويةوفاق، لا تزال المؤشرات الفلورسنت داخل حجرة داخل الخلايا وتزيد في كثافة مضان عندما يرتبط الكالسيوم. مؤشر الكالسيوم أكثر من المعروف جيدا والمستخدم هو ratiometric FURA-2 التي وضعها روجر تسين وزملاؤه 11. مؤشرات الكالسيوم مع اختلاف الانتماءات للكالسيوم تسمح حمامات الكالسيوم مختلفة ليتم رصدها. وتشمل طرق الكشف التصوير الخلية الحية، ومضان قارئ صفيحة ميكروسكوبية والتدفق الخلوي. حركية سريعة نسبيا من إشارات الكالسيوم (عادة في غضون بضع ثوان إلى دقائق) يجعل الخلية الحية التصوير أفضل طريقة لكسب أكبر قدر من المعلومات عن خصائص إشارة الكالسيوم. وبصرف النظر عن حركية السريعة للإشارات الكالسيوم (داخل ميلي ثانية)، تصوير الخلايا الحية هو أفضل طريقة لدراسة التقسيم الخلوي للإشارات الكالسيوم داخل خلية واحدة (12). ويمكن حساب تركيز الكالسيوم المطلقة من خلال تحديد الحد الأدنى والحد الأقصى مضان من الكالسيوم الصناعيةicator بإضافة الكالسيوم وخالب permeabilizing الخلايا، على التوالي، كما وصفها Grynkiewicz وآخرون 11.

وقد تم تطوير استخدام التدفق الخلوي لقياس اشارات الكالسيوم الأول في 1980s في الخلايا المناعية حيث الفرصة لقياس معلمات متعددة، مثل سلامة الغشاء والفصل بين سكان الخلية، وشرط من الخلايا في تعليق جنبا إلى جنب مع تطور الطول الموجي واحد مؤشرات الكالسيوم جعلت التدفق الخلوي وسيلة مثالية وconvenientdetection 13-15. في الخلايا الملتصقة، ويوفر تصوير الخلايا الحية على معظم المعلومات عن إشارات الكالسيوم، والأهم من حركية، ولكن يتطلب الإعداد معقدة تضم المجهر مضان، نظام نضح، والحفاظ على البيئة الخلوية، مثل درجة الحرارة، والبرمجيات المجهر المتخصص لاكتساب وتحليل البيانات. طرق بديلة مثل قارئ مضان صفيحة ميكروسكوبية أو pharmacolوسائل ogical من خلال استخدام chelators الكالسيوم هي لا تضاهى من حيث المعلومات المكتسبة. التدفق الخلوي أصبح أكثر استخداما لمراقبة الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الملتصقة مع ذلك، في معظم الدراسات، وتجرى القياسات فقط نقطة النهاية. باستخدام طريقة تم تطويرها في البداية من قبل جيرجيلي آخرون في الخلايا البائية المناعية 16، وقد تم قياس التغيرات في تركيز الكالسيوم عصاري خلوي مجانا عن طريق التدفق الخلوي مع حركية في الوقت الحقيقي ورصد كثافة مضان في الخلايا الفردية من سكان العينة بنجاح في سرطان الخلايا الظهارية والخلايا الجذعية السرطانية الهجينة 17. هذه الطريقة تم تكييفها للاستخدام في مزيد من الخلايا الظهارية ملتصقة، التي يصعب تحميل مع مؤشرات الكالسيوم 18.

هنا، وذلك باستخدام خط الخلايا الظهارية ملتصقة خلد المستمدة من قطاع S1 من النبيبات الدانية الكلى الفئران (WKPT-0293 Cl.2) 19، وصفنا لم مبسطة الأمثلethod لقياس التغيرات في تركيز الكالسيوم عصاري خلوي من خلال التدفق الخلوي. منذ العديد من الخلايا الظهارية تمتلك عددا من شركات النقل للمركبات الأيونية العضوية وتحميل خلايا مع مؤشر الكالسيوم يمكن ان يكون تحديا. لمنع هروب رأس المال من المؤشرات الكالسيوم، البروبينسيد، والمانع من تنميط النقل أنيون العضوية وضعت في الأصل لتقليل إفراز الكلى من البنسلين 20، يتم تطبيقها في وقت واحد في المتوسط ​​الحضانة. تتم المحافظة على الخلايا في الطبقات الوحيدة لتحميل مؤشر الكالسيوم، وجلبت الى تعليق والكالسيوم إشارات يمكن الكشف عنها على الفور بعد إضافة مركب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الكواشف وحلول

