Spot Riktig Tissue hver gang i Multi-vevsblokker

Summary

Formålet med prøveorientering Tag (spot) er å fungere som en orientering verktøy til hjelp i enkelte vev identifikasjon i multi-vev parafinblokker. Disse protokollene demonstrere hvordan den er konstruert lett fra vanlige og lave kostnader histologiske materialer og fungerer som en pålitelig visuell markør i parafinblokker og seksjoner.

Abstract

Multi-vev parafinblokker gir høy gjennomstrømning analyse med økt effektivitet, eksperimentell ensartethet, og redusert tid og kostnader. Microarray utgjør flertallet av multi-vev parafinblokker, men i økende grad, er forskere med ikke-kledd blokker som inneholder større vev fra flere personer som kan gi mange av fordelene med microarray uten betydelige investeringer i planlegging og utstyr. En kritisk komponent i en fler vev analyse er orienteringen metoden som brukes for å identifisere hver enkelt vev. Selv om metoder finnes for å opprettholde riktig orientering og identifisering av vev på fler vevsblokker, de fleste er ikke godt egnet til ikke-kledd blokker, kan forbruke verdifull plass i en matrise og / eller er vanskelig å produsere i standard histologi laboratorium. Den prøveorientering Tag (spot) er en enkel, rimelig orientering verktøy som er godt synlig i parafinblokker og alle vevsdelene for pålitelig prøven identifikasjon i kledd og ikke-kledd oppsett. Spot gir fordeler i forhold til eksisterende orienterings metoder for ikke-kledd blokker som det ikke krever noen direkte endring i vevet og gir rom for fleksibilitet i ordningen av vev stykker.

Introduction

Muligheten til å legge inn vevsprøver fra flere personer i en enkelt parafinblokken muliggjør enkel side-by-side-sammenligning mellom behandlingene og enkeltpersoner, eliminerer variasjon mellom lysbilder, og reduserer kostnadene og arbeidsmengden seksjonering og flekker prøver. Disse fler vevsblokker fremstilles typisk som enten microarray (TMA) eller parafinblokker inneholdende vev fra flere individer i en ikke-matrise layout. Vedlikehold av prøven identitet er avgjørende for å lykkes i enhver multi-vev analyse. Forskere har brukt TMA siden deres utvikling for å forbedre effektiviteten i analysen, redusere variasjon mellom lysbilder, spare verdifulle vev ressurser og redusere tid og kostnader for eksperimenter ^en. Riktig orientering av TMA kan oppnås ved hjelp av en rekke metoder, inkludert tomme områder, rader eller kolonner mellom vev kjerner ^2-4, asymmetrisk arrangement av kjernegruppene ^{3, 5} (f.eks kontrol vs. behandling), "beacon" kjerner ^6, og utpekte orientering kjerner som ligger utenfor TMA matrix ^3. Selv om disse metodene fungerer godt for TMA, mest forbruke verdifull TMA kjerneområder og TMA med hull og mellomrom som identifikatorer kan bli forvirrende som vev kjerner er utslitt over tid. I tillegg er disse metodene er ikke egnet for bruk i fler vevsblokker uten en rekke format fordi de er avhengige av anomalier i tett organisert mønster av ensartede microarray kjerner som identifikatorer. De fleste ikke-kledd multi-vevsblokker må imøtekomme uensartede vev og per definisjon, ikke vis strukturert rekke rutenett som gjør at disse avvikene skiller seg ut som landemerker.

Selv om det er mange fordeler med å bruke en TMA, en av de største ulempene er den lille størrelsen på kjernene som ikke alltid er representativ for i hovedsak heterogent vev ^1. Ikke-kledd multi-vevsblokker gi mange av tHan drar av en TMA, men inneholder større vevsprøver, eller hele organer fra dyrestudier. Microarray for ved hjelp av enkle kjerner har varierende samsvar med hele vevssnitt basert på protein av interesse og mange krever flere kjerner for økt samsvar ^7-11. På grunn av kompleksiteten og heterogene natur noen biomarkør fenotyper, ved bruk av TMA og med et stort antall kjerner (> 10) fortsatt kan være utilstrekkelig og kan kreve andre enn mikromatriser for analyse ⁸ metoder. I tillegg er TMA bygging tidkrevende, teknisk krevende, og krever den opprinnelige prisen og investering i eller tilgang til en vev arrayer. Ikke-oppstilt fler vevsblokker kan gjøres i en hvilken som helst grunnleggende laboratorie med betydelig mindre tid og arbeid, og er en gyldig alternativ for undersøkelser som krever mer enn arrays tillate vev eller som et middel for å redusere kostnader og forenkle analysen.

