Introduction
体外模型系统中使用的能力已大大增强神经生物学和神经科学领域。培养中的细胞提供了一个高效的平台来表征蛋白质的功能和分子机制的具体现象，了解疾病和感染的病理，并进行初步的药物测试评估。在神经生物学，主要类型的细胞培养模型包括例如大鼠B35细胞5，神经2A小鼠细胞6和大鼠PC12细胞7从大鼠和小鼠，以及成神经细胞瘤细 胞系的原代神经元培养物。虽然使用这样的细胞系的已显著先进领域，有与处理非人类细胞和组织相关的几个混杂因素。相比于人体时，这些包括理解特定物种的代谢过程的差异，疾病的表现，和发病机制的表型。同样重要的是要注意，再是小鼠和人的基因表达和转录因子信号之间显著差异，突出啮齿动物模型的局限性和谅解其途径是啮齿动物和人类8-11之间是保守的重要性。其他已经采用了利用人体的神经元细胞系，包括N型的Tera-2（NT2）人畸胎瘤细胞和诱导多能干细胞（iPS细胞）的。这些细胞系为体外人类系统不错的机型。然而，NT2细胞用视黄酸（RA）的结果的神经元，星形胶质细胞的混合群的产生，和径向胶质细胞12，因此需要另外的纯化步骤的分化得到的神经元的纯群体。此外，NT2细胞表现出高度可变的核型13，具有在细胞的72％大于60染色体。 iPS细胞表现出变异性在不同细胞系之间的差异，并在分化效率变化 14，它因此希望具有一个一致的和可重复的人神经元细胞模型，以补充这些替代。
SH-SY5Y成神经细胞样细胞是亲神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH的亚克隆。从包含两个成神经细胞样细胞和上皮样细胞15骨髓活检于1970年产生的亲本细胞系。 SH-SY5Y细胞具有由47条染色体的稳定核型，并且可以从一个神经细胞样状态成成熟的人神经元，通过各种不同的机制，包括使用的RA，佛波酯和特定神经营养蛋白诸如脑源性分化神经营养因子（BDNF）。现有的证据表明，使用不同的方法，可以为特定的神经元亚型如肾上腺素，胆碱，和多巴胺能神经元16,17选择。这后一方面使得的神经生物学实验的大量有用的SH-SY5Y细胞。
内容】“>几项研究已经注意到在其未分化和分化的状态SH-SY5Y细胞之间的重要区别。当SH-SY5Y细胞是未分化的，它们迅速增殖并似乎非偏振光，除了极少数，短流程。它们通常生长表示未成熟的神经元18,19的中块和表达的标志物。当有区别的，这些细胞扩展长的，支链的过程，减少增殖，并且在一些情况下，极化2,18。完全分化的SH-SY5Y细胞先前已经证明表达多种成熟神经元包括生长相关蛋白（GAP-43），神经元核（的NeuN），突触素（SYN），突触小泡蛋白II（SV2），神经元特异性烯醇化酶（NSE）和微管相关蛋白（MAP）的不同的标记的2,16,17,20，和缺乏神经胶质标记物，如胶质纤维酸性蛋白（GFAP）4的表达。在进一步的支持，分化SH-SY5Y细胞represeNT均匀的神经元群，拆除BDNF的导致细胞凋亡4。这表明，分化SH-SY5Y细胞的存活依赖于营养因子，类似于成熟神经元。SH-SY5Y细胞的使用增加了，因为亚克隆成立于1978年3。它们的使用的一些实例包括：调查帕金森氏病17，阿尔茨海默氏病21，和病毒感染，包括脊髓灰质炎病毒22，肠道病毒71型的发病23,24 ，水痘带状疱疹病毒（VZV）1，人巨细胞病毒25，和单纯疱疹病毒（HSV）2,26。使用SH-SY5Y细胞在他们的未分化的形式使用这些细胞要注意，一些研究，特别是在neurovirology 27-36领域是很重要的。在的未分化与分化的SH-SY5Y细胞中观察到的表型的差异引起的磨片的问题疗法感染的观察进展会在成熟分化的神经元的不同。例如，分化的SH-SY5Y细胞具有HSV-1的摄取与未分化，增殖SH-SY5Y细胞，这可能是因为缺乏结合HSV并调节上未分化的SH-SY5Y细胞2条目表面受体的一个更高的效率。因此，关键是设计侧重于测试在体外的神经元的实验时，SH-SY5Y细胞应以获得翻译和对比的最准确的结果，以在体内模型区分。