  1. تحضير محلول هانك لتعديل ومتوازن الملح (HBSS) (في ملي: 136.9 كلوريد الصوديوم، بوكل 5.37، 0.34 نا 2 هبو 4، 0.44 KH 2 PO 4، 4.17 NaHCO 3، ودرجة الحموضة 7.2، لا أحمر الفينول). تخزينها في 4 درجة مئوية.
  2. جعل 1.5 M CaCl 2 و 2 M 4- (2-هيدروكسي إيثيل) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) (الرقم الهيدروجيني 7.2) حلول الأسهم باستخدام الماء المقطر.
  3. إعداد محلول 250 ملم مخزون البروبينسيد. لشكل الحامض الحر (غالبا ما يشار إليها باسم المياه غير قابلة للذوبان)، ويحل مسحوق البروبينسيد في 1 N هيدروكسيد الصوديوم، وملء ثلاثة أرباع الحجم النهائي بالماء المقطر ويعاير إلى الرقم الهيدروجيني ببطء 7.4 مع 1 N حمض الهيدروكلوريك. تخزينها في 4 درجة مئوية.
  4. حل نفاذية الغشاء الفلورسنت صبغة ملزمة الكالسيوم اللامائية في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) إلى تركيز الأسهم من 1 ملم. تخزينها في -20 درجة مئوية في الظلام.
  5. قبل كل تجربة، وإعداد الطازجة التي تحتوي على H البروبينسيدBSS تدفق (هوكي) عازلة من خلال الجمع بين HBSS مع تعديل (في تركيزات النهائي) 1.5 ملي CaCl 2، 10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.2 و 5٪ مصل بقري جنيني، 2 مم البروبينسيد، و 5.55 ملي الجلوكوز. الحارة إلى 37 درجة مئوية.

2. خلية ثقافة

  1. لوحة 2.5 × 10 5 خلايا الكلى القريبة أنبوب صغير (WKPT-0293 Cl.2) لكل بئر من صحن 6 لوحة جيدا أو 35 مم القياسية في مستنبت وتنمو لمدة 2 أيام التوصل إلى confluency من حوالي 70٪.

3. الكالسيوم صبغ تحميل

  1. لكل طبق بشكل جيد، أو مزيج 1 مل مستنبت تحتوي على 5٪ مصل بقري جنيني، 4 ميكرومتر نفاذية الخلية الكالسيوم صبغة ملزمة و2 مم البروبينسيد.
  2. استبدال الثقافة المتوسطة مع 1 مل خليط الصبغة تحميل في كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2. تغطية لوحة بورق الألمنيوم لمنع تبييض مؤشر الفلورسنت.

4. إعداد سيLLS عن التدفق الخلوي

  1. دافئ 0.05٪-التربسين ethylenediaminetetraacetic حمض (EDTA) حل إلى 37 درجة مئوية.
  2. نضح الكالسيوم محلول الصبغة تحميل من كل بئر وإضافة 1 مل التربسين على طول جدار البئر.
  3. احتضان عند 37 درجة مئوية حتى يتم فصل كل الخلايا.
  4. نقل الخلايا إلى أنبوب 1.5 مل وبيليه بواسطة الطرد المركزي في microcentrifuge في 10000 ز لمدة 1 دقيقة.
  5. نضح بعناية طاف دون الإخلال بيليه.
  6. غسل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل عازلة PHF و resuspend pipetting صعودا وهبوطا.
  7. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 10000 ز لمدة 1 دقيقة.
  8. كرر الخطوات من 4.6. و 4.7. مزيد من مرتين.
  9. الخلايا resuspend في الحجم النهائي من 500 ميكرولتر عازلة PHF واستخدام الخلايا للتجريب في حدود 1 ساعة.
  10. اختياري: خلايا العد لتحديد تركيز الخلية واستخدام 5 × 04-1 أكتوبر × 10 5 خلايا لكل قياس.

5. تدفق CYTإعداد ometer

  1. بدء تدفق عداد الكريات، فتح درج FLUIDICS والوجه تنفيس صمام التبديل تبديل لزيادة ضغط الهواء من خزان السائل غمد.
  2. "رئيس" أداة لإزالة فقاعات الهواء الإقامة المحتملة من داخل الأنابيب الداخلية وغرفة التدفق.
  3. في البرنامج التدفق الخلوي، وفتح نافذتين مؤامرة نقطة.
    1. يتطلب مؤامرة نقطة الأولى إلى الأمام الضوء المتناثرة (FSC) لX المعلمة والجانب الضوء المتناثرة (SSC) للمعلمة Y للسيطرة على نوعية الخلايا داخل العينة من خلال حجمها وتحبب، على التوالي.
    2. يقيس مؤامرة النقطة الثانية كثافة مضان من صبغ ملزمة الكالسيوم. حدد القناة كشف مضان المناسبة للمعلمة Y باستخدام مقياس لوغاريتمي والوقت بالثواني لX المعلمة على مقياس خطي.
  4. ضبط معدل تدفق إلى "مرتفع".

