Introduction
Die Maus Riechepithel in der Nasenhöhle umfasst 6-10.000.000 bipolaren Riechzellen 1. Jedes olfaktorischen Neuronen wählt eine der 1200 Geruchsrezeptorgene zum Ausdruck. Der Nachweis von Geruchsstoffen beginnt mit der Geruchsstoff Bindung an einen Geruchsrezeptor 2, die dann aktiviert Adenylylcyclase Typ-III (ACIII) 3 über den Riech spezifischen G-Protein G & agr olf 4. Der resultierende Anstieg des zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP) geöffnet ein zyklisches-Nukleotid-gesteuerten (CNG), nicht selektiven Kationenkanal nach Einströmen von Ca 2+ und Na +, und anschließend Ca 2+ -Einstrom führenden führt zum Öffnen eines Ca 2+ aktivierten Cl - Kanal 5,6. Die resultierende äußere Cl - Fluß wird durch eine hohe intrazelluläre Cl erleichtert - Aufnahme, wahrscheinlich über die Na + / K + / Cl - - Cotransporter NKCC1, die Konzentration von stationären Cl beibehaltenCl - / HCO 3 - Tauscher SLC4A1, und vielleicht weitere noch zu identifizierenden Transporter 6-8.
Bipolare olfaktorischen Neuronen einzigen, unverzweigte Axone, die direkt an den Riechkolben ragen und Dendriten, die an die Oberfläche des Epithels erstreckt und endet als spezialisierten Kompartiment, dendritischen Knopf. Von diesem Knopf, 10-30 Zilien, die eine Länge von bis zu 50 bis 60 & mgr; m erreichen kann, ausgehen in den Schleim für den epithelialen Oberfläche 9. Proteine der kanonischen Signaltransduktionskaskade werden hauptsächlich in der Membran dieser Zilien lokalisiert. Die erhöhte sensorische Oberfläche des Epithels verstärkt die Fähigkeit, Geruchsstoffe. Aufgrund der Dichte der sensorischen Neuronen, die sich von Zilien benachbarten dendritischen Noppen vermischen. Diese Vermischung führt zu einer zufälligen Mischung von Härchen verschiedener Neuronen exprimieren verschiedene Geruchsrezeptoren, die auf der Oberfläche des Epithels. Der Nachweis und die Zelledere Zuteilung Zilienproteine die nur in einer Teilmenge von sensorischen Neuronen vorhanden sind, ist daher schwierig in Kryoschnitten. Darüber hinaus ist die genaue Lokalisierung solcher Proteine entlang der Zilien kaum möglich, da Kryoschnitte sind typischerweise dünner als die durchschnittliche Länge der Wimpern.
Zur Untersuchung der ciliary Lokalisierung von bisher nicht charakterisierte Membranproteine in Riechzellen aktivieren optimierten wir ein eigenes Gesicht Präparationstechnik, die die detaillierte Analyse der Proteinlokalisierung in Zilien ermöglicht. Kurz gesagt wird die Maus getötet und der Kopf aufgeteilt in der Nähe der Mittellinie. Nasenmuscheln, nasal, und frontalen Knochen entfernt werden, um das Septum freizulegen. Das Septum der olfaktorischen Teil des Epithel wird durch Schneiden alle Verbindungen in der Nasenhöhle gelöst. Nachdem an der Scheidewand in eine Petrischale mit Ringerlösung gefüllt ist, wird das Epithel ab und auf eine beschichtete Glasobjektträger übertragen geschält. Nach einer kurzen FIXATIonenschritt kann Immunofärbung Verfahren durchgeführt werden, wenn die Behandlung ist so schonend wie möglich, um eine Beschädigung der zerbrechlichen Gewebe zu vermeiden. Wir zeigen die erzielbare Auflösung durch den Vergleich der Färbung von zwei verschiedenen Membranproteinen in olfaktorischen Zilien in der klassischen Gefrierschnitten und in der beschriebenen en face Vorbereitung.
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Protocol
HINWEIS: Alle Tierversuche wurden an der Charité Universitätsklinik Jena oder in Übereinstimmung mit dem deutschen Tierpflege Gesetze Vermeidung jeder unnötige Leiden der Tiere behandelt.
1. Vorbereitung Solutions und Dissection Arbeitsplatz
- Lösungen
HINWEIS: die folgenden Lösungen vorbereiten, bevor Dissektion des Epithels.- Lösungen für die Dissektion Verfahren:
- Bereiten Ringerlösung (pH 7,4) mit Konzentrationen von 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2 und 10 mM Glucose.
- Vorbereiten einer PBS - / - Lösung (pH 7,4) in Konzentrationen von 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH 2 PO 4, 136 mM NaCl und 8,1 mM Na 2 HPO 4.
- Vorbereiten einer Fixierungslösung (pH 7,2) bei Konzentrationen von 1 × PBS - / -, 0,2 mM CaCl 2, 4% Saccharose und 4% Paraformaldehyd. Saccharose in der Fixierungslösung verbessert KryoSchneiden und Pick-up von Gefrierschnitten. Lagerung bei -20 ° C.
- Lösungen für die Färbeverfahren
- Bereiten Sie eine PBS + / + Lösung mit Konzentrationen von 1 × PBS - / -, 0,48 mM MgCl 2, 0,9 mM CaCl 2.
- Vorbereiten eines PBST + / + Lösung mit Konzentrationen von 1x PBS + / + und 0,1% Triton X-100.
- Bereiten Sie eine Blockierungslösung mit Konzentrationen von 1x PBST + / + und 1% Gelatine.
- Lösungen für die Dissektion Verfahren:
- Arbeitsplatz
- Für die Präparation am Arbeitsplatz, mit einem Binokular mit heller Beleuchtung sowie einen flüssigkeits Blocker Stift.
- Bereiten Sie eine Petrischale mit Ringerlösung und Klebeglasplättchen gefüllt.
- Besorgen Sie sich die folgenden chirurgischen Instrumenten: ein Paar chirurgische Schere mit einem scharfen und einer stumpfen Spitze, einem Paar von Feder Schere mit gerader Spitze Form, zwei Pinzette mit feinen gebogenen Spitze Form und einer Rasierklinge (
2. Herstellung der Nasenscheidewand
- Haus Tiere in zugelassenen Käfigen, die regelmäßig Zugang zu Nahrung und Wasser und geeignete Tag / Nacht-Zyklus.
- Führen Anästhesie in einem geschlossenen Gefäß mit Gaze mit 100% Isofluran und Monitor Analgesie durch Testen hinteren Fuß Reflexe getränkt. Seit Genickbruch kann Blut im Nasenhöhlen führen, direkt zu enthaupten narkotisierten Mäusen.
- Entfernen Sie die Haut, den Knochen des gesamten Schädel und Nasen aussetzen, und wischen Sie die restliche Blut und Gewebe gründlich mit einem Papiertuch. Entfernen Sie den Unterkiefer und die Vorderzähne.
- Einzuschneiden die dorsale Knochennasen bilateral in 1-2 mm Abstand parallel zu der Nahtlinie an der einen Seite der Scheidewand (medial) von dem Oberkiefer (lateral) zu trennen. Teilen Sie die Nase mit einem einzigen Schnitt. Wenn Knochenreste und Nasenmuscheln sind immer noch auf das Septum angebracht sind, entfernen Sie diese sorgfältig, um das Septum vollständig auszusetzenohne es zu berühren.
- Entfernen Sie die Rückennasenbein, indem Sie den feinen gebogenen Spitze einer Zange an der dorsalen Seite der Scheidewand zwischen Septum und Nasenbein. Mit leichtem Druck auf den Knochen, nach oben schieben und abnehmen.
- Um den Zugang zu den beiden septal Gewebe, einer aus jeder Kavität bieten, vorsichtig den Oberkiefer von der anderen Seite des Kopfes. Bei der Herstellung von älteren Tieren (P> 28), entfernen Sie die Spitze des Stirnbeins Abdeckung der Riechkolben.
- Identifizieren Sie das Riechepithel durch seine leicht gelbe Farbe (1B). Die angrenzenden Atemwegsepithel ist weiß und zeigt die Bewegung des beweglichen Zilien, die unter dem Binokular gesehen werden kann. Entlang der Grenze zwischen Geruchs- und respiratorischen Epithel Schneiden mit einem Paar von schönen Frühlings Schere.
- Erweitern Sie den Schnitt und trennen das Septum von der ventralen Verbindung zum Vomers. Dann entlang der Grenze zwischen dem Septum und Lamina cribrosa des Os ethmoidale geschnittene. Das Septum ist nun vollständig von allen Verbindungen mit dem Kopf getrennt. Verwenden Sie die in 1C gezeigt Schnittpositionen.
3. Isolierung des olfaktorischen Epithels für Immunfärbung
- Ein Klebeglasobjektträger in eine Petrischale mit Ringerlösung gefüllt ist. Ablegen Rand der Petrischale, so dass eine Hälfte des Glas liegt in der Ringerlösung (1A).
- Verwenden Sie eine Zange, sorgfältig überweisen Sie den Siebbein mit dem Riechepithel in die Petrischale. Heben Sie es ohne packte sie mit den Pinzettenspitzen.
- Besorgen Sie sich die senkrechten Platte des Siebbein mit einer Zange und mit einem zweiten, um vorsichtig die Epithel von einer Seite der Scheidewand. Schieben Sie die gebogene Spitze zwischen der senkrechten Platte und Epithel, das Epithel abziehen.
- Seien Sie immer sicher, dass die ciliary Seite identifizieren, für den Fall, das Epithel blättert in der Ringer solutiauf. Wenn das Epithel dreht, ist es kaum möglich, die ciliary Seite später identifizieren. Meist rollt das Epithel mit der ciliary Fläche im Inneren.
- Vergleichen Sie den eingeschrieben Gewebeform mit den in 1C gezeigt Schnittpositionen. Schnappen Sie sich das Epithel an einer Stelle an der Grenze und ziehen Sie sie auf den Objektträger. Mit der Zange nicht berühren ciliary Seite zu Verletzungen des Gewebes zu vermeiden.
- Drehen Sie das Septum und wiederholen Sie den Vorgang mit dem Epithel von der anderen Seite.
- Trocknen Sie die Objektträger um die beiden Stücke von Riechepithel mit einem Papiertuch und umgeben das Gewebe mit einer Flüssigkeit-Blocker Stift.
- Befestigen Sie das Gewebe mit 150 ul Fixierungslösung für 10 min bei RT. Bezüglich der Zilien Stabilität und Integrität, kurze Fixierzeiten für eine Vielzahl der getesteten Antikörper. Innerhalb dieser 10 Minuten Zilien sind fest, aber wahrscheinlich nicht die ganze Epithelgewebe. Somit sofortige Visualisierung unter dem Mikroskop im Anschluß an die sTaining Verfahren. Allerdings könnte Fixierungszeiten für einzelne Antikörper variieren.
4. Färbeprotokoll
HINWEIS: Gehen Sie mit dem Gewebe sehr sorgfältig, um ciliary Strukturen der Riechzellen zu bewahren. Lösungen entfernen durch Pipettieren. Keine Lösungen nicht fallen direkt auf das Epithel, wie mechanische Kräfte könnten die feinen Flimmerhärchen stören. Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur, wenn nicht anders angegeben.
- Entfernen Sie die Fixierungslösung und waschen Sie 2 mal mit PBS + / +.
- Inkubieren Sie die Epithel für mindestens 1 h mit Blockierlösung.
- Planen primärer Antikörperlösung durch Lösen des Antikörpers in Blockierungslösung (1: 200 für die in dieser Studie verwendeten Antikörper) und Zentrifuge 5 min bei voller Geschwindigkeit, um irgendwelche Niederschläge zu entfernen.
- Inkubieren Sie die Epithel mit Antikörperlösung in einer feuchten Kammer bei 4 ° CO / N.
- Wasch Epithel mit PBS + / + 5 min bei mindestens 3 mal.
- Bereiten sekundäre Antikörperlösung durch Lösen des Antikörpers in Blocking-Lösung (1: 500) und Zentrifuge 5 min bei voller Geschwindigkeit.
- Inkubiere das Epithel mit sekundären Antikörperlösung für 1 Stunde in einem dunklen Raum.
- Wasch Epithel mit PBS + / + 5 min bei mindestens 3 mal.
- Entfernen Sie die Flüssigkeit Blocker mit einer Rasierklinge oder einem Papiertuch. 5 s Waschen Sie das Epithel mit destilliertem Wasser.
- Erhalten Sie die Gewebe in Antifade Montage Reagenz.
HINWEIS: Die Hintergrundfluoreszenz erhöht sich schnell innerhalb von Tagen; mikroskopische Analyse spätestens 2 Tage nach der Einbettung in Eindeckmedium wird daher empfohlen. Besondere Sorgfalt muss nicht getroffen werden, um das Gewebe zu quetschen bei der Suche der richtigen Brennebene, da es schwer beschädigt werden kann die Vorbereitung werden. Aufgrund out-of-focus-Fluoreszenz sind weitere Untersuchungen mit Konfokalmikroskopie empfohlen.
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Representative Results
Riechepithel en face Zubereitungen können verwendet werden, um die Lokalisierung von Proteinen in den Zilien der Sinneszellen zu untersuchen, so dass die detaillierte Untersuchung von Proteinen, deren Lokalisierung ist unklar, nach Analyse von Gefrierschnitten werden. Dieses Problem kann in dem Fall der Färbung für Kin IRRE-like protein 2 (Kirrel2) beispielhaft dargestellt werden. Kirrel2 (auch genannt Neph3) ist ein Mitglied der Immunoglobulin (Ig) Superfamilie von Membranproteinen und fungiert als homophile Adhäsion Protein. Es wurde gezeigt, dass eine Rolle in Axon-Führung im olfaktorischen System spielen, und bei einem Teil der olfaktorischen Neuronen in einer Aktivität abhängigen Weise 10 ausgedrückt werden.
Immunfärbung Kirrel2 in einem typischen Kryoschnitt durch Riechepithel ergab Lokalisation Kirrel2 in Axonen Soma und Dendriten (2A). Alle Lösungen wurden wie oben für die en face Herstellungstechnik hergestellt. Obwohl einige lAbeling erscheint oben auf der Schicht der dendritischen Knöpfen besteht, ciliary Lokalisierung unsicher blieb nach der Analyse von Gefrierschnitten. Einige Neuronen zeigte Färbung in und um ihre Riechknopf, aber einzelne Wimpern waren schwer zu identifizieren. Im Gegensatz dazu en face Herstellung Riechepithel geführt gemäß dem oben beschriebenen Protokoll eindeutig zeigte ciliary Lokalisation Kirrel2 (2B). Interessanterweise wurde Kirrel2 nur in Cilien einer relativ kleinen Teilmenge der olfaktorischen Neuronen exprimiert, obwohl Analyse von gefärbten Kryoschnitte zeigten eine Expression in einem viel größeren Anteil der Neuronen. Darüber hinaus ist die en face Vorbereitung nicht nur ciliary Färbung zeigen im Allgemeinen, sondern zeigte Schwankungen ciliary Expressionsmuster von Neuronen mit vielen langen Wimpern zu Neuronen mit nur wenigen Zilien. In einigen Zellen wurde Kirrel2 in dendritischen Knopf detektiert, aber nicht in Cilien, die sich von diesem Knopf. Die c ause und funktionelle Relevanz dieser Ergebnisse ist noch nicht geklärt, aber es ist das Potenzial der en face Vorbereitung neue Einblicke in Proteinlokalisierung im olfaktorischen System bieten illustriert.
Darüber hinaus eine Immunfärbung führten wir für den Geruchsrezeptor Mor-EG, die starker ciliary Ausdruck 11 zeigt. Der Rezeptor ist bereits in der ciliary Schicht in Gefrierschnitten (3A) eindeutig identifizierbar. Trotzdem ist eine Analyse der detaillierten Merkmale wie die Anzahl der Härchen pro Knopf oder der Länge der einzelnen Wimpern nicht möglich. Mit der en face Vorbereitung, Identifikation von Zilien von Neuronen des olfaktorischen Rezeptor exprimieren, ist problemlos möglich (3B, C). Die en face Präparat kann mit Tieren unterschiedlichen Alters durchgeführt werden. Auch Zilien von pränatalen Tieren wurden erfolgreich angefärbt und sichtbar gemacht (Abbildung 3D).
Inhalt "> En face Präparate stellen daher ein Werkzeug gut geeignet, um die ciliary Morphologie und die Lokalisierung von bekannten Zilienproteine im Detail analysieren.
Abbildung 1. Herstellung der Maus Kopf. (A) Anordnung der Dissektion Arbeitsplatz. Petrischale wird mit Ringerlösung gefüllt und hat einen Kleberglasträger. Die chirurgischen Instrumente sind en face Vorbereitung empfohlen. (B) Nach dem Entfernen der Hälfte des Mauskopf wird das Septum ausgesetzt. Das Septum wird mit Riechepithel (OE) und respiratorischen Epithels (RE) beschichtet. OB: Riechkolben, V:. Vomeronasalorgan (C), um den Teil des Septum mit Riechepithel ausgekleidet isolieren, schneiden Sie die Scheidewand entlang der Linien gezeigt, mit einem Paar von einer feinen Schere. s: //www.jove.com/files/ftp_upload/52299/52299fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. Vergleich der Kirrel2 Immunfärbung in Gefrierschnitten und en face Zubereitungen. (A) Die konfokale Bild (maximale Projektion) einer postnatalen Tag 60 (P60) Kryoschnitt für Kirrel2 immun zeigt Proteinlokalisierung in Riechzellen. Einzel olfaktorischen Knöpfe zeigen starke Färbung und Kirrel2 Lokalisierung in Zilien wird angenommen (Sternchen), aber unsicher. (B) Die konfokale Bild (maximale Projektion) eines P65 Riechepithel en face Vorbereitung zeigt klar Kirrel2 Färbung in Zilien einer Teilmenge von Riechzellen . (Maßstabsbalken, 10 & mgr; m)9 / 52299fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Vergleich der Mor-EG-Immunfärbung in Gefrierschnitten und en face Zubereitungen. (A) Die konfokale Bild (maximale Projektion) eines P60 Kryoschnitt für den Geruchsrezeptor Mor-EG immun. Ciliary Lokalisierung ist bereits erkennbar. (B) Die konfokale Bild eines P65 en face Vorbereitung auf die Geruchsrezeptor Mor-EG immun. Mor-EG ist stark in Zilien einer Teilmenge von Riechzellen exprimiert. Im Gegensatz zu den Gefrierschnitten, Zilien Eigenschaften bezüglich Länge, Anzahl der Zilien per Drehknopf und genaue Lokalisierung von Proteinen untersucht werden. (C) Höhere Vergrößerung des Boxed Bereich (B). (D) Confocal Bild eines embryonalen Tag 18 (E18) en face Vorbereitung auf die Geruchsrezeptor Mor-EG immun. Färbung von Härchen kann deutlich gesehen werden. (Maßstabsbalken, 10 um) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
| Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
| Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
| Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
| Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
| Petri dish | multiple suppliers | ||
| Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
| Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
| primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
| secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
| Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |
References
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Wong, S. T., et al. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27 (3), 487-497 (2000).
- Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20 (1), 69-81 (1998).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17 (4), 681-693 (1996).
- Reisert, J., Lai, J., Yau, K. W., Bradley, J. Mechanism of the excitatory Cl- response in mouse olfactory receptor neurons. Neuron. 45 (4), 553-561 (2005).
- Hengl, T., et al. Molecular components of signal amplification in olfactory sensory cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 6052-6057 (2010).
- Smith, D. W., Thach, S., Marshall, E. L., Mendoza, M. G., Kleene, S. J. Mice lacking NKCC1 have normal olfactory sensitivity. Physiolog., & Behavior. 93 (1-2), 44-49 (2008).
- Menco, B. P.
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127 (5), 1057-1069 (2006).
- Baumgart, S., et al. Scaffolding by MUPP1 regulates odorant-mediated signaling in olfactory sensory neurons. Journal Of Cell Science. 127 (11), 2518-2527 (2014).
- Strotmann, J., Wanner, I., Krieger, J., Raming, K., Breer, H. Expression of odorant receptors in spatially restricted subsets of chemosensory neurones. Neuroreport. 3 (12), 1053-1056 (1992).
- Jenkins, P. M., McEwen, D. P., Martens, J. R. Olfactory cilia: linking sensory cilia function and human disease. Chemical Senses. 34 (5), 451-464 (2009).
- Tadenev, A. L., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome protein-8 (BBS8) perturbs olfactory function, protein localization, and axon targeting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (25), 10320-10325 (2011).
