Introduction
L'épithélium olfactif de la souris dans la cavité nasale comprend 6-10000000 neurones sensoriels olfactifs bipolaires 1. Chaque neurone olfactif choisit l'un des 1200 gènes de récepteurs olfactifs d'expression. La détection des substances odorantes commence par se lier à un récepteur olfactif 2, qui active alors l'adénylyl cyclase de type III (ACIII) 3 via la protéine G spécifique olfactif Ga olf 4 odorant. L'augmentation de l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) résultant ouvre un nucleotide-gated cyclique (CNG), un canal cationique non sélectif qui conduit à l'afflux de Ca2 + et de Na + et Ca2 + influx ensuite conduit à une ouverture de Ca2 + activés Cl - 5,6 canal. Le résultant extérieur Cl - flux est facilitée par une haute Cl intracellulaire - concentration maintenue constante par prise de Cl -, probablement par la Na + / K + / Cl - cotransporteur NKCC1, leCl - / HCO 3 - échangeur SLC4A1, et peut-être d'autres transporteurs encore être identifiés 6-8.
Neurones olfactifs bipolaires sont simples, non ramifiés axones qui font saillie directement vers le bulbe olfactif, et une dendrite qui se étend à la surface de l'épithélium et se termine comme un compartiment spécialisé, le bouton dendritique. De ce bouton, 10-30 cils, qui peut atteindre une longueur maximale de 50 à 60 um, émaner dans le mucus recouvrant la surface épithéliale neuf. Les protéines de la cascade de transduction du signal canonique sont principalement localisés dans la membrane de ces cils. La surface sensorielle accrue de l'épithélium amplifie la capacité à détecter les substances odorantes. En raison de la densité des neurones sensoriels, les cils se étendant à partir de boutons dendritiques voisins se entremêlent. Ce brassage conduit à un mélange aléatoire de différentes franges de neurones qui expriment différents types de récepteurs olfactifs, sur la surface de l'épithélium. La détection et la celluleparti- allocation de protéines ciliaires qui ne sont présents dans un sous-ensemble de neurones sensoriels est donc difficile dans cryosections. En outre, la localisation précise de ces protéines ainsi que les cils ne est guère possible, puisque coupes cryogéniques sont généralement plus mince que la longueur moyenne des cils.
Pour activer enquête sur ciliaire localisation de protéines membranaires jusqu'à présent non caractérisés dans les neurones olfactifs, nous avons optimisé une technique de préparation face en permettant l'analyse détaillée de la localisation des protéines dans les cils. En bref, la souris est sacrifiée et la tête près de la ligne médiane divisée. Cornets, nasale, et des os frontaux sont retirés pour exposer le septum. Le septum avec la partie olfactive de l'épithélium de revêtement est desserré en coupant toutes les connexions à la cavité nasale. Après avoir mis le septum dans une boîte de Pétri remplie de la solution de Ringer, l'épithélium est décollée und transféré sur une lame de verre revêtue. Après une courte FIXATétape ions, procédures immunocoloration peut être effectuée si la manipulation est aussi douce que possible pour éviter d'endommager le tissu fragile. Nous démontrons la résolution réalisable en comparant la coloration de deux protéines membranaires différentes dans les cils olfactifs dans cryosections classiques et dans la préparation de visage en décrit.
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Protocol
NOTE: Toutes les procédures d'animaux ont été traités à la Clinique universitaire Charité ou Iéna en accord avec les lois de protection des animaux allemands en évitant toute souffrance indue des animaux.
1. Préparation et Solutions Dissection travail
- Solutions
NOTE: Préparer les solutions suivantes avant de commencer la dissection de l'épithélium.- Solutions pour la procédure de dissection:
- Préparer la solution de Ringer (pH 7,4) avec des concentrations de NaCl 140 mM, KCl 5 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, et 10 mM de glucose.
- Préparer une PBS - / - solution (pH 7,4) avec des concentrations de 2,68 mM de KCl, 1,47 mM de KH 2 PO 4, NaCl 136 mM et 8,1 mM de Na 2 HPO 4.
- Préparer une solution de fixateur (pH 7,2) avec des concentrations de 1 x PBS - / -, 0,2 mM de CaCl2, 4% de saccharose, et 4% de paraformaldehyde. Le saccharose dans la solution de fixateur améliore cryosectionnement et pick-up de cryosections. Stocker à -20 ° C.