6. التدفق الخلوي Measurement

  1. إجراء القياسات في RT. في التدفق الخلوي أنبوب العينة (11.5 × 75 ملم)، وإضافة 480 ميكرولتر عازلة PHF.
  2. إضافة 20 ميكرولتر تعليق الخلية لفترة وجيزة دوامة لخلط.
  3. تحريك الذراع دعم أنبوب إلى الجانب ووضع أنبوب العينة على أنبوب حقن العينة حتى يتم تشكيل ختم مشددة. العودة الذراع دعم أنبوب إلى موقعها الأصلي محورها.
  4. تحسين القياس عن طريق ضبط قناة مضان مثل أن متوسط ​​كثافة مضان من العينة في حوالي 10 2 على المحور الصادي. حفظ واستخدامه في التجارب اللاحقة.
  5. لبدء التجربة، كرر الخطوات من 6،1-6،3.
  6. مضان خط الأساس القياسي لمدة 50 ثانية.
  7. وقفة القياس، إزالة أنبوب عينة، إضافة مجمع المصالح، ودوامة لفترة وجيزة والعودة إلى أنبوب حقن العينة. هذه الخطوة يجب أن لا يستغرق أكثر من 15 ثانية.
  8. استئناف القياس ويستمر لمدة ما مجموعه 204.8 ثانية.
  9. استخدام ط الكالسيومonophore، مثل ionomycin (10 ميكرومتر)، وخالب من الكالسيوم، مثل جلايكول الإثيلين حمض tetraacetic (EGTA)، MnCl 2 أو 2 كوكلي (2 ملم)، عن الضوابط الإيجابية والسلبية، على التوالي.

7. تحليل البيانات

  1. تحليل البيانات باستخدام برمجيات مخصصة التدفق الخلوي للتحليل غير متصل، مثل WinMDI (واجهة ويندوز متعددة وثيقة للالتدفق الخلوي)، مجموعة من البرامج المجانية التي وضعها جو تروتر في معهد سكريبس، مرفق التدفق الخلوي الأساسية.
  2. فتح مؤامرة نقطة مع SSC FSC والمعلمات.
  3. تحديد المنطقة الخلايا لتحليلها باستخدام "المناطق" أداة (انقر بالزر الايمن على الصورة) لاستبعاد الخلايا الميتة أو الحطام الخلية الموجودة في الزاوية السفلية اليسرى من تحليل البيانات (الشكل 1).
  4. تحليل رباعي (الشكل 2)
    1. فتح مؤامرة كثافة مع الوقت على محور س وكثافة مضان على المحور الصادي. استخدام كافة الأحداث.
    2. لناالبريد نفس المنطقة النابضة كما في 7.3.
    3. قياس البيانات باستخدام "كوادرانت" أداة.
    4. ضبط فواصل رباعي بحيث يوضع خط عمودي عند إضافة مركب ويتم وضع خط أفقي في وسط مضان خط الأساس في الضوابط. تأكد من أن المواقع من فواصل رباعي يساوي في جميع العينات.
    5. يتم عرض النسبة المئوية للخلايا في كل رباعي في كل ركن (الشكل 2). مقارنة الربع العلوي الأيمن (UR) بين العينات.
  5. تحليل الرسم البياني (الشكل 3)
    1. فتح بيانات التحكم في نافذة الرسم البياني مع كثافة مضان على محور س والأحداث على المحور الصادي. استخدام كافة الأحداث.
    2. لمحة تصويرية، إضافة بيانات الاختبار ليتم مقارنة مؤامرة السيطرة كما المؤامرات تراكب (اذهب إلى ملف فتح ملف → → → حدد ملف التراكب).
    3. للتحليل الكمي، رسم بياني واحد يفوزيجب استخدام دوز. بوابة السكان الخلية باستخدام المنطقة R1 من الخطوة 7.3.
    4. في السيطرة غير المعالجة، واستخدام وظيفة علامة ("العلامات") لتحديد المنطقة لتحليل بدءا من نقطة الوسط بين الحد الأدنى والحد الأقصى لمضان ذروة السيطرة وتنتهي في أقصى كثافة مضان. يتم حساب النسبة المئوية للخلايا في هذا المجال.
    5. استرداد البيانات من نافذة الإحصائيات. أكرر للبقاء ملفات البيانات باستخدام نفس المنطقة ملحوظة للتحليل.
  6. تحليل كثافة مضان (الشكل 4)
    1. فتح مؤامرة نقطة مع الوقت على محور س وكثافة مضان على المحور الصادي. استخدام كافة الأحداث.
    2. تمكين "وضع حركية" و "تراكب حركية الخط". سوف يظهر الخط الأزرق في مؤامرة نقطة الذي يمثل متوسط ​​كثافة مضان.
    3. قياس تدفق الكالسيوم النسبي من خلال خلق مناطق مستطيلة متعددة. ينبغي أن يكون لكل منطقة فصيل عبد الواحدidth حوالي "50"، وهو ما يعادل "10 ثانية". تحديد ما يصل إلى 15 مناطق مستطيلة.
    4. استرداد الكمي من نافذة الإحصاءات ونسخ في جدول بيانات.
    5. استخدام البيانات ذ يعني لتحليلها. حساب متوسط ​​R2 إلى R6، وهو ما يعادل 20 إلى 50 ثانية. هذه هي القيمة الأساسية.
    6. اختيار الفترة الزمنية المناسبة لتحليل تدفق الكالسيوم (يعتمد على بداية ومدة وشدة).
    7. حساب إشارات الكالسيوم من كل منطقة في غضون هذا الوقت الفاصل الزمني النسبي لقيمة أساسية المتوسط، أي إشارة مضان قبل إضافة مركب، والتي تم تعيينها إلى 100٪. تحديد المتوسط ​​والانحراف المعياري من المناطق إضافة إلى ذلك المركبة؛ هذا هو إشارة الكالسيوم يعني حركها المجمع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

