Summary
Le but de l'échantillon Orientation Tag (spot) est de fonctionner comme un outil d'orientation pour aider à l'identification de tissus individu dans des blocs de paraffine multi-tissus. Ces protocoles démontrent comment il est construit à partir de matériaux facilement communes d'histologie à faible coût et sert de repère visuel fiable dans des blocs de paraffine et des sections.
Abstract
Blocs de paraffine multi-tissus fournissent une analyse à haut débit avec une efficacité accrue, l'uniformité expérimental, et réduit le temps et le coût. microarrays de tissu forment la majorité des blocs de paraffine multi-tissus, mais de plus en plus, les chercheurs utilisent des blocs non-revêtu contenant de grandes tissus provenant de plusieurs individus qui peuvent fournir de nombreux avantages de matrices tissulaires sans investissement important dans la planification et de l'équipement. Un élément essentiel d'une analyse multi-tissulaire est la méthode d'orientation permettant d'identifier chaque individu tissu. Bien que les méthodes existent pour maintenir l'orientation et l'identification des tissus dans des blocs multi-tissus appropriée, la plupart ne sont pas bien adaptés à des blocs non-revêtu, peuvent consommer de l'espace précieux dans un tableau et / ou sont difficiles à produire en laboratoire d'histologie standard. Le spécimen Orientation Tag (spot) est un outil d'orientation simple et peu coûteuse qui est clairement visible dans des blocs de paraffine et toutes les sections de tissus for l'identification de l'échantillon fiable dans les présentations disposés et non disposés. La tache présente des avantages par rapport aux méthodes existantes d'orientation pour les blocs non-revêtu car il ne nécessite pas de modification directe au tissu et permet une certaine souplesse dans l'arrangement des morceaux de tissu.
Introduction
La possibilité d'intégrer des échantillons de tissus provenant de plusieurs individus dans un seul bloc de paraffine permet une comparaison facile side-by-side entre les traitements et les individus, élimine la variabilité entre les diapositives, et réduit le coût et la charge de travail de la coupe et coloration de spécimens. Ces blocs multi-tissus sont généralement produites soit comme matrices tissulaires (TMA) ou des blocs de paraffine contenant des tissus à partir de plusieurs individus dans une disposition non-tableau. Maintien de l'identité de l'échantillon est critique pour le succès de toute analyse multi-tissu. Les chercheurs ont été en utilisant TMA depuis leur développement pour améliorer l'efficacité de l'analyse, de réduire les variations entre les diapositives, de conserver les ressources de tissus précieux, et de réduire le temps et le coût des expériences 1. L'orientation correcte des TMA peut être accompli en utilisant une variété de méthodes, y compris les espaces, lignes ou colonnes entre carottes de tissu 2-4, disposition asymétrique des groupes de base 3, 5 (par exemple, control vs traitement), "balise" noyaux 6, et de noyaux d'orientation désignés situés à l'extérieur de la matrice TMA 3. Bien que ces méthodes fonctionnent bien pour les TMA, la plupart consomment précieux espace noyau TMA et TMA avec les lacunes et les espaces comme des identificateurs peuvent devenir source de confusion comme noyaux de tissus sont épuisées au fil du temps. En outre, ces méthodes ne sont pas appropriées pour une utilisation dans des blocs multi-tissus sans un format de tableau car elles reposent sur des anomalies dans le modèle bien ordonnée de noyaux de microréseaux uniformes comme identifiants. La plupart des blocs multi-tissus non-revêtu doivent accueillir tissus non uniformes et, par définition, ne pas afficher la grille de tableau structuré qui rend ces aberrations jalonnent.
Bien qu'il existe de nombreux avantages à l'aide d'une TMA, un des plus grands inconvénients est la petite taille des noyaux qui ne sont pas toujours représentatives du tissu largement hétérogène 1. Blocs multi-tissus non RAID fournissent la plupart des til bénéficie d'une TMA, mais contient des échantillons de tissus, grandes ou organes entiers provenant d'études animales. microarrays de tissu en utilisant des conducteurs individuels ont différentes concordance avec des sections entières de tissus basés sur la protéine d'intérêt et beaucoup nécessitera plusieurs cœurs pour accroître la concordance 7-11. En raison de la complexité et de la nature hétérogène de certains phénotypes de biomarqueurs, TMA utilise même un grand nombre de noyaux (> 10) peut encore être insuffisante et peut nécessiter des méthodes autres que les puces à ADN pour l'analyse 8. En outre, la construction TMA est consommatrice de temps, techniquement exigeante et nécessite le coût initial et l'investissement ou l'accès à un arrayer tissus. Blocs multi-tissus non RAID peuvent être effectués dans un laboratoire de base avec beaucoup moins de temps et d'effort et est une alternative valable pour les études qui nécessitent plus de tissu que les tableaux permettent ou comme un moyen de réduire les coûts et de simplifier l'analyse.