一个可靠的方法的发展，产生人类神经细胞当务之急是让研究人员进行翻译实验证明，精确地模拟人的神经系统。这里介绍的协议是界定从以前的方法得出1-4最佳实践来丰富对于那些分化的人神经过程使用视黄酸。
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Protocol
1.一般注意事项
- 见材料/设备的表所需试剂的列表。执行严格的无菌条件下的所有步骤。
- 请对所有媒体的准备工作，包括FBS，热灭活的胎牛血清（hiFBS）。对热灭活，温暖的50ml等分试样的FBS在56℃下进行30分钟，倒相，每10分钟（也见表 1）。
注意：当FBS的是无热灭活所使用的，上皮样表型在整个SH-SY5Y细胞的培养物更快速地进展。 - 在使用之前，允许媒体温热并在培养箱平衡以建立每一步之前一个适当的pH值的平衡。例如，将50ml的媒体花费大约一小时，以充分平衡（pH为7，在37℃，5％CO 2）。
注意：此协议使用，需要部分分化的SH-SY5Y细胞中胰蛋白酶处理并重新铺板的两步分裂过程。这是一个紧张这些异常脆弱的细胞过程。因此，孵育在胰蛋白酶的细胞的时间最小量是重要的。这将允许对神经元的优先剥离，留下仍然附着于培养皿的上皮样细胞。 - 执行分化的细胞的研磨，用10毫升的塑料吸管与针对包含该细胞的锥形管的底部尖端缓慢。以缓慢的速度进行研磨，上下不超过五次。
2. SH-SY5Y维护文化的通道
- 拆分维护文化当细胞达到70-80％汇合，和不超过10〜15代。文化通常都需要每3-5天传代（假设文化分裂过程中，不会比稀释5倍以上）。
- 到从T-75烧瓶中传代细胞，吸媒介，然后用大约10mL，1×PBS中冲洗。
注意：我们不建议分裂SH-SY5Y维护文化福rther比1：传代过程中5，因为这会导致细胞死亡，由于低汇合。 - 抽吸PBS，然后添加2.5毫升0.05％胰蛋白酶-EDTA（1×）。
- 孵育在培养箱2-3分钟，尖轻轻从烧瓶的表面释放细胞。
- 加入10 mL的基本生长培养基（ 见表 2）和磨碎的1-2倍。
- 降速2分钟在1000 XG，抽吸介质，然后悬浮在5毫升的基本生长培养基沉淀。
- 稀释细胞从1：3至1：5的20毫升正常电镀中的T-75烧瓶中的总体积，或对分化（第5部分）计算和板。
3.冷冻SH-SY5Y细胞
- 冻结补充有5％（体积/体积）的DMSO中的基本生长介质的SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞的早期传代。
- 最初，在-80℃冷冻等分试样24小时，然后转移到液氮长期贮存。
注意：作为参考，汇合（75-85％），T-75瓶将产生5SH-SY5Y细胞的1ml等份冷冻。每个等分试样的应包含任何地方从2-5百万细胞总。
4.解冻和文化未分化的SH-SY5Y神经母细胞瘤
- 准备基本生长介质。
- 迅速解冻冷冻的细胞在37℃水浴（约2分钟）。
- 重悬细胞于9ml基本生长培养基在15ml锥形管中，然后离心以1000xg 2分钟。
- 吸出上清液同时小心不要打扰沉淀的细胞，并轻轻悬浮细胞在10毫升的基本生长介质。
- 板细胞到T-25瓶或60 平方毫米的菜。
- 次日，更换培养基，以去除死细胞。
5. 0日：分化细胞电镀
- 参见图1分化时间表。
- 冲洗未分化细胞用1×PBS，吸出物，然后trypsinize用1-2毫升温热1×0.05％胰蛋白酶-EDTA。
- 当细胞在胰蛋白酶，孵育在培养箱约3分钟。
- 通过加入10ml的基本生长培养基猝灭胰蛋白酶，冲洗烧瓶或盘的两侧，并轻轻磨碎1-3次。传送内容到15毫升锥形管中。
- 离心机在1000 XG 2分钟，吸媒体同时小心不要打扰颗粒。
- 在5毫升的基本生长培养基重悬沉淀和磨碎1-3次。
- 算使用血球细胞，然后稀释使用基本生长培养基至50,000个细胞/ ml。
- 板2萃取池的，有35 平方毫米的菜，共计每盘100,000个细胞，并放回孵化器。
6.第1天：改变传媒（分化媒体＃1）
- 分装50毫升分化媒体＃1（ 见表 2），并在37℃水浴孵育。