زيادة الكالسيوم عصاري خلوي، طبقت اثنين من المركبات الدوائية إلى الخلايا الكلوية القريبة أنبوب صغير (WKPT-0293 Cl.2) محملة صبغة نفاذية الخلية الكالسيوم ملزمة، فلوو-3-AM. تم تحميل عينات السيطرة Nontreated مع الكالسيوم صبغة ملزمة بحضور البروبينسيد وكانت مختلطة ولكن من دون إضافة أي مركبات. Thapsigargin (TG) هو المانع الكلاسيكي للمضخة SERCA مما يؤدي إلى التسرب من ER وأدى إلى زيادة الكالسيوم عصاري خلوي. Tunicamycin (TUN) كتل N-بالغليكوزيل من البروتينات يؤدي إلى تنشيط استجابة البروتين تكشفت ولكن أيضا يزيد من الكالسيوم عصاري خلوي 18،21. كعنصر تحكم إيجابية، ionomycin (IONO)، وهي حامل الأيون الكالسيوم جعل نفاذية الغشاء البلازمي للخارج الخلية الكالسيوم، كانت تستخدم. للتحليل، وبوابات السكان الخلية عن طريق تحديد منطقة في نقطة مؤامرة SSC / FSC (R1 في الشكل 1). تم إنشاء مؤامرة الكثافة لكثافة مضان مقابل مرة لكل ملف البيانات. باستخدام وظيفة رباعي، تم فصل مؤامرة نقطة في أربعة مجالات يمثلون فلوو-3 كثافة مضان قبل وبعد إضافة مركب وفوق وتحت خط الأساس مضان. الكمي كنسبة مئوية من السكان الخلية المغلقة في كل رباعي يسمح بتحديد زيادة تركيز الكالسيوم عصاري خلوي. في هذا المثال، 3 ميكرومتر TG يسبب زيادة في النسبة المئوية للخلايا في الربع العلوي الأيمن يدل على أن إشارة الكالسيوم قد يسببها. النسبة المئوية للخلايا تزيد من 42.8٪ في السيطرة على 51.3٪ (1.20 أضعاف) في الخلايا TG المعالجة. وبالمثل، 6 ميكرومتر TUN تقوي النسبة المئوية للخلايا مع زيادة كثافة مضان الكالسيوم إلى 49.9٪ (1.17 أضعاف). أدى تطبيق 10 ميكرومتر في IONO 65.5٪ (1.53 أضعاف) من الخلايا في الربع العلوي الأيمن (الشكل 2). أدى تحليل الرسم البياني في 1.41 أضعاف، 1.36 و 2.11 أضعاف أضعاف بحلول TG، TUN وIONO على التوالي (الشكل 3) (للإحصاءات، انظر>سوب> 18). أخيرا، وذلك باستخدام طريقة التحليل المتعدد المنطقة، تسبب TG، TUN وIONO 1.55 أضعاف، أضعاف 1.29 و 4.54 أضعاف الزيادة في إشارة الكالسيوم للسيطرة على التوالي (الشكل 4).

