Summary
Her beskæftiger vi FISH metode til at spore LINE-1 retrotransposition på den enkelte kerner niveau kromosomspredninger af HepG2 cellelinjer stabilt udtrykker syntetisk LINE-1.
Introduction
Menneskelig Lang Afbrudt Nuclear Element-1 (Line-1 eller L1) er en selvstændig mobile element, der udbreder i genomet gennem en "kopiere og indsætte" retrotransposition mekanisme. En typisk human L1 er ~ 6 kb lang og består af en 5'UTR (utranslateret region), der fungerer som en promotor, to åbne læserammer (ORF'er): L1 -ORF1 og L1 -ORF2, og en 3'UTR med en polyA . hale L1 -ORF1 protein har tre distinkte domæner: en coil domæne, RNA genkendelsesmotiv og C-terminale domæne, mens L1 -ORF2 protein har endonuklease, revers transkriptase og cysteinrige domæner 1,2,3,4,5. L1 -ORF1 udviser nukleinsyre ekskortere aktiviteter, mens L1 -ORF2 giver enzymatiske aktiviteter, med begge proteiner, der er nødvendige for retrotransposition 1,2,6.
En cyklus af L1 retrotransposition starter med transkription fra 5'UTR i L1 L1 -ORF1 udstiller enten cis -bindende hvor det pakker sin egen RNA eller trans -bindende hvor det pakker andre RNA (dvs., Sine / SVAS / pseudogener) danner en ribonukleoprotein partikel (RNP) med L1 -ORF2p 7, 8. RNP'er translokerer ind i kernen, hvor endonukleaseaktiviteten af L1 -ORF2p nicks genomisk DNA (gDNA) for at blotlægge en OH - gruppe 9, der på sin side anvendes ved revers transkriptase til at prime og revers syntetisere RNA til DNA fra 3'-enden. Under omvendt syntese, er den anden streng af DNA hakkede 7-20 bp fra den oprindelige nick stedet for at skabe forskudte pauser, som er fyldt til at danne signatur L1 indsættelse sekvenser (fx TTTTAA) kaldet target websted gentagelser (TSD) 9,10. Denne proces er kendt som target prime revers transskription (TPRT) og fører til insertipå af komplette eller trunkerede kopier af L1 / andre DNA'er med TSDs i begge ender af den indsatte sekvens. L1 retrotransposition er også blevet vist at være formidlet gennem TPRT-lignende ikke-homolog endesammenbinding i nogle celletyper 11.
L1 retrotransposition anvendte vektor i vores studier er ikke-episomale og består af mærkede L1 -ORF1 & 2p drevet af kombinerede CMV-L1-5'UTR promotorer (figur 1) 12. Tidligere versioner af denne konstruktion er blevet beskrevet i undersøgelser under anvendelse gær og humane cellekulturer 13,14,15. To forskellige CMV-promotorer lokaliseret ved 5 'og 3' enderne af vektoren, med 3'-enden placeret i omvendt orientering til at drive ekspression af neomycin efter splejsning og integration. Den retrotransposition indikator kassetten ved 3'-enden består af en neomycin gen indsat antisense til L1 -ORFs og gøres inaktive ved adskillelse i to halvdele ved en globi intron med splejset donor (SD) og splejset acceptor (SA) steder (Figur 1). På en integration i et kromosom, er L1 transkriberet fra den fælles promotor til frembringelse af en mRNA, som består af en bicistronisk mRNA og inaktive neomycin mRNA. Under RNA-bearbejdning, er globin intron splejset ud af neomycingenet at genskabe en fuldt funktionel neomycin-gen. Det hybride mRNA er pakket ind i en RNP i cis og translokeres ind i kernen, hvor den er integreret i genomet som enten fuld længde eller trunkerede indrykninger vha TPRT.
Her beskriver vi en metode, der bruger fluorescens in situ hybridisering (FISH) med sonder specifikt rettet mod den splejsede neomycin gen (SNeo) at spore L1 -retrotransposiition mønstre og indsættelse satser på det indre kerne niveau. Effektiviteten og specificiteten af detektion blev bekræftet ved hjælp retrotransposition kompetent og inkompetente konstruktioner og sonder til Detect SNeo eller neomycin og globin intron junction 16. Denne metode udgør nogle af manglerne ved cellekultur baseret retrotranspositionshastigheder analyser, såsom flere indsættelser, koloni modstand og gunstige klon ekspansion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: bør gennemføres Alle trin ud ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet. Se reagenser afsnittet for detaljer om, hvordan man forbereder individuelle reagenser.