blocs de non RAID multi-tissus exigent de même une ou fiableientation marqueur pour suivre l'identification de l'échantillon, cependant, le développement de ces marqueurs a été limitée. Une grande partie de la littérature décrivant l'orientation de tissu met l'accent sur l'orientation physiologique approprié pour l'incorporation des morceaux de tissu, comme un tatouage le tissu avec de l'encre 12, de pré-enrobage des tissus dans de la gélose-gélatine avant le traitement 13, et le marquage de certains tissus avec des encoches 14 ou des sutures 15 . Bien que fonctionnel, ces méthodes ne sont pas idéales comme marqueurs dans des blocs multi-tissus en raison de leurs limitations. Une suture sera sectionné par rapidement et peut ne pas être visible dans chaque section. Techniques utilisant l'agar-gélatine peut maintenir le tissu dans une orientation correcte pendant le traitement et l'incorporation de pré-enrobage, mais ne fournit pas une indication visuelle de la différence entre plusieurs échantillons dans le bloc de paraffine et diapositives. Encoches ou colorant sur le tissu peuvent compliquer l'analyse ou obstruer détails morphologiques importantes. Alternativement, l'identité de tissusdans un bloc non-revêtu multi-tissus peut être maintenue grâce à l'enrobage des morceaux de tissu dans un arrangement asymétrique, mais cela nécessite 3 ou plusieurs morceaux de tissu et peut ne pas permettre une disposition optimale des tissus pour l'analyse.
Le spécimen Orientation Tag (spot) a été développé comme une méthode facile et peu coûteux d'identifier clairement les tissus dans des blocs multi-tissus et offre de nombreux avantages par rapport aux méthodes d'orientation existants. L'endroit est un petit, coloré, noyau composé de Hydroxyéthyl gel de traitement agarose et le tissu teinture de marquage, et infiltré avec de la paraffine (figure 2C). Le noyau de Spot est intégré sur la fin prochaine d'un tissu unique dans un bloc de paraffine multi-tissus et apparaît comme un point de couleur vive dans le bloc et dans chaque section (figure 1A - D), en indiquant clairement la bonne orientation du bloc et sections pour l'identification de tissus facile.
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Protocol
1. Construction de la tache
- Ajouter 50 mg de sérum-albumine bovine (BSA) à 1 ml tissu colorant de marquage dans un tube conique de 15 ml ou 2 ml tube de microcentrifugation et vortex pendant 1 minute ou jusqu'à dissolution complète.
Remarque: Pour ce protocole, utilisez biochimique année BSA. Alors que d'autres grades et des puretés ont pas été testés, il est prévu que de qualité et de pureté ne seraient pas avoir un impact significatif sur le succès de la tache. - Heat 9 ml hydroxyéthyle gel de traitement agarose dans un tube de 15 ml conique dans un micro-ondes à puissance de 30% pour les incréments de 10 secondes jusqu'à ce que le gel soit complètement fondu.
- Combinez le gel de traitement fondu et la solution colorant de BSA dans un seul tube de 15 ml conique et bien mélanger avec une pipette. Vortex la solution.
- Placez le tube conique dans un réfrigérateur pendant quelques heures ou jusqu'à ce que solide.
- Utilisez un long, mince, une spatule ou d'une sonde métallique pour libérer doucement le bouchon de gel de couleur du tube conique.
- Utiliser un scalpel ou une lame de rasoir à cut le gel brancher transversalement en 5 mm d'épaisseur sections. Retirez les extrémités arrondies et éliminer en tant que déchets (figure 2A).
- Placez les sections de bouchon de gel plats dans des cassettes d'histologie et maintenir 70% d'éthanol pendant 1 heure. Changer la solution d'éthanol à 70% tous les 2-4 heures pendant au moins 3 changements sur une période de 24 heures.
- Manuellement traiter les sections de gel à travers une série d'éthanol (1 h chacun: 70% d'éthanol, 80% d'éthanol, 95% d'éthanol, éthanol à 100% (variations 3x), puis clairement à dégager une solution 3x pendant 1 heure chacun (par exemple, des hydrocarbures aliphatiques ( xylènes substitut)) ont été utilisés dans ce protocole, les xylènes sont également acceptables), et infiltrent avec de la paraffine fondue (3x pendant 1 heure chacun), soit manuellement, soit dans un processer de tissu.