كان وضع تحليل الأكثر حساسية في المنطقة التحليل المتعدد. وعلى النقيض من رباعي وطرق تحليل الرسم البياني، حيث يتم كميا توزيع السكان الخلية، ومتعددة وضع التحليل الكمي المنطقة التغير في إشارة الفلورسنت من مجموع السكان الخلية. كان أكبر تباين في نتائج التحليل من وسائط مختلفة لionomycin التي تراوحت بين 1.53 أضعاف السيطرة من تحليل رباعي إلى 4.54 أضعاف من التحليل المتعدد المنطقة. لم مركبات اخضعت للاختبار لا يحمل مثل هذا التباين. ومع ذلك، في جميع وسائل التحليل، ومدى إشارة الكالسيوم أثار بقيت على حالها على الرغم من أن القيم المطلقة اختلفت، أي كان IONO أكبر تأثير تليها TG ثم TUN. تطبيق TG، TUN أو IONO يؤدي إلى تغييرات دائمة في عصاري خلوي الكالسيوم. لتحديد ما إذا كانت إشارات الكالسيوم الفسيولوجية، والتي هي عابرة، ويمكن قياسها باستخدام هذه الطريقة تم تطبيقها ATP إلى WKPT-0293 خلايا Cl.2. ATP أثار إشارة الكالسيوم سريعة وعابرة، والتي لا يمكن تسجيلها في مجملها من جانب التدفق الخلوي الأسلوب. كانت 100 ميكرومتر يصعب اكتشافها وبالتالي تم تخفيض تركيز على "إبطاء" إشارات الكالسيوم - تركيز ATP في 20. كما هو مبين في الشكل رقم 5، ويمكن أن يقاس التغيير في عصاري خلوي الكالسيوم بعد إضافة 5 ميكرومتر ATP. ومع ذلك، لم تسجل ذروة التغيير مضان. باستخدام تحليل رباعي (الشكل 5B) وتحليل الرسم البياني (الشكل 5C) وسائط، يمكن أن يتم الكشف عن أي اختلاف في اشارات الكالسيوم في ATP نظرا لطبيعة عابرة للإشارة الكالسيوم. ومع ذلك، مع أجزاء مختارة من التتبع، وrectangula متعددةسجلت ص وضع تحليل المنطقة 1.85 أضعاف في إشارة الكالسيوم على الفور بعد ان استأنفت القياس (الشكل 5A).

الشكل 1
الشكل 1. SSC FSC مقابل مؤامرة نقطة. ويتم تقييم سلامة السكان الخلية باستخدام الجانب مبعثر (SSC) ومبعثر إلى الأمام (FSC). يتم اختيار منطقة (R1) لمزيد من التحليل. يتم استبعاد الخلايا الميتة والبقايا الخلوية، التي خفضت تشتت الضوء. ويرد مؤامرة نقطة التمثيلية.

الرقم 2
الشكل 2. تحليل رباعي. وقد تم قياس مضان الأساسي للكالسيوم WKPT-0293 Cl.2 خلايا محملة صبغة ملزمة لمدة 50 ثانية. أوقف القياس، أو مركب ديأضيف luent، vortexed لخلط واستؤنف قياس فورا لما مجموعه 204.8 ثانية. تم إجراء التحليل الكمي باستخدام رباعي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الشكل 3. تحليل الرسم البياني. مؤامرة الرسم البياني للكالسيوم WKPT-0293 Cl.2 خلايا محملة صبغة تعامل مع TG، TUN أو IONO ملزمة. باستخدام وظيفة علامة، ونسبة الخلايا المغلقة مع ارتفاع الكالسيوم ملزمة كثافة الصبغة مضان كان كميا عن طريق وضع نقطة انطلاق العلامة في ذروة منحنى السيطرة وتنتهي في أقصى مضان. الرجاء انقر هنا لعرض تأإيه نسخة من هذا الرقم.

الرقم 4
الشكل 4. متعددة تحليل المنطقة. وقد تم قياس مضان الأساسي للكالسيوم WKPT-0293 Cl.2 خلايا محملة صبغة ملزمة لمدة 50 ثانية. تم إيقاف القياس، وأضيف مركب أو مخفف، vortexed لخلط واستؤنفت قياس فورا لما مجموعه 204.8 ثانية. تم إجراء التحليل الكمي باستخدام المتعدد منطقة مستطيلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. تحليل إشارات الكالسيوم ATP التي يسببها. خط الأساس مضان سو تم قياس الكالسيوم WKPT-0293 Cl.2 خلايا محملة صبغة ملزمة لمدة 50 ثانية. تم إيقاف القياس، وأضيف 5 ميكرومتر ATP، vortexed لخلط واستؤنفت قياس فورا لما مجموعه 204.8 ثانية. وكان كميا البيانات باستخدام التحليل المتعدد مستطيلة المنطقة (A)، وتحليل رباعي (B) أو تحليل الرسم البياني (C). لتحليل المنطقة متعددة، تم تحليل سوى إشارة عابرة الكالسيوم. البيانات أو التحليل من ن تمثيلية = 3 - 7 تظهر الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الكالسيوم هو الحدث الرئيسي في العمليات الخلوية متعددة بوصفها الثاني جزيء رسول الإشارات وأيضا كوسيلة للتواصل بين ER والميتوكوندريا. القدرة على قياس التغيرات في تركيزات الكالسيوم عصاري خلوي الحر هو تقنية مفيدة يمكن أن تنطبق على جميع مجالات بيولوجيا الخلية. هناك عدة طرق للكشف عن اشارات الكالسيوم عصاري خلوي. كلاسيكيا، وإشارات من مؤشر الكالسيوم ratiometric، مثل FURA-2، ويتم رصد في الخلايا الحية باستخدام الإعداد التصوير مضان وتركيزات الكالسيوم المطلقة يمكن استخلاصها من تحديد شدة الحد الأدنى والحد الأقصى مضان. ومع ذلك، هذا الأسلوب يتطلب معدات متخصصة، مثل المجهر مضان، لتصوير الخلايا الحية إعداد وبرامج التحليل. هنا، نحن تصف طريقة بسيطة لكشف الكالسيوم في العصارة الخلوية للخلايا الظهارية ملتصقة باستخدام التدفق الخلوي، التي هي في متناول معظم المختبرات.