- 当媒体被加热，允许它在一个孵化器平衡（37℃，5％CO 2）至少1小时，以建立在使用前一个适当的pH值的平衡。
- 添加视黄酸（RA）（见表1），以温热并平衡媒体立即将介质添加到菜之前。
注意：视黄酸是光敏感，应在4℃下贮存在黑暗的瓶子 - 轻轻吸了旧的媒体和丢弃。
- 加2ml分化媒体＃1？35 平方毫米的菜RA，并返回到孵化器。
7.第3天：改变传媒（分化媒体＃1）
- 重复第6（1-5步）
8.第5天：改变传媒（分化媒体＃1）
- 重复第6（1-5步）
9日7：拆分单元格1：1
- 添加到RA温暖和平衡的分化媒体＃1，立即将介质添加到菜肴之前。
- 轻轻吸了旧的媒体和丢弃。
- 加入200μl温热0.05％1×胰蛋白酶的EDTA？35 平方毫米培养皿和温暖培养箱大约2-3分钟，或直至细胞被明显地从显微镜下观察到的板抬起。
- 通过，有35 平方毫米的菜加入2ml分化媒体＃1 RA淬火胰蛋白酶 并利用媒体来冲洗剩余的神经细胞脱盘。然后内容物转移到50ml锥形管中。
注：在胰蛋白酶消化步骤，不要一下子trypsinize太多的菜肴。这有助于确保神经元培养物中没有胰蛋白酶温育的时间过长，它可以是细胞毒性的。 - 从多达10个菜在50ml锥形管中结合内容并轻轻慢慢磨碎上下不超过五次，用10毫升的塑料吸管。
- 分装2 ml细胞悬液注入新鲜35毫米2的菜肴，并返回到孵化器。
10.第8天：改变传媒（分化媒体＃2）
- 加入RA（见<STRONG>表1），以温暖，并立即将介质添加到菜肴之前平衡媒体。
- 轻轻吸了旧的媒体和丢弃。
- 慢慢加入2毫升分化媒体＃2（ 见表 2） 有，有35 平方毫米的菜，并回归到孵化器RA。不允许的神经元被暴露于空气的时间，因为它们能快速变干较长的时间。
11.第9天：准备细胞外基质（ECM）包被的培养皿
- 在冰上解冻的ECM解决方案一小瓶，稀释1：100到寒冷的DMEM。
- 分配2毫升混合物成35个平方毫米培养皿，并确保了培养皿的整个基被覆盖。
- 在培养箱地方（37℃，5％CO 2）1小时或过夜。
- 抽吸混合物和允许空气干燥在发动机罩约1小时。在室温下储存长达2个月。
12.第10天：细胞转移到ECM涂层板1：1
- 加入RA（ 见表 1），以温暖和平衡媒体立即将介质添加到菜肴之前。
- 轻轻吸了媒体和丢弃。
- 加入200μl温热胰蛋白酶至35 平方毫米培养皿，并允许在室温下孵育约1-2分钟，或直至神经元被明显地从显微镜下观察到的培养皿解除。
注：执行在室温下此胰蛋白酶处理步骤，以免过度孵育用胰蛋白酶的神经元并导致损坏。从神经元比板块在这个阶段上皮样细胞更快释放。 - 通过加入2ml分化媒体＃2？35 平方毫米的菜淬火胰蛋白酶和利用媒体来冲洗剩余的神经细胞脱盘。然后内容物转移到50ml锥形管中。
- 从多达10个菜在50ml锥形管中结合内容并轻轻慢慢磨碎上下不超过五次10毫升的塑料吸管。
- 免除2 ml细胞悬液注入ECM-涂35毫米2的菜肴，并返回到孵化器。
13.第11天：改变传媒（分化传媒＃3）
- 加入RA（ 见表 1），以温暖和平衡媒体立即将介质添加到菜肴之前。
- 轻轻吸了旧的媒体和丢弃。
- 慢慢RA加2ml分化传媒＃3（ 见表 2），有35 平方毫米的菜，并返回到孵化器。不允许的神经元被暴露于空气的时间延长的时间。
14.第14天：改变传媒（分化传媒＃3）
- 重复第13（第1-3步）
15. 17日：最近媒体更改（分化传媒＃3）
- 重复第13（第1-3步）
16. 18日：神经细胞即用
- 更改媒体鲜DIFFerentiation媒体＃3 RA每3天来维持神经元的健康。
注：细胞应分化成神经元和表现出神经元表型。培养通常为以下终末分化长达14天的稳定，但是神经元存活率的持续时间取决于在分化开始时的未分化细胞的传代次数。较高传代数得到具有较短的使用寿命分化的神经元。
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Representative Results
目前，有在神经生物学和neurovirology领域许多情况下，未分化的SH-SY5Y细胞被用作用于人类神经元27-36，和重要的是，未分化的细胞可能缺乏的表型功能模型如最佳的病毒摄取2是必要的准确解释。至关重要的是，使用的SH-SY5Y细胞或任何其他在体外的神经元系统时，将细胞适当地分化成神经元，以获得这是什么可能在神经元在体内发生的最佳可能的表示数据。上述协议的产量非常可行的，均匀的，分化的神经元在18天的培养中，可以用于后续的生化和成像分析。未分化的SH-SY5Y成神经细胞瘤细 胞中表现出大的，扁平，上皮样与向外延伸（图2A）无数短过程的表型，而分化细胞小号具有连接到周围的细胞（图2B）几个神经炎突起。重要的是区分SH-SY5Y细胞时，将细胞用胰蛋白酶温育的时间的最小长度，以确保只有神经元从盘释放。这使未分化的上皮细胞，否则将污染分化的神经元细胞群的后面。完全分化的SH-SY5Y细胞的神经元特性由技术证实如免疫荧光检测经典的神经元标记物（图3）的。
SH-SY5Y细胞的分化过程中表现出各种不同的表型的，它是能够从那些强调识别出健康的神经元重要。在分化的第1天，之前推出的分化传媒＃1，细胞有平坦，有缩回短，粗短的过程（ 图4A）的表型。以下血清剥夺的5天，SH-SY5Y细胞开始培养较长突起和表现出更多的神经元表型（ 图4B）。传代是SH-SY5Y细胞严酷过程，并在之后立即传代天后，将细胞出现不健康的。这是通过细胞体聚集和更少，更短的进程的存在证明。 （图片之前，请参阅： 图4C和 4E和影像后： 图4D和 4F）。约48小时的拆分之后，细胞似乎恢复，并在18天（图2B）获得完全成熟，分化的神经元。这是通过在单元主体聚集的减少，和许多薄延伸证明的，支链经常连接到相邻小区的神经炎进程。
这是必不可少的获得可重复的和可行的神经元文化的因素包括：使用热灭活FBS，最大限度地减少胰蛋白酶孵化时间，和温柔的研磨。重要的是，这个协议的细节的使用的不同浓度hiFBS的，从而产生一个平缓过渡成血清饥饿状态的细胞四种不同培养基配方。当成熟的SH-SY5Y细胞是健康的，它们显示连接到周围的神经元（图5A）众多凸起。应当注意的是，一个独特的上皮表型将超过神经元培养物，如果它们在分化过程中（图5B）处理不当。此外，如果神经细胞开始死亡，轴突会收回，胞体将开始聚集在一起，和围捕，并从轴突退化的碎片将开始和周围细胞过程的积累。这个过程类似于什么是表现在图 5C和5D。 虽然图5C示出的细胞死亡的下列营养和环境剥夺了更自然的进展，图5D显示了具有HSV-1株，KOS，在10 6 PFU的感染复数（MOI）分化的SH-SY5Y神经元4小时以下感染。该协议已经在神经元中的实验室和产量可再现，同质种群，这是下游分析和实验必需被彻底优化。
图1：分化过程的时间表分化过程包括在18天期限的过程中展开11个步骤。在分化方案（第0天）的第一天，将细胞25,000 100,000被镀上未涂覆35毫米菜肴。天1，3，及5中，旧培养基除去，分化培养基＃1被应用。第7天，细胞被分割为1：1在上分化培养基＃1无涂层35mm培养。在第8天，介质被改变为分化媒体＃2，并在第10天，将细胞再次分裂1：1，但这次到在分化培养基＃2的ECM涂覆35毫米菜肴。天11，14，和17，旧培养基除去，分化培养基＃3被应用。第18天，分化的神经元准备用于下游应用。
图2：未分化的和分化的SH-SY5Y细胞的形态学外观 （A）的未分化的SH-SY5Y细胞与少突平坦的表型，而（B）的分化的SH-SY5Y神经元表现出广泛的和细长神经炎突起。使用倒置落射荧光显微镜在放大20倍的阶段获得的图像。
图3：的标记物的神经元分化。免疫荧光照亮完全分化SH-SY5Y细胞的神经元的功能。 （A）抗SMI31（绿色）污渍突起的广泛网络中的磷酸化神经丝小时。 （B）抗MAP2（红色）标记的微管相关蛋白2，揭示了神经元的胞 体和神经突的近侧部分。每个免疫面板相应的相位图像显示在右侧。使用倒置落射荧光显微镜在放大10倍，获得的图像。比例尺，100微米。
图4：该分化方案的中间步骤 （A）的分化1天。细胞保持与短期预测收缩表型。 （B）分化5天。细胞被暴露5日均血清剥夺S（分化媒体＃1）。幸存的细胞开始拉长，并形成与邻近细胞连接较长时间的进程。 （C）的分裂前分化的第7天。细胞表现出高的数字长的过程，具有细胞表现出上皮样表型的数量更少。 （D）的日分化8中，第一通道之后一天。以下分裂，胞体形成团块和进程出现短的传代过程的结果。 （E）分化10日，拆分到ECM-涂层板前。细胞表现出较长的流程，使与附近的细胞连接。胞体集群也很明显。 （F）天分化11，一天之后第二次分裂。细胞强调以下第二通道和许多神经元最终输掉。然而，剩下的人口是可行的，均匀的，并在表型的神经元。胞体生成L-arger簇和进程开始从集群的基地发射。
图5：上皮过度生长和神经元死亡-分化过程的两种可供选择的结果 （A）的健康，成熟的SH-SY5Y神经元表现出连接到邻近细胞弥漫性轴索突起。 （B）在一些情况下，具有更上皮样表型的细胞超车维护培养物。上皮样细胞的这种过度的人口可能是由于保养培养物不频繁传代。这些培养物应该被丢弃，因为上皮样细胞会继续多于神经元。箭头表示上皮样细胞。 （C）在SH-SY5Y细胞是不健康的，并开始死亡，胞体围捕和过程降解，产生碎片的显著量。 （D 6感染复数（MOI） PFU。
| 零件 | 详细信息 | 股票 | 说明 | ||||
| 10μMRA | 全反式维甲酸 | 5毫米 | 重悬33.3毫升95％乙醇50毫克RA。 RA是对热，光，和空气敏感。保持在一个黑暗的瓶子，并储存在4°C至6周。使用以1：500的稀释和稀释成分化培养基在使用前立即 | ||||
| （300.44克/摩尔） | |||||||
| 1个B-27 | B-27补充 | 50X | 解冻1-10毫升瓶装和分装其余为单次使用1ml等份并储存在-80℃。商场有10毫升瓶中，在-20°C | ||||
| 20毫米氯化钾 | 氯化钾 | 1M的 | 250毫升水添加到18.6克KCl和无菌过滤器。室温保存 | ||||
| （74.55克/摩尔） | |||||||
| 2毫米DB-的cAMP | 丁酰环磷酸腺苷 | 1M的 | 加入2.04毫升水到1g DB-cAMP的重悬满瓶。怕光和水分。商店在任一-20℃或100微升或200微升的等分-80℃ | ||||
| （491.37克/摩尔） | |||||||
| 50毫微克/毫升BDNF | 脑源性神经营养因子（BDNF） | - | 离心瓶拿到粉底部。60;重悬10微克小瓶在1ml的Neurobasal + 1×B27或5微克小瓶在0.5ml的Neurobasal + 1×B27以获得10微克/毫升。使用以1：200的稀释。在-80°C储存分装（如：250微升） | ||||
| hiFBS | 热灭活胎牛血清 | - | 等分试样解冻FBS的入50ml锥形管中。在水浴中30分钟热在56℃。拆下，并在-20℃冷冻分装 | ||||
表1：储备溶液和组件。
| 基本生长培养基 | ||
| 零件 | 500 ml，此 | 稀释 |
| EMEM | 415毫升EMEM | |
| 15％hiFBS | 75毫升hiFBS | |
| 1X笔/链球菌 | 5毫升笔/链球菌 | 1：100 |
| 2mM谷氨酰胺 | 5毫升谷氨酰胺 | 1：100 |
| *保持最大6周 | ||
| 分化媒体＃1 | ||
| 零件 | 50 ml，此 | 稀释 |
| EMEM | 48毫升EMEM | |
| 2.5％hiFBS | 1.3毫升hiFBS | |
| 1X笔/链球菌 | 500微升笔/链球菌 | 1：100 |
| 2mM谷氨酰胺 | 500微升谷氨酰胺 | 1：100 |
| 10μMRA | 100微升RA（5毫米股票） | 1：500 |
| *保持2周最高，并添加RA前夕使用 | ||
| *不要让多余的媒体曾加入RA - RA不稳定 | ||
| 分化媒体＃2 | ||
| 零件 | 50 ml， 此 | 稀释 |
| EMEM | 49毫升EMEM | |
| 1％hiFBS | 500微升hiFBS | |
| 1X笔/链球菌 | 500微升笔/链球菌 | 1：100 |
| 2mM谷氨酰胺 | 500微升谷氨酰胺 | 1：100 |
| 10μMRA | 100微升RA（5毫米股票） | 1：500 |
| *保持2周的最大和添加RA即将使用前 | ||
| *不要让多余的媒体CE RA加 - RA不稳定 | ||
| 分化传媒＃3 | ||
| 零件 | 50 ml，此 | 稀释 |
| 神经基础 | 47毫升神经基础 | |
| 1个B-27 | 1毫升B-27（50X股票） | 1:50 |
| 20毫米氯化钾 | 1毫升氯化钾（1M股票） | 1:50 |
| 1X笔/链球菌 | 500微升笔/链球菌 | 1：100 |
| 2毫米GlutamaxI | 500微升GlutamaxI（100倍的股票） | 1：100 |
| 50毫微克/毫升BDNF | 250微升BDNF的股票（10微克/毫升） | 1：200 |
| 2毫米二丁环磷酸腺苷（DB-营） | 100微升DB-环磷酸腺苷（1M股票） | 1：500 |
| 10μMRA | 100微升RA（5毫米股票） | 1：500 |
| *保持2周的最大和添加RA即将使用前 | ||
| *不要让多余的媒体曾加入RA - RA不稳定 | ||
表2：媒体食谱。
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Discussion
上述协议提供了一个直接的和可重复的方法来生成均匀的和可行的人类神经文化。该协议利用技术和集成多个先前公布的方法1-4和目标划定每个最佳实践做法。 SH-SY5Y细胞的分化依赖于逐渐血清剥夺;加入视黄酸，神经营养因子和细胞外基质蛋白;和串行分裂来选择分化成熟的神经细胞贴壁。该细胞系开始以贴壁和悬浮的细胞的异质群体。该协议的目的是通过传代或媒体变更前预提PBS洗涤以保持两个群体，但悬浮的细胞的某些损失是必要允许除去死的上皮细胞的。所提出的方法产生分化的人SH-SY5Y神经元进一步的实验的均质群体。
虽然行吟诗人R试剂可以用来指导神经元的分化成胆碱或肾上腺素能表型16,17，使用RA的区分SH-SY5Y细胞先前已用于产生神经元的多巴胺能表型37,38。类风湿性关节炎的加成已经示出通过一些机制，包括抑制细胞周期进程出G0 / G1期的诱导细胞分化，增加细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂的p21和p27 标Kip1和抗凋亡蛋白Bcl的表达-2和Bcl-xL，增强起着在轴突发育和分化39作用PI3K / AKT活性。
当务之急是整个协议的执行使用温和的和无菌处理技术，为SH-SY5Y细胞对突如其来的变化非常敏感。正是由于这种灵敏度逐渐血清剥夺协议优先需要在MED做出快速变化协议IA组成。当分割天7和10个细胞，其以最小化的时间，该部分分化的神经元在胰蛋白酶花费的金额是重要的。这减小了损坏的神经元的概率，并促进神经元与上皮细胞，这需要较长的时间分离的优先释放。这有助于树立细胞的更均匀的神经元群，并降低对增殖和分化的上皮细胞的污染。同样重要的是要注意用于SH-SY5Y细胞应常规，并没有更换无限期地保存文化和分化试剂。例如，基本生长介质可以保持长达6个星期，而分化媒体只应保持达2周。这可确保试剂如dbcAMP和BDNF是新鲜和稳定的。此外，制备的RA只应存储长达6周，在黑暗中，应做了一个新鲜批次之前。我们观察到神经W¯¯结果的一致性第i这些预防措施。
一旦细胞已分化为成熟的神经元，它们可以维持长达2周后，终末分化并用于实验。以下终末分化，媒体应每3-4天更换（分化培养基＃3）。在对比分化的神经元，含有未分化的SH-SY5Y细胞培养物维持瓶中可保持在许多周定期传代。它经常是通道维护文化重要，以防止过度人口不再能够分化成神经细胞的上皮样细胞。当这些细胞多于那些与神经潜力，血清饥饿会造成不成比例的大量细胞死亡。未分化的培养物只能维持长达约15代。一旦文化已经围绕15代超标，未分化的细胞开始死亡，并有一个粗略的，不健康的外观。此外，differen高通道SH-SY5Y细胞的tiation是更加困难，因为较少的细胞将存活每个分割，和那些经常聚集两种细胞体和轴突，使得随后的分析更困难。
有在尽可能多的细胞丧失或不能存活的分裂过程的分化过程中的细胞数明显的减少。因此，在涉及分化的SH-SY5Y细胞的任何实验开始，应该占〜神经元的30-40％的损失，并确保细胞的适当数量在开始镀敷以实现期望的产率。而电镀10万个细胞产生大量健康的，成熟的SH-SY5Y神经元，减少或较大的数字可初步根据实验需要电镀。
很明显，完全分化的SH-SY5Y神经元提供在体内发现的比做成熟的人神经元的更接近于其未分化的祖细胞的对应（图2）。这些神经元将提供一个有利的模型为他们的神经生物学的未来刻画，为嗜神经病毒的研究，或可用于筛查神经细胞化疗的毒性。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | See Table 1 for preparation |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg) | See Table 1 for preparation |
| dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | See Table 1 for preparation |
| DMSO | ATCC | 4-X | - |
| Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) | Sigma | M5650 | - |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | See Table 1 for preparation |
| GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061 | - |
| Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | - |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | See Table 1 for preparation |
| MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution | Sigma | E0282 | See step 11 of the protocol |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | - |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Life Technologies | 15140-122 | - |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Should be stored in the dark at 4 °C because this reagent is light sensitive |
| SH-SY5Y Cells | ATCC | CRL-2266 | - |
| 0.5% Trypsin + EDTA | Life Technologies | 15400-054 | - |
| Falcon 35 mm TC dishes | Falcon (A Corning Brand) | 353001 | - |
References
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