1. Mærkning L1 Probes
BEMÆRK: Prober kan mærkes ved kemisk eller PCR mærkning.
- Kemisk mærkning
- Gør 0,7-1% agarosegel i Tris-acetat-EDTA (TAE) puffer, varme i en mikrobølgeovn indtil smeltet, tillade gelen at afkøle, og derefter tilføje ethidiumbromid (0,5 ug / ml). Hæld i gelbakke, tilføje kamme og tillade gelen at størkne ved stuetemperatur.
- Mærk SNeo probe (1-2 ug) med CY3 eller FITC ved 37 ° C i 1 time ifølge fabrikantens protokol.
BEMÆRK: SNeo betegner S pliced Neo mycin gen udtrykkes efter en fuld cyklus af retrotransposition. Sonden er ~ 1.000 bp i størrelse. SNeo kan PCR amplificeres fra enhver vektor eller fra genomic DNA. Se tabel for Materialer og reagenser for information om Streptavidin-CY3 / FITC mærkning reagenser. - Bland den mærkede SNeo probeopløsningen med 1x DNA loading buffer, belastning i hver brønd og kørt ved 75-100 volt i 15-20 min.
- Visualiser sonden båndet, med en Ultra-Violet (UV) illuminator. Bemærk, at størrelsen af SNeo proben kan justeres og at lås kerner syre (LNA) kan også tilsættes (figur 2).
- Cut mærket SNeo probe fra gelen med en ren klinge, solubilisere og oprense SNeo probe fra gelen under anvendelse af en PCR Clean-Up Kit ifølge producentens protokol.
ADVARSEL: Cover hver udsatte del af kroppen med beskyttende skjold (dvs. laboratorie frakker og UV klar ansigtsmaske) ved visning og skære gelen. Se tabel af materialer og reagenser om oplysninger til gel rense PCR-produkter. - Re-run 5 pi SNeo mærket probe med en un-mærket SNeo probe på en 0,7% agarosegel (se 1.1.1) at confast størrelse stigning og tab af signal intensitet (figur 2).
- Kvantificere mængden af mærket SNeo sonde ved at måle absorbansen ved 260 nm og fortynde SNeo sonde til 10 ng / pi prøver i nukleasefrit H 2 O. Opbevar portioner ved -20 ° C.
- PCR Mærkning (alternativ metode til sonde mærkning)
- Kombiner SNeo specifikke primere (5'-ggatagcattgggagatatacct-3 'og 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3') med PCR-reagenser i en enkelt rør: 13,6 pi nucleasefrit H2O; 0,1 pi dATP, dCTP, dGTP (10 nM); 0,05 pi dTTP (10 nM); 0,05 pi dUTP-biotin / dUTP-FITC / CY3 (10 nM); 4 pi Gå Tag 5x buffer; 0,4 pi Gå Tag polymerase; 1 pi SNeo skabelon (10 ng). Se tabel for Materialer og reagenser for information om PCR-reagenser.
- Justere mængden af hvert reagens ved at multiplicere med det samlede antal prøver.
- Brug følgende PCR cykling parameters til at forstærke og mærke SNeo sonder: 95 ° C i 2 min; 35 cykler ved 95 ° C i 30 sek, 62 ° C i 30 sek, 72 ° C i 60 sek; 72 ° C i 2 min; Hold ved 4 ° C uendeligt.
BEMÆRK: udglødning temperatur kan justeres eller gradient PCR kan være afsluttet til at bestemme optimale annealing temperaturer for andre sonder. - Lav 0,7-1% gel som i afsnit 1.1.1, belastning og visualisere sonden band som i afsnit 1.1.4.
- Klip og rense den mærkede SNeo sonde som i afsnit 1.1.5.
- Re-run 5 pi SNeo mærket probe med umærket SNeo probe for at bekræfte størrelse stigning og tab af signalintensiteten (se figur 2).