ظهائر هي في بوssession من مجموعة من شركات النقل المسؤولة عن نقل نواتج الأيض، الاكسيوبيوتك والمخدرات. أهمية خاصة هو الفصيلة SLC22A، التي الموجبة العضوية والعضوية أنيون النقل تنتمي 22، والكاسيت ATP ملزم (ATP) الفصيلة، التي تعتبر المقاومة للأدوية المتعددة بروتين سكري-P ABCB1 والبروتينات المقاومة للأدوية المتعددة إلكترونيا (MRPs) بين أعضائه 23 . وأجريت التجارب الأولية باستخدام Cl.2 الكلى الفئران الداني خط خلية أنبوب صغير WKPT-0293 كما هو موضح في ورقة كتبها جيرجيلي وآخرون. 16. تم جلب الخلايا في التعليق ومحملة فلوو-3 PM. ومع ذلك، لوحظ فقط تغيير متواضع مع 10 ميكرومتر ionomycin (38.14٪ مقابل 50.95٪ في الرقابة عن طريق تحليل رباعي أو 1.78 أضعاف بحلول متعددة تحليل المنطقة). نحن افترضنا أن النقل الظهارية هي المسؤولة عن تحميل الفقراء من الخلايا مع فلوو-3 PM. للتحايل على هذه المشكلة، البروبينسيد وPSC833، مثبطات لالعضويالنقل nion والمقاومة للأدوية المتعددة ف بروتين سكري، على التوالي، تم تطبيقها في وقت واحد مع الكالسيوم صبغة ملزمة على الطبقات الوحيدة الخلية. تحسن البروبينسيد الكالسيوم صبغة تحميل ملزمة، كما يتضح من زيادة في كثافة مضان الأساسية، في حين كان PSC833 أي تأثير، الذي هو على النقيض من تقرير سابق في الهامستر الصيني خلايا المبيض 24. هذا الاختلاف ربما يكمن في مستويات ABCB1 في خطوط مختلفة من الخلايا. خط الخلية Cl.2 WKPT-0293 المرافئ مستوى منخفض من ABCB1 الذاتية، والتي يمكن أن تسببها المواد السامة، مثل المعادن السامة 25،26. استخدام البروبينسيد لتحسين الكالسيوم صبغة تحميل يمكن أن تمتد إلى أنواع أخرى من الخلايا التي تظهر أنظمة النقل تراعي البروبينسيد، مثل خلايا الجهاز العصبي، وحاجز الدم في الدماغ والكبد، حيث يشير الكالسيوم قد تلعب دورا في الإشارات بين الخلايا مسارات.

كشف السهل الكالسيوم ملزمة لفلوو-3 الأكاذيب في REQUI لهاrement واحد فقط طول موجة الإثارة (506 نانومتر) والطول الموجي الانبعاثات واحد (525 نانومتر). ومع ذلك، فإن البيانات التي تم إنشاؤها مع واحد الطول الموجي الكالسيوم الأصباغ ملزمة، كما صبغة غير ratiometric، لا يمكن إلا أن تستخدم لقياس الزيادات النسبية في عصاري خلوي الكالسيوم أكثر من الضوابط غير المعالجة. لتحديد تركيزات الكالسيوم المطلقة، صبغة ratiometric ضروري لأن التحول الطيفي يحدث بعد الكالسيوم الملزمة التي تسمح لتصحيح عدم المساواة في تحميل الصبغة والتبييض. وقد استخدم الصبغة ratiometric الهندية 1 في الكشف عن تعبئة الكالسيوم في الخلايا المناعية التدفق الخلوي 27،28 ولكن حتى الآن، وهذا لم يتم أداؤها في الخلايا الظهارية. باستخدام الأطياف اثنين من انبعاث الأشعة فوق البنفسجية منفعل الهندية 1 (400 نانومتر عند ملزمة الكالسيوم و 475 نانومتر عند الكالسيوم الحرة) يمكن تحديدها، وتركيزات الكالسيوم عصاري خلوي المطلقة كما وصفها Grynkiewicz وآخرون 11.