Ikke-kledd multi-vevsblokker samme måte krever en pålitelig ellerientation markør for å spore prøven identifikasjon, men utviklingen av disse markørene har vært begrenset. Mye av litteraturen som beskriver vev orientering fokuserer på riktig fysiologisk orientering for innebygging enkelte vev stykker, for eksempel tatovering vevet med blekk ^12, pre-embedding vev i agar-gelatin før prosessering ¹³ og merking visse vev med hakk ¹⁴ eller sting ¹⁵ . Selv om funksjonell disse metodene er ikke egner seg som markører på fler vevsblokker grunn av deres begrensninger. En sutur vil bli seksjonert gjennom raskt og kan ikke være synlig i hver seksjon. Pre-innebygging teknikker ved hjelp av agar-gelatin kan holde vevet i riktig orientering under bearbeidelse og innstøping, men gir ikke en visuell indikator for å skille mellom flere prøver i parafin blokken og lysbilder. Hakk eller fargestoff på vev kan komplisere analysen eller tilstoppe viktige morfologiske detaljer. Alternativt, vev identiteti en ikke-kledd flere vevsblokk kan opprettholdes ved innstøping av vev stykker i et asymmetrisk arrangement, men dette krever tre eller flere vev stykker og kan ikke gi rom for en optimal anordning av vev for analyse.

Den prøveorientering Tag (spot) er utviklet som en enkel og billig metode for å identifisere vev på fler vevsblokker og tilbyr mange fordeler over eksisterende orienterings metoder. Stedet er en liten, fargerik, kjernen består av Hydroksyetyl ​​agarose behandling gel og vev merking fargestoff, og infiltrert med parafin (figur 2C). Spot kjernen er innebygd på slutten ved siden av en enkelt vev i en multi-vev parafin blokk og fremstår som en fargerike prikk i blokken og i hver seksjon (Figur 1A - D), som klart viser riktig retning av blokken og seksjoner for enkel vev identifikasjon.

Protocol

1. Bygging av The Spot

1. Tilsett 50 mg bovint serumalbumin (BSA) til en vev ml markeringsfarvestoff i et 15 ml konisk rør eller 2 ml mikrosentrifugerør og virvle i 1 min eller inntil fullstendig oppløst.
   Merk: For denne protokollen, bruker biokjemiske Grade BSA. Mens andre karakterer og renhet ikke er testet, er det forventet at klasse og renhet ikke ville ha en betydelig innvirkning på suksessen til stedet.
2. Varme 9 ml hydroksyetyl ​​agarose-gel prosessering i et 15 ml konisk rør i en mikrobølgeovn ved 30% effekt i 10 sek intervaller inntil gelen er fullstendig smeltet.
3. Kombiner den smeltede gel prosessering og fargestoff-BSA-oppløsning i et enkelt 15 ml konisk rør og blandes grundig med en pipette. Vortex løsningen.
4. Plasser den koniske rør i et kjøleskap i et par timer eller inntil fast stoff.
5. Bruk en lang, tynn, metall slikkepott eller sonde til å forsiktig løsne farget gel pluggen fra konisk tube.
6. Bruk en skalpell eller barberblad for å cut gel koble seg på tvers inn i 5 mm tykke seksjoner. Fjern de avrundede ender og leveres som avfall (Figur 2A).
7. Plasser gel plug seksjoner flate i histologiske kassetter og hold i 70% etanol i 1 time. Endre 70% etanol-løsning hver 2-4 time i minst tre endringer over en 24 timers periode.
8. Manuelt behandle gel snitt gjennom en etanol-serien (1 hr hver: 70% etanol, 80% etanol, 95% etanol, 100% etanol (3 x endringer), og deretter klar i å klarne løsningen 3x i 1 time hver (f.eks, alifatiske hydrokarboner ( xylener erstatning)) ble anvendt i denne protokollen, xylener er også akseptabelt), og infiltrere med smeltet parafin (3x i 1 time hver), enten manuelt eller i en vev processer.
   Merk: Før fullstendig dehydrering i 100% etanol, kan fargestoffet lekke fra gelen plugg som kan påvirke andre vev og flytende reagenser i en automatisert vev prosessor. Som sådan, manuell rehydrering er sterkt anbefalt, er imidlertid automatiserte behandlingen utstyr;alliert effektive.
9. Embed flere bearbeidede gel delene med standard parafin embedding metodikk (figur 2B). Tillat blokker for å avkjøles og stivne, og deretter komme til romtemperatur.
10. Bruk en dermal punsj nål av ønsket størrelse for å fjerne flekk kjerner fra de innebygde gel seksjoner inntil blokken er oppbrukt (figur 2C). En enkelt blokk kan gi opp til 20 x 2 mm ² kjerner. Oppbevar kjernene på et kjølig område. Bruk dermal slag i denne protokollen se figurene, en 1,5 mm (Tall 1D og 2D) eller en 2 mm (Tall 1B, 1C, og 2C).

2. Bruk flekker å Orient Non-kledd Blocks

1. Lag en vev orientering diagram for å indikere de ønskede steder og identiteter av alle de enkelte vev stykker for å være innebygd sammen, og plasseringen av flekken.
   MERK: Vevet orientering diagram er en illustrert kart som inneholder physical plasseringen av alle vev stykker merket med identifikatorer og plasseringen av flekken. Det kan opprettes elektronisk eller kan være håndtegnet. Diagrammet skal opprettes ved hjelp uansett metode passer best teknikeren og forsker ved hjelp av det endelige produktet. Dette kartet vil tjene som guide for forskeren, slik at prøvene kan lett identifiseres ved mikroskopisk analyse. Kartet som brukes i denne protokollen ble håndtegnet. Det viser en vev blokk og glass objektglass med hvert stykke vev og SPOT tegnet og merket i samme posisjon som selve vevsblokk og lysbilde.
2. Behandle vev stykker normalt, slik at de forblir riktig identifisert gjennom innbringende og behandlingstrinn. For denne protokollen, behandle vev for en time hver i: 70% etanol, 80% etanol, 95% etanol, 100% etanol (x3 endringer), alifatiske hydrokarboner (xylener innbytter) (x3 endringer), og smeltet vevsinfiltrasjon parafin på 60 ° C (x3 endringer).
   MERK: Enll vev skal behandles følgende standard histologiske laboratorieprosedyrer. Dette kan være variabel på grunn av enkelte laboratorieprosedyre, vev størrelse og type, men dette vil ikke påvirke evnen til å bruke stedet som en orientering verktøy.
3. Ordne vev stykker på embedding stasjonen i riktig tildelt steder i henhold til vevet orientering diagrammet. Bruk vevet orientering diagram som en referanse for å veilede teknikeren på hvordan å ordne stedet og vev stykker i hver blokk.
   MERK: I denne protokollen innebygging tekniker sette håndtegnede orientering kartet ved siden av embedding stasjonen og ordnet vevet brikkene på embedding stasjonen på nøyaktig samme arrangement som trekkes på diagrammet. Dette sikrer at alle delsstykkene forblir fullstendig identifiserbare i det endelige produktet. Dette er helt avgjørende for en vellykket bruk av multi-vevsblokker.
4. Sikre spot kjerne er høyere enn alle vev brikker som skal innebygd i blokken.
5. Embed vevet stykker og deretter flekk på slutten (på tvers) i de riktige stedene i henhold til vevet orientering diagram bruker standard embedding metodikk. Etter behov, holder spot (s) oppreist med pinsett før parafinen har stivnet nok til at spot (e) ikke vil falle over (1-2 min).
6. Seksjon og beis parafinsnitt med stedet ved hjelp av standard metodikk.
   1. Tillat seksjonene til å flyte på et vannbad ved 40 ° C og festet til en positivt ladet glass-slide (uladede slides er ikke testet). Tørk glir i en tørkeovn ved 60 ° C i minst 20 min.
   2. Legg objektglassene i en automatisk Stainer og behandlet ved hjelp av følgende reagenser: xylener xylener (1-5 min, xylener 2 og 3-2 min, hver), 100% etanol (2 min), 95% etanol (1 min), 80 % etanol (30 sek), 70% etanol (30 sek), rennende vann fra springen (2 min), hematoxylin (1,5 min), rennende vann fra springen (3 min), syre alkohol (1 min), rennende vann fra springen (2 min ), BLuing reagens (1 min), vann (2 min), 80% etanol (30 sek), eosin (1 min), vann (10 sek), 80% etanol (1 min), 100% etanol (tre endringer 2 min hver), xylen (3 endringer, 30 sek hver).
   3. Dekk lysbilder med dekkglass, montert med monteringsmedium.
      MERK: I denne protokollen, den histotechnician seksjonert parafinblokkene på en mikrotom i fem mikrometer seksjoner. For denne protokollen vi brukte en automatisk Stainer, men like resultater kan oppnås via manuell farging.

3. plass i TMA (Manuell TMA Kit)

1. Lag en vev orientering diagram, som beskrevet i 2.1 og tilordne ønsket plassering (s) av flekken.
2. Fyll TMA formen med smeltet parafin på en embedding stasjon. Som formen er kjøling, bygge stedet (e) på slutten i margen av TMA mold på de ønskede steder indikert av vevet orientering diagrammet. Etter behov, holder spot (s) oppreist med pinsett til parafin has stivnet nok til at spot (e) ikke vil falle over (1-2 min).
3. Monter TMA kjerner i henhold til produsentens anvisninger, og med hensyn til plasseringen av flekken (e) i matrisen marginer (figur 2D), og følg standard snitt og fargingsprotokoller.
   MERK: Vennligst se trinn 2.6 for å se snitte og fargemetoder som brukes i denne protokollen.

Representative Results

Spot vises som en runde, fargerike prikk i parafinblokken (Figur 1A og 2D), i alle parafinsnitt, og er fortsatt på glasset skyv gjennom H & E eller IHC farging prosedyre (Tall 1B - 1D og 2D). Denne åpenbare visuelle cue hjelpemidler både den histotechnician og forsker i å identifisere hver enkelt vevstykke og forenkler kommunikasjon som histotechnician kan bruke denne visuelt å indikere arrangementet av vev stykker til forskeren å samle inn data fra raset i mikroskopet. Vevet orientering diagram bør inkluderes med lysbildene oppgitt til forskeren og forklart i detalj, så det blir ingen forvirring under mikroskopisk analyse. Figur 2A viser resultatene av seksjonering de størknede, fargede agarosegel plugger. Figur 2B viser resultatet av embedding delbare agarosegel plugs i en parafinblokken. Figur 2C viser resultatene av å bruke en dermal punch til å produsere SPOT kjerner.

Figur 1: Spot kjerner lages enkelt og lett synlig i vevsblokker og lysbilder (A) flekker er godt synlig i den innebygde blokken.. (B) Spots gir enkel orientering og vev identifikasjon for multi-vevsblokker inneholder lignende vises vev fra ulike individer / behandlingsgruppene. (C) oppfattet at hver kjerne av en Tissue Microarray som skal benyttes for verdifulle vevsprøver. (D) Microscope syn på SPOT i tilknytning til en TMA kjerne. Pilene viser Spot. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Utarbeidelse av Spot kjerner (A) Størknet hydroksyetyl- agaroseplugger er løslatt fra Eppendorf-rør og kuttet tvers inn i 5 mm skiver. (B) flere stykker er innstøpt i en enkelt blokk parafin og (C) en dermal slag brukes til å fjerne flekker kjerner. (D) flekker er innebygd i margen av en Tissue Microarray. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Vellykket utarbeidelse og utnyttelse av stedene krever nøye overholdelse av noen tekniske trinn. Smelting av hydroksyetyl ​​agarose bør gjøres langsomt og ved lav varme. Som smelter raskt ved høy varme kan resultere i noen nedbryting av agarose til mindre enn optimale resultater. Når du kutter de fargestoff laden plugger i stykker for behandling, sikre at tykkelsen på hver brikke er større enn 4,5 mm og ikke overstiger 7 mm. De avrundede ender fjernes som avfall som de ikke er jevnt 5 mm i tykkelse. Stykker mindre enn 5 mm vil resultere i etableringen av kortere flekker som risikerer å bli utmattet av seksjonering før utmattelse av nærliggende vev materiale. For å sikre at spot er til stede gjennom helheten av blokken, bitene må være minst 4,5-5 mm. For å sikre riktig infiltrering av voks, men bitene bør ikke overstige 7 mm. Når dehydrerende fargestoff stykker for voks infiltrasjon, vil fargestoff lekke litt ut av stykkene i lower konsentrasjoner av etanol. Utlekking påvirker ikke det endelige produktet, vil flekkene fortsatt være intenst farget og klart synlig. Utlutningen kan påvirke andre vev, selv om, slik at vevssnittene ikke skal behandles i samme bad som fargestoff brikkene til stykkene har nådd 100% etanol.

Når du plasserer de plassene i de kledd blokker, sørge for at alle andre vev emisjonen er fullført før tilsetting stedet. Siden Spot er infiltrert med parafinvoks, kan smeltet voks til mottakeren blokken begynner å smelte spot kjernen hvis det er lov til å sitte for lenge. Ordne alle vev stykker først, tilsett SPOT kjernen og umiddelbart overføre blokken til en kald plate for å hindre smelting av flekken.

Spot kan modifiseres til å passe inn i de fleste histologi lab arbeidsflyt. Fargen av fargestoffet kan endres for optimal kontrast i hver applikasjon. Rød eller svart fargestoff produserer klart høy kontrast på IHC farget lysbilder, waler den røde flekken er ikke så oppsiktsvekkende i en H & E beiset lysbilde av kledd nyre seksjoner. For H & E lysbilder, grønne eller gule flekker tendens til å gi høyere kontrast. Videre, under høyt varme ved prosesser slik som varmeinduserte antigen gjenfinning for immunhistokjemi, smelter hydroksyetyl ​​agarose bort. BSA er lagt til fargestoffet under SPOT forberedelse til å opprettholde en brightly farget flekk på lysbildet selv etter høy varmegjeninnhentingsmetodene. Hvis skinnene ikke vil bli utsatt for høy varme, kan BSA utelates for raskere SPOT produksjon.

De mest kritiske aspekter ved bruk av Spot er i etablering og vedlikehold av en klar og konsis orientering kartet og troskapen til kartet når du plasserer stedet. Når det brukes riktig, reduserer SPOT forvirring over vev arrangement og forenkler kommunikasjonen mellom teknikere og forskere, som innebygging tekniker kan bare angi plasseringen av stedet og forholdet av tissues til det på et kart. Spot er godt synlig i alle ledd i lysbilde forberedelser slik at for svært konsekvent delen montering på bakker for lettere nedstrøms analyse. I motsetning til fysiologiske markører, stedet er godt synlig i hver seksjon, og endrer ikke vevet på noen måte, hindrer innføring av gjenstander eller obstruksjon av morfologi. I motsetning til fremgangsmåten for å bygge vev asymmetrisk, tillater SPOT teknikere og forskere fleksibilitet i arrangementet av vev for å optimalisere visuell analyse under mikroskopet. I TMA, kan flekken bli plassert utenfor hoved array, eliminerer behovet for tomme plasser, asymmetriske forsamlinger, eller fyrtårns kjerner, slik at hele array å være sammensatt av verdifulle vevssnitt. Spot kan også brukes til å indikere anatomiske retning (for eksempel, distale eller proksimale) av vevsprøver. Stedet er en enkel og rimelig løsning for enkel og konsekvent orientering av vevsprøver under bygging og ennalysis av multi-vevsblokker og TMA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Histogel Specimen Processing Gel	Thermo Scientific	HG-4000-012	http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html
Tissue Marking Dye	Triangle Biomedical Sciences, Inc.	TMD-5	Any tissue marking dye would most likely be sufficient.
Arraymold Kit A 2 mm (60 core)	Arraymold	20015A	Any manual tissue arrayer would work similarly.