- Kvantificere mængden af mærket SNeo sonde ved at måle absorbansen ved 260 nm og fortyndede SNeo sonde til 10 ng / pi prøver i nukleasefrit H 2 O.
2. Klargøring kromosomspredninger
- Generer stabile kloner udtrykker vektor rygrad (control) eller retrotransposition kompetente L1 anvendelse af standard udvælgelse metoder. 12,16 Mens ikke-episomale reportere blev anvendt til at korrelere resultaterne med studier af transkription, kan episomale vektorer også anvendes. Grow celler, der stabilt udtrykker kontrol eller L1 vektor (1 x 10 6 celler pr 10 cm plade, med justeringer i pladestørrelse foretaget efter behov) i komplet vækstmedium. For HepG2 celler, bruge RPMI-1600, 10% FBS og 200 ug / ml hygromycin. Grow kulturer til 70% konfluens ved 37 ° C og 5% CO2.
BEMÆRK: Valget af vækstmediet er afhængig af celletype. Da de anvendte plasmider her bære udvælgelse kassetter til både hygromycin og neomycin, kunne stabil selektion af kloner også gøres med neomycin efter selektion på hygromycin, men mængden af neomycin skal optimeres for at etablere tolerancetærskler for hver celletype. - Tilføj colcemid (0,4 ug / ml) til dyrkningsmedium og inkuberes i 90 min for at standse celler ved metaphase. Hvis der anvendes forskellige celletyper, bestemme den optimale koncentration af colcemid og eksponeringstid (60, 90, og 120 min) for optimal metafase standsning empirisk.
- Vask cellerne 2 gange med 10 ml 1x Dulbeccos PBS (DPBS), Trypsinisér ved tilsætning 3-5 ml 0,25% trypsin-opløsning til cellerne og inkuberes i 5 min for at frigøre cellerne. Inaktivere trypsin med et tilsvarende beløb af medier, der indeholder 10% FBS.
- Centrifuger cellerne i 2 minutter ved 1.000 xg ved 4 ° C, aspireres mediet fra cellepelleten og vask af cellerne med DPBS. Aspirer alle DPBS, forlader 200 pi DPBS at re-suspendere celler. Sikre cellerne blandes godt, og at alle klumper er dispergeret. Brug flimrende eller forsigtig pipettering at blande og sprede klumper og undgå hvirvelblanding.
- Der tilsættes 5 ml hypotonisk opløsning (dvs. 75 mM KCI), der er forvarmet til 37 ° C dråbevis under rotation af 15 ml rør horisontalt og inkuberes ved 37 ° C i 20 min. Se tabel Materialer og Reagents for oplysninger om, hvordan du anskaffer og gøre hypotonisk løsning.
- Centrifugér celler ved 120 xg i 5 min ved 4 ° C og gentage trin 2,4-2,5 3x forlader ca. 200 ul hypotonisk løsning til at re-suspendere celler efter hver vask. Sikre, at ved slutningen af de 3 vaske, pelleten er synligt hvid og hævede.
- Resuspender pellet i 200 pi Carnoy fikseringsopløsning og gøre 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 fortyndinger i Carnoy fikseringsopløsning. Drop 10 pi af hver fortynding på en tør rent objektglas fra ca. 1 cm over og umiddelbart udsætte spread frie side til varm damp fra kogende vand i 30 sek. Se tabel for Materialer og reagenser for information om, hvordan du får Carnoy fikseringsopløsning.
- Tør spreads ved stuetemperatur, pletten med 0,1 ug / m Hoechst-33342 ved nedsænkning til 15-20 min i Coplin Jar og vask 3x med DPBS. Se tabel for Materialer og reagenser for information om, hvordan du får Hoechst-33342 løsning. <li> Se breder sig på fluorescens / fasekontrastmikroskop ved 40X forstørrelse. Efter optimering spredt forberedelse, behøver spreads ikke farves med Hoechst-33342. Se breder sig på fasekontrastmikroskop ved 10X forstørrelse til at bestemme spredningen kvalitet og separation som skitseret i afsnittet Resultater (se figur 3).
- Vælge og cirkel gode smørematerialer med et Diamond Point markør på den modsatte side af slæden (dvs. spredt-fri side).
- Store spreder ved -20 ° C i op til en måned. Undgå udsættelse for fugt.
3. fluorescens in situ hybridisering (FISH)
- Stabilisering og dehydrering spreads
BEMÆRK: Ækvilibrere metafase kromosom breder sig til stuetemperatur, hvis det opbevares ved -20 ° C. Se tabel for Materialer og reagenser for oplysninger om, hvordan du anskaffer og gøre reagenser.- Inkuber metafase kromosom smørbare 200 pi RNase A for1 time ved 37 ° C.
- Wash glider i 2x-SSC puffer to gange i 5 min hver, efterfulgt af skylning med 10 mM HCI-opløsning.
- Inkuber smørematerialer med 1% pepsin i 10 minutter ved 37 ° C, skylles med deioniseret H2O og vaskes to gange med 2x-SSC buffer i 5 minutter hver.
- Inkuber smørematerialer med 4% paraformaldehyd i 10 min og vask i 2 x SSC puffer to gange i 5 min hver.
- Dehydrere spredes ved inkubering i 2 minutter i ethanol series: 70%, 80% og 95% ethanol.
- Air-tørre dias.
- Hybridisering Smørepålæg med L1 -mærket retrotranspositionshastigheder prober (dvs. SNeo)
ADVARSEL: For direkte-mærkede prober, holde sig væk fra lys på alle tidspunkter. Se tabel for Materialer og reagenser for oplysninger om, hvordan du anskaffer og gøre reagenser.- Tilsæt 30 ng SNeo til hybridiseringspuffer, varme ved 72 ° C i 10 minutter og afkøles i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt 30 pi SNeo probeopløsning til each spredning, dække med dækglas og forsegle kanterne med gummi cement. Sørg ingen bobledannelse.
- Opvarm objektglas ved 72 ° C i 5 minutter på en varmeblok, gradvist falde temperaturen til 37 ° C, og inkuberes natten over i et mørkt fugtigt kammer ved 37 ° C.
- Vask og visning (eller Tilsætning af sekundært antistof)
ADVARSEL: For direkte-mærkede prober, holde sig væk fra lys på alle tidspunkter.
BEMÆRK: Se tabel for Materialer og reagenser for information om, hvordan man forbereder. Anvendelse af tilstrækkelig volumen til at dække hele kromosom spredning anbefales. Husk, at overskydende volumen går tabt, når der tilsættes dækglas.- Fordybe objektglassene i 2 x SSC buffer til fjernelse dækglas.
- Skylning af objektglas ved nedsænkning i 2x-SSC buffer ved 45 ° C i 5 min.
- Skylning af objektglas ved nedsænkning i vaskebuffer ved 45 ° C i 5 min, 2x.
- Skylning af objektglas ved nedsænkning i 0,1 x SSC-buffer ved 45 ° C i 10 minutter.
- Skylning af objektglas ved nedsænkning i 2 x SSC-buffer ved 45 ° C i 10 minutter.
BEMÆRK: Placer en Coplin Jar indeholder anbefalede buffer i et vandbad, justere temperaturen til 45 ° C. - Cool lysbilleder til stuetemperatur og ligevægt dias i afsløring buffer.
- For direkte mærkede prober, gå til trin 3.4.10.
- For indirekte mærkede prober, blok i blokerende buffer i 20-30 min og vask 3x i DPBS.
- Inkuber med 50 pi sekundært antistof (fx 5 ug / ml streptavidin-FITC, eller αCY3 i blokerende buffer) i 1 time.
- Skylning af objektglas i 2x SSC i 5 minutter to gange.
- Kontrastfarve med Hoechst-33342-opløsning (0,1 ug / ml) i 10 minutter.
BEMÆRK: denne farvning er gjort for at plette kromosomer for co-lokalisering med sonde. - Vask i DPBS 3x, tilsættes en dråbe montering medium, placere et dækglas og forsegle kanterne med neglelak.
- Analyser L1 retrotransposition anvendelse af fluorescens mikroskop ved 40X magnification.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et skematisk diagram af L1-retrotransposition vektoren er vist i figur 1. Vektoren består af et neomycin-gen i antisense-orientering til L1 ORF'er der er afbrudt af en globin intron i sense-orientering og klemt sammen ved SD og SA sites. Når stabilt integreret i et kromosom, er L1 mRNA transkriberet fra den kombinerede CMV og L1-5'UTR promotor (figur 1). Under RNA-bearbejdning, er globin intron splejset ud af neomycingenet. The Neo L1 RNA er pakket, omplantes og integreres i genomet som enten en fuld længde eller trunkeret indsættelse. Som angivet kan L1 retrotransposition spores af FISH under anvendelse af prober specifikke for splejset neomycin (figur 1).
Figur 2 viser en skematisk repræsentation af neomycin probe, med labeled probed som er større i størrelse og fluorescens mangelfuld grund af forskelle i excitationsbølgelængder. Bemærk, at CY3 og FITC excite ved forskellige bølgelængder end ethidiumbromidfarvet DNA.
Densiteten af metafase kromosomspredninger blev bestemt ved at fortynde den oprindelige stamopløsning i 1: 2, 1: 4, 1: 8 og 1:16 fortyndinger og hvert opslag evalueret for tæthed, fordeling og afstand af smørematerialer fra kernen ved 10X forstørrelse ( Figur 3A). Resultaterne viser høj densitet, clumpy og udbrød smørepålæg (Figur 3A-I-II), såvel som jævnt fordelt og godt fordelte smørepålæg (Figur 3A-III-IV). Lav densitet smørbare jævn fordeling blev valgt til efterfølgende analyse.
Kromosom spreads blev farvet med Hoechst farvestof og spredning kvalitet evalueres baseret på længden af kromosomer, rundhed af spreads og inter-kromosom afstand (figur 3B). Disse indeks var påvirket af den tid, de celler blev behandlet med colcemid, hypotonisk løsning, Carnoy fikseringsopløsning og / eller den måde, hvorpå cellerne blev busted at frigive kromosomer. Hvis cellerne blev inkuberet i en kort periode i hypotonisk opløsning, blev kromosomspredninger stramt knyttede og individuelle kromosomer var vanskelige at visualisere (figur 3B-i). På den anden side, længere inkubation i hypotonisk opløsning resulterede i brud på kernerne, spredning af kromosomer, og / eller tab af kromosomer (figur 3B-ii). Længere inkubationer i colcemid steg antallet af celler i metafase, men føre til kondensation af kromosomer (figur 3B-iii). Som sådan en god kvalitet kromosom spredning kræver optimale inkubationstid i både colcemid og hypotonisk KCI-opløsning. I vores hænder, en 90 min inkubering i colcemid, 20 i hypotonisk opløsning ved 37° C, og anvendelsen af en varm damp for at sprænge cellerne viste sig at være optimale betingelser til generering af høj kvalitet smørepålæg (figur 3B-IV).
Kromosomspredninger blev farvet for L1 retrotransposition anvendelse af prober, der er målrettet SNeo. Proben blev mærket med både FITC og CY3 at vise, at L1 retrotransposition i begge tilfælde ses kun i celler, der udtrykker vildtype L1 (Figur 4). Ingen farvning blev set i celler, der udtrykker vektoren rygrad alene (figur 4; sammenlign øverste og nederste paneler for hver fluorofor). I vores hænder, blev sonden signal påvist i 80-90% af kerner, med det overvældende flertal af signalet, der repræsenterer enkelte retrotranspositionshastigheder begivenheder. Vi kun scoret retrotransposition i kerner med mere end en indsættelse og spredning kvalitet var altid undersøgt før FISH.
Figur 1. Skematisk diagram af L1 retrotransposition vektor. Diagram viser processen med målet prime revers transkription fører til fuld eller afkortet L1 indrykninger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Mærket SNeo og umærkede neomycin sonder. Den mærkede probe udviser mindre fluorescens og er større i størrelse i forhold til den umærkede sonde. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Fase-kontrast (Bright Field) og Hoechst pletten kromosomspredninger. A) viser fortynding af smørematerialer at opnå godt fordelte præparater. Scale bar er 50 um. B) Hoechst pletten kromosom viser indflydelsen af colcemid, hypotonisk løsning, Carnoy fikseringsopløsning og sprængfyldt på spredningen kvalitet. Scale bar er 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. FISH-analyse af L1 retrotransposition. Farvning af SNeo er fraværende i kontrolceller, men til stede i celler, der udtrykker L1 vildtype vektor. Scale bar er 10 um.Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoder såsom hele genomet sekventering, invers PCR og Southern blotting er blevet anvendt til at studere L1 retrotransposition. Selv om disse metoder er yderst værdifulde i lokalisering hvor L1 indrykninger forekomme inden genomer, en confounding udfordring for dem alle er behovet for in-silico programmering at samle sekvenser. FISH metode, der beskrives her, er designet til at supplere disse metoder, især i tilfælde af undersøgelser, der kræver analyser af ektopisk L1 retrotransposition i dyrkede celler. Tilgangen kan anvendes til både kvantitativ og kvalitativ vurdering af retrotranspositionshastigheder begivenheder og påføres på interfase cellekerner. Denne metode kan prale nøjagtigheden af de efterfølgende in-silico sekvens alignment metoder, der anvendes til at bestemme ektopiske L1 insertionssteder 16. Alignment af repetitive sekvenser kan være tvetydige grund af dannelsen af homopolymerer, mens gentagne sequences kan gå tabt under primer amplifikation af template resulterer i underrepræsentation af repetitive sekvenser. FISH metode kan overvinde disse problemer, fordi FISH-prober kan anneale til homopolymerer og er usandsynligt, at være forudindtaget mod intakte gentagelsessekvenser 16. Hertil kommer, sammenlignet med cellekultur-baserede retrotranspositionshastigheder analyser, kan FISH bestemme retrotranspositionshastigheder på det indre kerne niveau. Som sådan er denne tilgang forhindrer både under og over estimering af retrotranspositionshastigheder som flere indsættelser kan forekomme i enkelte kerner 16. De seneste data fra NGS har bekræftet, at cellekultur baserede metoder undervurderer retrotranspositionshastigheder frekvenser 25.
Det er fortsat uklart, hvor unge L1S foretrækker at indsætte og hvorvidt en målrettet mekanisme eksisterer for at dirigere disse indrykninger i genomet. Under anvendelse af ovennævnte metode, vi har vist, at L1 indsætter fortrinsvis i gen dårlig reregioner af genomet 16. Andre har vist, at den overflod af L1-sekvenser er stigning i kromosomer med mindre gen tæthed 17,18. Sammen disse resultater tyder på en reguleret form for indsættelse, hvor trusler mod cellen minimeres ved indsættelse af L1 til "mindre aktive" områder af genomet. Mønstret af transposerbare element bevægelse i lavere organismer har givet støtte til denne fortolkning. F.eks fission gær retrotransposon, TF1, integrerer 95% af tiden opstrøms for genpromotorer og størstedelen af disse gener er involveret i stress regulering 19,20. I gærceller, der mangler adgang til nitrogen, Ty5 integrerer i ORF'erne stedet for heterochromatin regioner 21. Forsøg i majs har vist, at integration af DNA-transposoner medføre brogede majs farve fænotyper og integration af Hatvine1-RRM DNA transposon i promotorregionen af VvTFL1A genet er blevet vist at influenCE forgrening mønster og frugten størrelse vinstokke 22,23.
Trinene kritiske for succes i FISH metode beskrevet her er den generation af gode kromosom spreads og korrekt mærkning, rensning og hybridisering af sonder. Hvis sonder ikke er renset ordentligt, vil det resulterende høje baggrund signal gør det vanskeligt at løse sonde binding til kromosomer. Fortrinsvis bør prober være geloprenset at fjerne den resterende fluorescens fra dNTP'er. Også den tid, smørematerialer inkuberes i Carnoy fikseringsopløsning er vigtigt at forberede gode kromosomspredninger. Hvis for længe, kan cellemembranen sprænges for tidligt og forårsage kromosom tab. Hvis for kort, kan det være vanskeligt at opnå passende spænd på grund af mangelfuld membran brud. Mængden / koncentrationen af formamid bestemmer fokus for kromatider og derfor er det vigtigt at optimere empirisk for de bedste resultater. Alle vasker bør være grundig til ENSURE, at alle ubundne prober og sekundære antistoffer vaskes af.
Som konklusion kan FISH metodikken beskrevet her anvendes til at detektere både fuld længde og afkortede ektopiske L1 retrotranspositionshastigheder begivenheder og kan anvendes til andre retrotranspositionshastigheder vektorer under anvendelse grønt fluorescensprotein (GFP) som en retrotransposition indikator kassette. Selvom fuld længde L1 insertioner kan bestemmes ved hjælp af denne metode, vil det ikke skelne nye endogene trunkerede insertioner på grund af antallet af trunkerede L1 s i genomet. Tilgængeligheden af sonden kan også være begrænset af øget heterochromatin dannelse 16,24. Imidlertid kan medtagelse af LNA inden FISH-prober anvendes til at forbedre probeannealing. Påvisning af SNeo er betinget en fuld cyklus af retrotransposition og indsættelser mindre end sonden / sletning kan blive savnet.
For detaljerede beskrivelser af eksperimenter i which anvendelsen af disse vektorer og ekspression af L1-proteiner og retrotransposition er karakteriseret henvises til offentliggjorte værker 12,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen potentielle konkurrerende interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labeling Probes | |||
| Go Tag DNA polymerase | Promega | M3178 | |
| GO Tag 10x colorless buffer | Promega | M3178 | |
| Individual dNTP | Sigma | DNTP10 | Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2 mM and dTTP to 1.5 mM in nuclease free water. |
| dUTP-16-Biotin (0.5 mM) | Roche | 11093070910 | |
| dUTP-FITC (0.5 mM) | Thermo Scientific | R0101 | |
| dUTP-CY3 (0.5 mM) | Sigma | GEPA53022 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3625 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3225 | |
| NucleoSpin PCR Clean-Up kit | Qiagen | 1410/0030 | Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit |
| PCR Machine | Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product. | ||
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Preparing chromosome Spreads | |||
| Colcemid | Life Technologies | 15212-012 | Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/ml |
| 1 M KCl | Sigma | P9541 | Dilute 1 M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution |
| Carnoy Fixative Solution | Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime. | ||
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Diamond Point Marker | Thermo Scientific | 750 | |
| Frosted Slides | Thermo Scientific | 2951-001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | R001100 | To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 min and inactive with equal volume of complete media. |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Heat Block | Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended. | ||
| Beaker (600 ml) | Sigma | CLS1003600 | Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes. |
| Nikon Microscope | Nikon | 125690 | Any microscope can be used to look at spread quality. |
| Reagents and Materials for FISH | |||
| Trisodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Sodium Chroride | Sigma | S3014 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Tween-20 | Sigma | F1379 | |
| Detran Sulfate | Sigma | D8906 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Salmon Sperm DNA | Life Technologies | 15632-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A8531 | |
| HCl (N) | Sigma | 38283 | |
| Ethyl Alcohol | Sigma | 459844 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Rnase A | Sigma | R4642 | |
| Pepsin | Sigma | P6887 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Rubber Cement/Cytobond Sealant | 2020-00-1 | ||
| Seven Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Dark Humidified chamber | Sigma | CLS2551 | |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Dry Digital Heat Block | VWR | 13259 | |
| Fluorescence Microscope | |||
| 20x Saline-Sodium Citrate (20x SSC) | Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 ml of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C. | ||
| 1 mg/ml of Rnase A | Dilute 20x SSC buffer to 2x SSC buffer. Dissolve RNase A in 2x SSC buffer to a final concentration of 1 mg/ml. Make fresh solution every time. | ||
| 1% Pepsin | Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1% solution. Make fresh every time. | ||
| 4% Paraformaldehyde (4% PFA) | Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 ml of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 ml, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 ml aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde. | ||
| Wash Buffer | Combine 100 ml of Formamide (20%) with 2.5 ml of 20x SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 ml with molecular grade H2O. | ||
| Hybridization Buffer | Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/ml Salmon Sperm DNA in 2x SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are; titrate the amount. | ||
| Detection Buffer | Dilute 20x SSC buffer to 4x and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer. | ||
| Blocking Buffer | Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4x SSC buffer. | ||
| Dehydrating Solution | Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions. | ||
References
- Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. Reverse transcriptase encoded by a human transposable element. Science. 254, 1808-1810 (1991).
- Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition. Cell. 87, 905-916 (1996).
- Clements, A. P., Singer, M. F. The human LINE-1 reverse transcriptase:effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain. Nucl Acids Res. 26, 3528-3535 (1998).
- Martin, S. L., Branciforte, D., Keller, D., Bain, D. L. Trimeric structure for an essential protein in L1 retrotransposition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13815-13820 (2003).
- Khazina, E., et al. Trimeric structure and flexibility of the L1ORF1 protein in human L1 retrotransposition. Nat Struct Mol Biol. 18, 1006-1014 (2011).
- Martin, S. L., Li, J., Weisz, J. A. Deletion analysis defines distinct functional domains for protein-protein and nucleic acid interactions in the ORF1 protein of mouse LINE-1. J Mol Biol. 304, 11-20 (2000).
- Martin, S. L. Ribonucleoprotein particles with LINE-1 RNA in mouse embryonal carcinoma cells. Mol Cell Biol. 11 (9), 4804-4807 (1991).
- Hohjoh, H., Singer, M. F. Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA. EMBO J. 15, 630-639 (1996).
- Cost, G. J., Feng, Q., Jacquier, A., Boeke, J. D. Human L1 element target-primed reverse transcription in vitro. EMBO J. 21, 5899-5910 (2002).
- Szak, S. T., et al. Molecular archeology of L1 insertions in the human genome. Genome Biol. 3, (2002).
- Sen, S. K., Huang, C. T., Han, K., Batzer, M. A. Endonuclease-independent insertion provides an alternative pathway for L1 retrotransposition in the human genome. Nucl Acids Res. 35, 3741-3751 (2007).
- Bojang, P. Jr, Roberts, R. A., Anderton, M. J., Ramos, K. S. Reprogramming of the HepG2 genome by long interspersed nuclear element-1. Mol Oncol. 7, 812-825 (2013).
- Boeke, J. D., Garfinkel, D. J., Styles, C. A., Fink, G. R. Ty elements transpose through an RNA intermediate. Cell. 40, 491-500 (1985).
- Heidmann, T., Heidmann, O., Nicolas, J. F. An indicator gene to demonstrate intracellular transposition of defective retroviruses. PNAS. 85, 2219-2223 (1988).
- Moran, J. V., et al. High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells. Cell. 87, 917-927 (1996).
- Bojang, P. Jr, Anderton, M. J., Roberts, R. A., Ramos, K. S. De novo LINE-1 retrotransposition in HepG2 cells preferentially targets gene poor regions of chromosome 13. Genomics. 104, 96-104 (2014).
- Rozen, S., et al. Abundant gene conversion between arms of palindromes in human and ape Y chromosomes. Nature. 423, 873-876 (2003).
- Graves, J. A., Koina, E., Sankovic, N. How the gene content of human sex chromosomes evolved. Curr Op Gen Develop. 16, 219-224 (2006).
- Leem, Y. E., et al. Retrotransposon Tf1 is targeted to Pol II promoters by transcription activators. Mol Cell. 30, 98-107 (2008).
- Guo, Y., Levin, H. L. High-throughput sequencing of retrotransposon integration provides a saturated profile of target activity in Schizosaccharomyces pombe. Genome Res. 20, 239-248 (2010).
- Dai, J., Xie, W., Brady, T. L., Gao, J., Voytas, D. F. Phosphorylation regulates integration of the yeast Ty5 retrotransposon into heterochromatin. Mol Cell. 27, 289-299 (2007).
- McClintock, C. B. The origin and behavior of mutable loci in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 344-355 (1950).
- Fernandez, L., Torregrosa, L., Segura, V., Bouquet, A., Martinez-Zapater, J. M. Transposon-induced gene activation as a mechanism generating cluster shape somatic variation in grapevine. Plant J Cell Mol Biol. 61, 545-557 (2010).
- Garcia-Perez, J. L., et al. Epigenetic silencing of engineered L1 retrotransposition events in human embryonic carcinoma cells. Nature. 466 (7307), 769-773 (2010).
- Rodic, N., et al. Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductual adenocarcinoma. Nat Med. 21 (9), (2015).