بيانات مثالنا المستخدمة المركبات الدوائية التي تحفز ا ف بتغيير ermanent في عصاري خلوي الكالسيوم. إشارات الكالسيوم الفسيولوجية ذات كثافة منخفضة، عرض حركية سريعة وعابرة، وبالتالي يبقى السؤال حول ما إذا كان التدفق الخلوي طريقة حساس بما يكفي للكشف عن اشارات الكالسيوم الفسيولوجية. وأجريت التجارب مع ATP مع Cl.2 خط الخلية WKPT-0293، الذي يؤوي مستقبلات purinergic كما يتضح من زيادة إشارة الكالسيوم بناء على طلب من ATP (تقاس تصوير الخلايا الحية). باستخدام تدفق عداد الكريات، ويمكن ملاحظة زيادة الكالسيوم عصاري خلوي 1 - 100 ميكرون ATP، ولكن طبيعة السريعة للإشارة جنبا إلى جنب مع التأخير في استئناف قياس بعد إضافة مركب يعني أنه ليس هناك سوى جزء من إشارة يمكن تسجيلها. وبالتالي عائقا كبيرا من التدفق الخلوي الأسلوب هو قدرتها المحدودة على تسجيل السريع (<10 ثانية) وإشارات الكالسيوم عابرة. بدلا من الأسلوب هو أكثر ملاءمة لالمثيرات التي تؤدي إلى إشارات عابرة أبطأ (> 10 ثانية) أو أحسب ارتفاع مستمرإشارات البوتاسيوم. يمكن التحايل على هذه القيود من خلال تقليل تركيز مشجعا أو من خلال تطبيق مثبطات امتصاص الكالسيوم للآليات الإبقاء على الكالسيوم الذي صدر في العصارة الخلوية ولكن يجب أخذ الحذر لتحديد تركيز مثبط لا زيادة الكالسيوم عصاري خلوي في حد ذاته.

المعلومات المكتسبة من خلال تصوير الخلايا الحية والتدفق الخلوي هي مختلفة تماما. مع التصوير الخلية الحية، وارتفاع القرار يعني أن التغيرات المكانية في الكالسيوم يمكن قياسها عن طريق تحديد مناطق داخل الخلايا من الخلايا واحد للتصوير. وعلاوة على ذلك، يتم الحصول على إشارات مضان دون توقف كل 1 - 2 ثانية ومن ثم اشارات الكالسيوم السريعة يمكن تسجيلها. في المقابل، التدفق الخلوي هو أكثر ملاءمة للإشارات الكالسيوم دائم أبطأ وطويلة ويقيس إشارات الكالسيوم من السكان الخلية كله. التغيرات النسبية إلا في إشارات الكالسيوم يمكن قياسها كميا مع التدفق الخلوي الأسلوب. ولكن، على طريقة التدفق الخلوي لديها عدد من يمضيتاغس خلال التصوير التقليدي الخلية الحية: 1) فحص إنتاجية عالية من مركبات (التحفيز والتشجيع ومثبطات إشارات الكالسيوم) يمكن أن يؤديها. 2) لا يشترط الخبرة التصوير محدد؛ 3) يمكن أن الفنيين الأبحاث أداء القياسات. 4) المختبرات السريرية وغير السريرية التي لا تملك الوسائل لأداء عالية الدقة وقياسات التصوير الكالسيوم ratiometric يمكن تحقيق إشارات الكالسيوم. أخذت معا، والتدفق الخلوي الطريقة مفيدة إذا رغبت المحقق في البداية لإنشاء دور للكالسيوم ويمكن بسهولة تطبيق مثبطات لتحديد مسارات المنبع والمصب الإشارات، في حين ستلزم تصوير الخلايا الحية لتوصيف إشارة الكالسيوم (على سبيل المثال، حركية ، وكثافة، والتغيرات المكانية) بمزيد من التفصيل.