Remarque: Avant de déshydratation complète éthanol à 100%, le colorant pourrait fuir de la prise de gel qui pourrait affecter d'autres tissus et les réactifs liquides dans un processeur de tissus automatisé. En tant que tel, la réhydratation manuel est fortement recommandé, le traitement automatisé est toutefois équallié efficace. - Sections multiples Intégrer transformés de gel à l'aide de paraffine norme intégrant la méthodologie (figure 2B). Autoriser les blocs refroidir et durcir, puis revenir à température ambiante.
- Utiliser une aiguille de perforation cutanée de la taille souhaitée pour enlever les noyaux de repérer des sections de gel embarqués jusqu'à ce que le bloc est épuisé (figure 2C). Un bloc unique peut fournir jusqu'à 20 x 2 mm 2 noyaux. Stocker les noyaux dans un endroit frais. Utilisez poinçon cutané dans ce Protocole, voir les figures, de 1,5 mm (figures 1D et 2D) ou 2 mm (figures 1B, 1C et 2C).
2. Utilisation de taches aux blocs Orient non déployées
- Créer un schéma d'orientation de tissu d'indiquer les emplacements souhaités et les identités de tous les morceaux de tissu individuels à être incorporés en même temps, et l'emplacement du spot.
REMARQUE: Le schéma d'orientation des tissus est une carte illustrée qui comprend le pendroits effective sur tous les morceaux de tissu étiquetés avec des identifiants et l'emplacement de la place. Il peut être créé par voie électronique ou peut être dessiné à la main. Le schéma devrait être créé en utilisant la méthode que convient le mieux le technicien et chercheur en utilisant le produit final. Cette carte servira de guide pour le chercheur sorte que les échantillons peuvent être facilement identifiés lors de l'analyse microscopique. La carte utilisée dans ce protocole a été tracé manuel. Il représente une lame de microscope bloc de tissu et le verre avec chaque morceau de tissu et la tache dessiné et marqué dans la même position que le bloc de tissu réel et toboggan. - Traiter les morceaux de tissu normalement, veiller à ce qu'ils restent correctement identifiés tout au long des étapes de traitement et extrapolation. Pour ce protocole, traiter les tissus pendant 1 heure chacun à: 70% d'éthanol, 80% d'éthanol, 95% d'éthanol, éthanol à 100% (variations x3), hydrocarbures aliphatiques (xylènes de substitution) (variations x3), et fondu infiltration des tissus paraffine à 60 ° C (variations x3).
NOTE: All tissus doivent être traitées suivant les procédures de laboratoire d'histologie standard. Cela peut être variable due à la procédure de laboratoire individuel, la taille et le type de tissu, mais ce ne sera pas affecter la capacité à utiliser l'endroit comme un outil d'orientation. - Disposer les morceaux de tissu sur le poste d'enrobage dans les emplacements corrects assignées conformément au schéma d'orientation tissulaire. Utilisez le schéma d'orientation de tissu comme une référence pour guider le technicien sur la façon d'organiser les repérer et de tissus pièces dans chaque bloc.
NOTE: Dans ce protocole, le technicien intégration mis la carte d'orientation dessinée à la main à côté de la station d'enrobage et arrangé les morceaux de tissu sur la station d'enrobage exactement de la même disposition que dessiné sur le diagramme. Cela garantit que tous les morceaux de tissu restent correctement identifiable dans le produit final. Ceci est absolument essentiel à l'utilisation réussie de blocs multi-tissus. - Vérifiez que le noyau de tache est plus grand que tous les morceaux de tissu pour être intégrés dans le bloc.
- Incluez les morceaux de tissu et puis le spot sur la fin (transversale) dans les emplacements appropriés selon le schéma d'orientation des tissus en utilisant la méthodologie d'intégration standard. Au besoin, tenir la première place (s) debout avec des pinces jusqu'à ce que la paraffine a solidifié assez que l'endroit (s) ne tombe pas (1-2 min).
- sections de la Section et aux taches paraffine avec la tache en utilisant une méthodologie standard.
- Laisser les sections de flotter sur un bain-marie à 40 ° C et respectées sur une lame de verre chargé positivement (diapositives non chargés ont pas été testées). Sécher les lames dans une étuve à 60 ° C pendant au moins 20 min.
- Placer les lames dans une coloration automatique et traité par les réactifs suivants: (xylènes xylenes 05.01 min, les xylènes 2 et 3-2 min, chacun), 100% d'éthanol (2 min), 95% d'éthanol (1 min), 80 % d'éthanol (30 sec), 70% d'éthanol (30 sec), l'eau du robinet (2 min), l'hématoxyline (1,5 min), l'eau du robinet (3 min), l'alcool de l'acide (1 min), l'eau du robinet (2 min ), blréactif de uing (1 min), eau courante (2 min), 80% d'éthanol (30 s), éosine (1 min), eau courante (10 sec), 80% d'éthanol (1 min), 100% d'éthanol (3 changements, 2 min chacun), les xylènes (3 changements, chaque 30 sec).
- Couvrir les lames avec des lamelles de verre, montées avec un milieu de montage.
NOTE: Dans ce protocole, l'histotechnician sectionné les blocs de paraffine sur un microtome en 5 sections um. Pour ce protocole, nous avons utilisé une coloration automatique, mais l'égalité des résultats peuvent être obtenus par la coloration manuelle.
3. repérer dans les TMA (TMA Kit Manuel)
- Créer un schéma d'orientation de tissu, comme décrit dans 2.1 et affecter l'emplacement souhaité (s) de la tache.
- Remplissez le moule avec de la paraffine fondue TMA à un poste d'enrobage. Comme le moule est de refroidissement, intégrer l'endroit (s) sur la fin dans les marges du moule TMA aux endroits souhaités indiquées par le schéma d'orientation des tissus. Au besoin, tenir la première place (s) debout avec des pinces jusqu'à ce que la paraffine has solidifié assez que l'endroit (s) ne tombe pas (1-2 min).
- Assemblez les noyaux TMA selon les directives du fabricant et à l'égard de l'emplacement de la tache (s) dans les marges d'un tableau (figure 2D), et suivre les protocoles de sectionnement et de coloration standard.
NOTE: S'il vous plaît voir l'étape 2.6 pour voir les méthodes de sectionnement et de coloration utilisés dans ce protocole.
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Representative Results
Le spot apparaît comme un tour, point de couleur vive dans le bloc de paraffine (Figure 1A et 2D), dans toutes les sections de paraffine, et reste sur la lame de verre à travers la procédure H & E ou la coloration IHC (figures 1B - 1D et 2D). Cette évidentes aides de repère visuels deux l'histotechnician et chercheur à identifier chaque pièce de tissu individuelle et simplifie la communication comme l'histotechnician peuvent utiliser ce repère visuel pour indiquer l'agencement des morceaux de tissu au chercheur la collecte de données de la diapositive au microscope. Le schéma d'orientation de tissu doit être incluse avec les diapositives fournies au chercheur et a expliqué en détail donc il n'y aura pas de confusion lors de l'analyse microscopique. Figure 2A montre les résultats de sectionnant les solidifiés, coloré bouchons de gel d'agarose. Figure 2B montre le résultat de l'intégration le bouchon de gel d'agarose en coupes dans un bloc de paraffine. Figure 2C montre les résultats de l'aide d'un poinçon dermique pour produire des noyaux de SPOT.
Figure 1: Spot noyaux sont facilement créés et facilement visibles dans les blocs de tissus et les lamelles (A) des taches sont clairement visibles dans le bloc intégré.. (B) spots permettent de faciliter l'orientation et l'identification de tissus pour des blocs multi-tissus contenant des tissus figurant similaires de différents groupes particuliers / traitement. (C) spots permettent à chaque noyau d'un tissu microarray à être utilisée pour des échantillons de tissus précieux. (D) Vue au microscope de la tache à côté d'un noyau TMA. Les flèches indiquent l'endroit. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 
Figure 2:. Préparation de noyaux SPOT (A) solidifiés hydroxyéthyle bouchons agarose sont libérés de tubes Eppendorf et coupées transversalement en tranches de 5 mm. (B) tranches multiples sont intégrés dans un seul bloc de paraffine et (C) un poinçon dermique est utilisé pour enlever les taches noyaux. (D) taches sont intégrés dans les marges d'un tissu microarray. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Préparation réussie et l'utilisation des taches nécessite le respect attentif à quelques étapes techniques. Fusion de l'agarose d'hydroxyéthyle doit se faire lentement et à basse température. Melting rapidement à haute température peut entraîner une certaine dégradation de la gélose pour moins de résultats optimaux. Lors de la coupe des bouchons de colorant chargées en morceaux destinés à la transformation, en sorte que l'épaisseur de chaque pièce est supérieure à 4,5 mm et ne dépasse pas 7 mm. Les extrémités arrondies sont éliminés en tant que déchets car ils ne sont pas uniformément 5 mm d'épaisseur. Pièces de moins de 5 mm se traduira par la création de taches plus courtes qui risquent d'être épuisé en sectionnant avant l'épuisement de la matière de tissu adjacent. Pour assurer le spot est présent à travers l'ensemble du bloc, les pièces doivent être au moins 4,5-5 mm. Pour assurer une bonne infiltration de cire, toutefois, les pièces ne doivent pas dépasser 7 mm. Lorsque la déshydratation des morceaux de colorants pour la cire d'infiltration, le colorant est lessivé légèrement sur les morceaux dans le Lower concentrations d'éthanol. Le lessivage n'a pas d'impact du produit final, les taches sera toujours intensément coloré et bien visible. Le lessivage pourrait avoir un impact d'autres tissus, mais, si les coupes de tissus ne devrait pas être traitée dans les mêmes salles de bains que les pièces de colorant jusqu'à ce que les morceaux ont atteint 100% d'éthanol.
Lorsque vous placez les taches dans les blocs disposés, veiller à ce que tous les autres le placement de tissu est terminée avant d'ajouter l'endroit. Depuis le spot est infiltré avec de la cire de paraffine, la cire fondue du bloc bénéficiaire peut commencer à fondre le noyau de repérer si elle est autorisée à s'asseoir trop longtemps. Disposer tous les morceaux de tissu d'abord, ajouter le noyau de repérer et transférer immédiatement le bloc à une plaque froide pour éviter toute fusion de la tache.
Le spot peut être modifiée pour s'adapter à la plupart des workflows histologie de laboratoire. La couleur du colorant peut être changé pour un contraste optimal pour chaque application. Colorant rouge ou noir produit net contraste élevé sur des lames IHC colorées, wien que la tache rouge est pas aussi accrocheur dans une diapositive H & E teinté de sections de rein disposées. Pour les lames H & E, taches vertes ou jaunes ont tendance à offrir un contraste plus élevé. En outre, sous la chaleur élevée au cours des processus tels que la chaleur induite par la récupération de l'antigène pour l'immunohistochimie, l'agarose d'hydroxyéthyle fait fondre. BSA est ajouté au cours de la préparation de colorant endroit pour maintenir une tache de couleur vive sur le coulisseau, même après des méthodes de récupération de chaleur élevé. Si les diapositives ne seront pas exposés à une forte chaleur, la BSA peut être omise pour accélérer la production de place.
Les aspects les plus critiques de l'utilisation de Spot sont dans la création et l'entretien d'une carte claire et concise l'orientation et l'adhésion fidèle à la carte lors de la passation de la place. Lorsqu'il est utilisé correctement, le spot réduit la confusion sur arrangement de tissus et simplifie la communication entre les techniciens et les chercheurs, que le technicien intégration peut simplement indiquer l'emplacement de la tache et la relation de l'tissues à elle sur une carte. Spot est clairement visible dans toutes les étapes de préparation des lames permettant section très cohérente de montage sur des lames pour faciliter l'analyse en aval. Contrairement aux marqueurs physiologiques, l'endroit est clairement visible dans chaque section et ne modifie pas le tissu en aucune façon, empêcher l'introduction d'objets ou d'obstruction de la morphologie. Contrairement à la méthode de l'intégration des tissus asymétrique, l'endroit permet aux techniciens et chercheurs de souplesse dans l'agencement de tissus pour optimiser l'analyse visuelle sous le microscope. Dans les TMA, l'endroit peut être placé à l'extérieur du réseau principal, éliminant le besoin d'espaces vierges, assemblées asymétriques, ou des noyaux de balises, permettant à l'ensemble du réseau à être composé de sections de tissus précieux. La tache peut également être utilisé pour indiquer la direction anatomique (par exemple, distale ou proximale) d'échantillons de tissus. Le spot est une solution simple et peu coûteuse pour une orientation facile et cohérente des échantillons de tissus pendant la construction et unnalyse des blocs multi-tissus et TMA.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Brent Harris pour fournir un examen critique du manuscrit. Ces études ont été menées à l'Lombardi Comprehensive Cancer Centre histopathologie et de tissus ressource partagée qui est financé en partie par le NIH / NCI subvention P30-CA051008. Le contenu est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les positions officielles de l'Institut national du cancer ou de la National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histogel Specimen Processing Gel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html |
| Tissue Marking Dye | Triangle Biomedical Sciences, Inc. | TMD-5 | Any tissue marking dye would most likely be sufficient. |
| Arraymold Kit A 2 mm (60 core) | Arraymold | 20015A | Any manual tissue arrayer would work similarly. |
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