- Solutions pour la procédure de coloration
- Préparer un + / + PBS solution avec des concentrations de 1 x PBS - / -, 0,48 mM de MgCl2, 0,9 mM de CaCl2.
- Préparer une PBST + / + solution avec des concentrations de 1 x PBS + / + et 0,1% de Triton X-100.
- Préparer une solution de blocage avec des concentrations de 1 x PBST + / + et 1% de gélatine.
- Solutions pour la procédure de dissection:
- Lieu de travail
- Pour le lieu de travail de dissection, utiliser un microscope de dissection avec un éclairage lumineux, ainsi que d'un stylo liquide-bloquant.
- Préparer une boîte de Pétri, rempli de la solution de Ringer, et des lames de verre adhésives.
- Obtenir les instruments chirurgicaux suivants: une paire de ciseaux chirurgicaux avec une forte et une pointe émoussée, une paire de ciseaux à ressort avec la forme de la pointe droite, deux pinces de forme de pointe recourbée fine et une lame de rasoir (
2. Préparation de la cloison nasale
- animaux de maison dans des cages approuvées ayant un accès régulier à la nourriture et de l'eau et le cycle jour / nuit approprié.
- Effectuer l'anesthésie dans un récipient contenant de la gaze imbibée fermé avec 100% d'isoflurane et le moniteur analgésie en testant les réflexes du pied arrière. Depuis la dislocation cervicale peut causer le sang dans les cavités nasales, décapiter directement souris anesthésiées.
- Retirer la peau pour exposer l'os de l'ensemble du crâne et le nez, et essuyer le sang et le tissu restant soigneusement avec une serviette en papier. Retirer la mâchoire inférieure et les dents de devant.
- Inciser l'os du nez dorsale bilatéralement 1-2 mm de distance parallèlement à la ligne de suture pour séparer un côté de la cloison (médiane) de la mâchoire (latéralement). Diviser le nez avec une seule coupe. Si les restes d'os et les cornets sont encore attachés à la cloison, retirez-les attentivement afin d'exposer complètement le septumsans le toucher.
- Retirez la dorsale os nasal en faisant glisser la pointe recourbée amende de une pince le long de la face dorsale de la cloison entre la cloison et l'os nasal. Appliquer une légère pression sur l'os, pousser vers le haut et le retirer.
- Pour permettre l'accès aux deux tissus du septum, un de chaque cavité, retirez délicatement le maxillaire de l'autre côté de la tête. Lors de la préparation des animaux plus âgés (P> 28), retirer la pointe de l'os frontal couvrant les bulbes olfactifs.
- Identifier l'épithélium olfactif par sa couleur légèrement jaune (figure 1B). L'épithélium respiratoire bordure est blanc et montre le mouvement des cils mobiles qui peut être vu sous le microscope de dissection. Coupez le long de la frontière entre l'épithélium olfactif et respiratoire avec une paire de ciseaux fins de printemps.
- Prolonger la coupe et séparer la cloison de la connexion ventrale à l'os du vomer. Ensuite, couper le long de la frontière entre la cloison et la lame criblée de l'ethmoïde Ose. Le septum est maintenant complètement isolé de toutes les connexions à la tête. Utilisez les positions de coupe illustrés à la figure 1C.
3. Isolement de l'épithélium olfactif pour Immunocoloration
- Passer une lame de verre adhésif dans la boîte de Pétri remplie de la solution de Ringer. Placer sur le bord de la boîte de Pétri, de sorte que la moitié de la vitre se trouve en solution (Figure 1A) de Ringer.
- Utilisez une pince pour transférer attentivement l'ethmoïde avec l'épithélium olfactif à la boîte de Pétri. Soulevez sans saisissant avec les forceps conseils.
- Prenez la lame perpendiculaire de l'ethmoïde avec une pince et d'utiliser un deuxième pour retirer soigneusement l'épithélium d'un côté de la cloison. Faites glisser la pointe courbe entre la lame perpendiculaire et l'épithélium à peler l'épithélium off.
- Soyez toujours sûr d'identifier le côté ciliaire, en cas de l'épithélium des culbutes dans la soluti de Ringersur. Si l'épithélium retourne, il ne est guère possible d'identifier le côté ciliaire après. La plupart du temps, l'épithélium se enroule avec la surface à l'intérieur ciliaire.
- Comparer la forme du tissu inscrits avec les positions de coupe de la Figure 1C. Prenez l'épithélium à une position à la frontière et tirez sur la lame de verre. Ne touchez pas la face ciliaire avec la pince pour éviter des lésions du tissu.
- Tournez le septum et répéter la procédure avec l'épithélium de l'autre côté.
- Sécher la lame de verre autour des deux morceaux de l'épithélium olfactif avec une serviette en papier et entourer le tissu avec un stylo liquide-bloquant.
- Fixer le tissu avec 150 ul solution de fixateur pendant 10 min à température ambiante. En ce qui concerne la stabilité et l'intégrité cils, utiliser de courts délais de fixation pour une variété d'anticorps testés. Au sein de ces 10 min cils sont fixés, mais probablement pas l'ensemble du tissu de l'épithélium. Ainsi, immédiatement visualiser au microscope après les scontenant procédure. Cependant, les temps peuvent varier fixants pour les anticorps individuels.
4. Protocole de coloration
REMARQUE: Manipulez le tissu très soigneusement pour préserver les structures ciliaires des neurones sensoriels olfactifs. Retirer solutions par pipetage. Ne pas tomber des solutions directement sur l'épithélium, que les forces mécaniques pourraient perturber l'amende cils. Effectuez toutes les étapes à la température ambiante sauf indication contraire.
- Retirer la solution de fixateur et laver deux fois avec du PBS + / +.
- Incuber l'épithélium pendant au moins 1 heure avec une solution de blocage.
- Préparer la solution d'anticorps primaire par dissolution de l'anticorps dans une solution de blocage (1: 200 pour les anticorps utilisés dans cette étude) et centrifuger pendant 5 min à vitesse maximale pour enlever les précipités.
- Incuber l'épithélium avec une solution d'anticorps dans une chambre humide à 4 ° CO / N.
- Laver avec du PBS épithélium + / + pendant 5 minutes au moins trois fois.
- Préparer la solution d'anticorps secondaire par dissolution de l'anticorps dans une solution de blocage (1: 500) et centrifuger pendant 5 min à vitesse maximale.
- Incuber l'épithélium avec une solution d'anticorps secondaire pendant 1 h dans une chambre sombre.
- Laver avec du PBS épithélium + / + pendant 5 minutes au moins trois fois.
- Retirer le liquide-bloquant avec une lame de rasoir ou une serviette en papier. Laver l'épithélium avec de l'eau distillée pendant 5 s.
- Préserver le tissu dans antifade réactif de montage.
NOTE: fluorescence de fond augmente rapidement dans les jours; analyse microscopique au plus tard deux jours après l'intégration en milieu de montage est donc recommandé. Une attention particulière doit être prise de ne pas presser le tissu lors de la recherche du plan focal correct, car il peut endommager gravement la préparation. En raison de la fluorescence out-of-focus, une enquête plus approfondie avec la microscopie confocale est recommandé.
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Representative Results
Épithélium olfactif en préparations de visage peut être utilisé pour étudier la localisation des protéines dans les cils des neurones sensoriels, permettant l'étude détaillée des protéines dont la localisation ne est pas claire après analyse de cryosections. Ce problème peut être illustrée par le cas de la coloration pour Kin IRRE-like protein 2 (Kirrel2). Kirrel2 (également appelé Neph3) est un membre de la superfamille des immunoglobulines (Ig) et les fonctions des protéines membranaires comme une protéine d'adhésion homophile. Il a été montré à jouer un rôle dans le guidage axonal-dans le système olfactif, et d'être exprimé dans un sous-ensemble de neurones olfactifs à une activité de 10 manière dépendant.
Immunocoloration pour Kirrel2 dans un cryosection typique à travers l'épithélium olfactif localisation de Kirrel2 dans les axones, soma et des dendrites (figure 2A) a révélé. Toutes les solutions ont été préparées comme décrit ci-dessus pour la technique de préparation en face. Bien que certains lAbeling apparaît au-dessus de la couche composée des boutons dendritiques, ciliaire localisation restait incertain après analyse de cryosections. Certains neurones exposées coloration dans et autour de leur bouton olfactive, mais cils simples étaient difficiles à identifier. En revanche, en préparation de la face de l'épithélium olfactif effectué selon le protocole décrit ci-dessus sans ambiguïté montré ciliaire localisation de Kirrel2 (figure 2B). Fait intéressant, Kirrel2 a seulement exprimé dans les cils d'un relativement petit sous-ensemble de neurones olfactifs, bien que l'analyse de cryosections colorées a montré une expression dans un pourcentage beaucoup plus élevé de neurones. En outre, la préparation de la face en n'a pas seulement démontrer ciliaire coloration en général, mais a révélé des variations dans les modes d'expression ciliaires allant de neurones avec de nombreux longs cils des neurones avec seulement quelques cils courts. Dans certaines cellules, Kirrel2 a été détecté dans le bouton dendritique, mais pas dans les cils se étendant à partir de ce bouton. Le c ause et la pertinence fonctionnelle de cette constatation reste à élucider, mais il illustre le potentiel de la préparation de la face en fournir de nouveaux éclairages sur la localisation des protéines dans le système olfactif.
En outre, nous avons effectué une immunocoloration pour le récepteur olfactif Mor-EG, qui présente une forte expression 11 ciliaire. Le récepteur est déjà clairement identifiable dans la couche ciliaire dans cryosections (figure 3A). Néanmoins, l'analyse des caractéristiques détaillées, telles que le nombre de cils par molette ou la longueur des cils individu ne est pas possible. Utilisation de la préparation en face, l'identification des franges à partir des neurones exprimant le récepteur olfactif est facilement possible (figure 3B, C). La salle de préparation du visage peut être effectuée avec des animaux d'âges différents. Même cils des animaux prénatales ont été colorées avec succès et visualisées (figure 3D).
contenu "> En préparations visage représentent donc un outil bien adapté pour analyser la morphologie ciliaire et la localisation des protéines ciliaires bien connues en détail.
Figure 1. Préparation de la tête de la souris. (A) Arrangement du lieu de travail de dissection. Boîte de Pétri est rempli avec la solution de Ringer et titulaire d'un lame de verre adhésif. Les instruments chirurgicaux sont recommandées pour la préparation en face. (B) Après avoir enlevé la moitié de la tête de la souris, le septum est exposé. Le septum est recouvert d'épithélium olfactif (OE) et l'épithélium respiratoire (RE). OB: bulbe olfactif, V:. Organe voméronasal (C) Pour isoler la partie de la cloison bordée de l'épithélium olfactif, couper la cloison le long des lignes démontré avec une paire de ciseaux fins. s: //www.jove.com/files/ftp_upload/52299/52299fig1large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Comparaison des Kirrel2 immunocoloration cryosections et en préparations de visage. (A) l'image confocale (projection maximale) d'un 60 (P60) cryosection de jour postnatal immunocolorées pour Kirrel2 révèle la localisation des protéines dans les neurones sensoriels olfactifs. Boutons olfactifs simples montrent une forte coloration et Kirrel2 localisation dans les cils est supposé (astérisque), mais incertain. (B) l'image confocale (projection maximale) d'un épithélium P65 olfactive en préparation face présente une coloration Kirrel2 clairement dans les cils d'un sous-ensemble de neurones sensoriels olfactifs . (Barres d'échelle, 10 um)9 / 52299fig2large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Comparaison des Mor-EG immunocoloration cryosections et en préparations de visage. (A) l'image confocale (projection maximale) d'un cryosection P60 immunocolorées pour le récepteur olfactif Mor-EG. Ciliaire localisation est déjà détectable. (B) de l'image confocale d'un P65 en préparation face immunocolorées pour le récepteur olfactif Mor-EG. Mor-EG est fortement exprimé dans un sous-ensemble de franges de neurones sensoriels olfactifs. Contrairement à cryosections, caractéristiques de cils concernant la durée, le nombre de cils par bouton et exacte la localisation des protéines peuvent être analysées. (C) grossissement supérieur de la zone encadrée en (B). (D) Confocl'image d'un jour al embryonnaire 18 (E18) en préparation face immunocolorées pour le récepteur olfactif Mor-EG. Coloration des cils peut être clairement vu. (barres d'échelle, 10 um) Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
| Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
| Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
| Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
| Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
| Petri dish | multiple suppliers | ||
| Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
| Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
| primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
| secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
| Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |
References
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