باختصار، نحن تصف طريقة سريعة وبسيطة وحساسة للكشف في الوقت الحقيقي التغيرات النسبية في عصاري خلوي الكالسيوم في يصعب حمولة الكلى الظهارية ملتصقةالخلايا، والتي تم جلبها إلى تعليق. لالمجربون دون الوصول إلى التدفق الخلوي، وهذه الطريقة يمكن تطبيقها بسهولة إلى spectrofluorimeter مع تعليق خلية في كفيت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ويتم تمويل البحوث في المختبرات من قبل مؤسسة فريتز بندر، ميونيخ، ألمانيا (لTD) وجامعة ويتن / Herdecke منحة بحثية الداخلي (لجورج-KL). نود أن نشكر الأستاذ الدكتور الدكتور فرانك Thévenod (معهد علم وظائف الأعضاء، الفيزيولوجيا المرضية والسموم بجامعة ويتن / Herdecke) للحصول على اقتراحات مفيدة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluo-3, AM Invitrogen F-1241  Cell permeable
Probenecid Sigma-Aldrich P-8761 Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Invitrogen 25300-062
Ionomycin Sigma-Aldrich I9657
Thapsigargin Tocris Bioscience 1138
Tunicamycin Sigma-Aldrich T7765
FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software Becton Dickinson
Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI) Joe Trotter, The Scripps Institute Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.
WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case
Western Reserve University, Cleveland, OH)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
  2. Brini, M., Carafoli, E. Calcium pumps in health and disease. Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).
  3. Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
  4. Putney, J. W. Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate. Am J Physiol. 252, 149-157 (1987).
  5. Putney, J. W., Ribeiro, C. M. Signaling pathways between the plasma membrane and endoplasmic reticulum calcium stores. Cell Mol Life Sci. 57, 1272-1286 (2000).
  6. Soboloff, J., Rothberg, B. S., Madesh, M., Gill, D. L. STIM proteins: dynamic calcium signal transducers. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 549-565 (2012).
  7. Williams, G. S., Boyman, L., Chikando, A. C., Khairallah, R. J., Lederer, W. J. Mitochondrial calcium uptake. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10479-10486 (2013).
  8. Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787, 335-344 (2009).
  9. Monteith, G. R., Davis, F. M., Roberts-Thomson, S. J. Calcium channels and pumps in cancer: changes and consequences. J Biol Chem. 287, 31666-31673 (2012).
  10. Roderick, H. L., et al. Calcium in the heart: when it's good, it's very very good, but when it's bad, it's horrid. Biochem Soc Trans. 35, 957-961 (2007).
  11. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260, 3440-3450 (1985).
  12. Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. , (2013).
  13. Valet, G., Raffael, A., Russmann, L. Determination of intracellular calcium in vital cells by flow-cytometry. Naturwissenschaften. 72, 600-602 (1985).
  14. June, C. H., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration. Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).
  15. Ransom, J. T., DiGiusto, D. L., Cambier, J. Flow cytometric analysis of intracellular calcium mobilization. Methods Enzymol. 141, 53-63 (1987).
  16. Gergely, L., Cook, L., Agnello, V. A simplified method for Ca2+ flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 4, 70-74 (1997).
  17. Seidel, J., et al. The neurotransmitter GABA is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1alpha induced migration of adult CD133+ hematopoietic stem and progenitor cells. Stem cells and development. 16, 827-836 (2007).
  18. Lee, W. K., Chakraborty, P. K., Roussa, E., Wolff, N. A., Thévenod, F. ERK1/2-dependent bestrophin-3 expression prevents ER-stress-induced cell death in renal epithelial cells by reducing CHOP. Biochim Biophys Acta. 1823, 1864-1876 (2012).
  19. Woost, P. G., et al. Immortalization and characterization of proximal tubule cells derived from kidneys of spontaneously hypertensive and normotensive rats. Kidney Int. 50, 125-134 (1996).
  20. Beyer, K. H., et al. Benemid,' p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; its renal affinity and its elimination. Am J Physiol. 166, 625-640 (1951).
  21. Buckley, B. J., Whorton, A. R. Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells. Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).
  22. Koepsell, H. The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions. Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).
  23. Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).
  24. Brezden, C. B., Hedley, D. W., Rauth, A. M. Constitutive expression of P-glycoprotein as a determinant of loading with fluorescent calcium probes. Cytometry. 17, 343-348 (1994).
  25. Thévenod, F., Friedmann, J. M., Katsen, A. D., Hauser, I. A. Up-regulation of multidrug resistance P-glycoprotein via nuclear factor-kappaB activation protects kidney proximal tubule cells from cadmium- and reactive oxygen species-induced apoptosis. J Biol Chem. 275, 1887-1896 (2000).
  26. Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A., Thévenod, F. Cadmium induces Wnt signaling to upregulate proliferation and survival genes in sub-confluent kidney proximal tubule cells. Mol Cancer. 9, 102 (2010).
  27. Jennings, L. K., Dockter, M. E., Wall, C. D., Fox, C. F., Kennedy, D. M. Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry. Blood. 74, 2674-2680 (1989).
  28. Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM. Cytometry. 10, 165-173 (1989).

Tags

علم الأحياء الخلوي، العدد 92، الكلى، نظام مراقبة الأصول الميدانية، والرسول الثاني، نبيب الداني، مؤشرات الكالسيوم، البروبينسيد، الشبكة الإندوبلازمية، ionomycin
قياس الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية الكلوية بواسطة التدفق الخلوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, W. K., Dittmar, T. Cytosolic… More

Lee, W. K., Dittmar, T. Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (92), e51857, doi:10.3791/51857 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter