Summary
כאן אנחנו מעסיקים מתודולוגיה FISH לעקוב ורטרו-טרנספוזיציה LINE-1 ברמת הגרעינים היחידה בפערי כרומוזום של שורות תאי HepG2 להביע LINE-1 הסינטטי ביציבות.
Introduction
אדם הארוך וביניהם גרעיני Element-1 (קו-1 או L1) הוא מרכיב נייד אוטונומי, המתקדם בתוך הגנום באמצעות "העתק ודבק" מנגנון ורטרו-טרנספוזיציה. L1 אדם טיפוסי הוא ~ 6 kb ארוך ומורכב 5'UTR (אזור מתורגם) המשמש כמקדם, שתי מסגרות קריאה פתוחות (ORFs): L1 -ORF1 ו L1 -ORF2, וכן 3'UTR עם פולה יש זנב L1 חלבון -ORF1 שלושה תחומים נפרדים:. תחום סליל סליל, RNA הכרת Motif ו- C- מסוף תחום, בעוד חלבון L1 -ORF2 יש endonuclease, הפוך transcriptase ותחומים עשירים ציסטאין 1,2,3,4,5. L1 -ORF1 מפגין פעילות המלווה חומצות גרעין, בעוד L1 -ORF2 מספק פעילות אנזימטית, עם שני החלבונים הדרושים עבור ורטרו-טרנספוזיציה 1,2,6.
מחזור של L1 ורטרו-טרנספוזיציה מתחיל עם תעתיק מן 5'UTR של L1 L1 -ORF1 או ציס -binding בו חבילות RNA משלה או -binding טרנס בו חבילות RNAs אחרים (כלומר, סינוס / SVAs / פסוידו) כדי ליצור חלקיק ribonucleoprotein (RNP) עם L1 -ORF2p 7, 8. RNPs translocate לתוך הגרעין שבו פעילות endonuclease של ניקס L1 -ORF2p הדנ"א הגנומי (gDNA) כדי לחשוף את OH - קבוצה 9, כי הוא בתורו שמוצג טרנסקריפטאז הפוך הממשלה הפוכה לסנתז RNA ל- DNA מסוף '3. במהלך סינתזה הפוכה, הגדיל השני של ה- DNA הוא פצע 7-20 נ"ב מאתר ניק המקורי כדי ליצור הפסקות מעד אשר מלאות ליצירת רצפי כניסת L1 החתימה (למשל, TTTTAA) בשם כפילויות אתר היעד (TSD) 9,10. תהליך זה ידוע בשם שעתוק לאחור ממשלת היעד (TPRT) ומוביל insertiעל של עותקים מלאים או קטועה של DNAs L1 / אחרים עם TSDs בשני קצותיו של רצף מוכנס. ורטרו-טרנספוזיציה L1 הוכח גם להיות מתווכת דרך הקצה שהצטרף שאינם הומולוגיים TPRT דמוי בסוגי תאים מסוימים 11.
וקטור ורטרו-טרנספוזיציה L1 המועסקים המחקרים שלנו הוא בלתי episomal והוא מורכב מתויג L1 -ORF1 & מונע 2p ידי היזמים CMV-L1-5'UTR משולב (איור 1) 12. גרסאות מוקדמות יותר של מבנה זה תוארו במחקרים באמצעות שמרים תרביות תאים אנושיים 13,14,15. שני היזמים CMV ברורים הממוקם 5 'ו 3' מסתיים של וקטור, עם הסוף '3 להציב אוריינטציה הפוכה לנהוג ביטוי של neomycin לאחר שחבור ואינטגרציה. הקלטת מחוון ורטרו-טרנספוזיציה בסוף '3 מורכב antisense מוכנס גנים neomycin כדי L1 -ORFs ויהפכו פעיל על ידי הפרדה לשני חצאים על ידי גושב אינטרון עם תורם שחבור (SD) ו acceptor שחבור (SA) אתרים (איור 1). עם האינטגרציה לתוך כרומוזום, L1 הוא עבד מן האמרגן המשותף לייצר mRNA שמורכבת mRNA bicistronic ו mRNA neomycin הפעיל. במהלך עיבוד RNA, האינטרון גלובין עובר שחבור מתוך הגן neomycin לשחזר גן neomycin מתפקדת במלואה. ה- mRNA ההיברידית ארוזה לתוך RNP ב CIS ו translocated לתוך הגרעין שם הוא משולב לתוך הגנום גם בתור הוספות באורך מלא או קטומים באמצעות TPRT.
כאן אנו מתארים מתודולוגיה המשתמשת קרינת כלאה באתרו (FISH) עם בדיקות המכוונות באופן ספציפי על גן neomycin השחבור (SNeo) כדי לעקוב אחר דפוסי L1 -retrotransposiition ושיעורי כניסה ברמת הגרעין היחידה. היעיל והספציפי של זיהוי אושר באמצעות ורטרו-טרנספוזיציה מוסמכת ובונה חסרה ו חלליות Detect SNeo או neomycin ו גלובין אינטרון צומת 16. מתודולוגיה זו מהווה חלק מן החסרונות של מבחנים ורטרו-טרנספוזיציה מבוססת תרבית תאים, כגון הוספות מרובות, התנגדות מושבה והרחבת שיבוט חיובית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הצעדים צריכה להתבצע בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. עיין בסעיף ריאגנטים לפרטים על איך להכין ריאגנטים בודדים.
1. בדיקות תיוג L1
הערה: בדיקות יכולות להיות מתויגות על ידי תיוג כימי או PCR.
- תיוג כימי
- הפוך ג'ל agarose 0.7-1% טריס-אצטט-EDTA (TAE) חיץ, חום במיקרוגל עד שהיא נמסה, לאפשר את הג'ל להתקרר, ולאחר מכן להוסיף ברומיד ethidium (0.5 מיקרוגרם / מ"ל). יוצקים לתוך מגש ג'ל, להוסיף מסרקים ולאפשר ג'ל כדי לחזק בטמפרטורת החדר.
- לייבל חללית SNeo (1-2 מיקרוגרם) עם CY3 או FITC ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. על פי הפרוטוקול של היצרן.
הערה: SNeo מציין את S pliced ניאו גן mycin הביע לאחר מחזור מלא של ורטרו-טרנספוזיציה. החללית נמצאת ~ 1,000 נ"ב בגודל. SNeo ניתן PCR מוגבר מכל וקטור או genomic DNA. ראה טבלה של חומרים ריאגנטים עבור מידע על streptavidin-CY3 / ריאגנטים תיוג FITC. - מערבב את פתרון בדיקת SNeo שכותרתו עם חיץ טעינת ה- DNA 1x, עומס לבאר כל ולהפעיל 75-100 וולט במשך 15-20 דקות.
- דמיין את להקת הבדיקה באמצעות Illuminator אולטרה ויולט (UV). שימו לב שהגודל של חללית SNeo ניתן לכוונן כי חומצת גרעיני Lock (LNA) ניתן גם להוסיף (איור 2).
- Cut שכותרתו בדיקת SNeo מן הג'ל עם להב נקי, solubilize ולטהר את חללית SNeo מן הג'ל באמצעות ערכת ה- PCR ניקיון על פי הפרוטוקול של היצרן.
זהירות: כיסוי כל חלק חשוף של הגוף עם מגינים מגנים (כלומר, מעיילי מעבדת מסיכת פנים ברורים UV) בעת הצגה וחיתוך הג'ל. ראה טבלה של חומר ריאגנטים עבור מידע ג'ל לטהר מוצרי PCR. - הפעל שוב 5 μl של SNeo שכותרתו בדיקה עם החללית SNeo שכותרתו האו"ם על ג'ל agarose 0.7% (ראה 1.1.1) כדי להונותעלייה וירידה גודל הפירמה של עוצמת האות (איור 2).
- לכמת את כמות תווית בדיקה SNeo על ידי מדידת ספיגת ב 260 ננומטר ו לדלל את החללית SNeo עד 10 ng / aliquots μl ב nuclease חינם H 2 O. aliquots חנות ב -20 ° C.
- תיוג PCR (שיטה חלופית תיוג בדיקה)
- שלב פריימרים ספציפיים SNeo (5'-ggatagcattgggagatatacct-3 '5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3') עם ריאגנטים PCR לתוך צינור יחיד: 13.6 H חינם nuclease μl 2 O; 0.1 dATP μl, dCTP, dGTP (10 ננומטר); 0.05 μl dTTP (10 ננומטר); 0.05 μl dUTP ביוטין / dUTP-FITC / CY3 (10 ננומטר); 4 μl עבור תג 5x חיץ; 0.4 μl עבור פולימראז תג; 1 μl תבנית SNeo (10 נ"ג). ראה טבלה של חומרים ריאגנטים עבור מידע על חומרים כימיים PCR.
- התאם את הסכום של כל מגיב ידי כפל המספר הכולל של דגימות.
- השתמש בפרמטר אופני PCR הבאיםהים כדי להגביר בדיקות תווית SNeo: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 35 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 62 ° C למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות; 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; החזק ב 4 ° C ללא הגבלת זמן.
הערה: טמפרטורת החישול יכולה להיות מותאמת או שיפוע PCR ניתן להשלים לקביעת טמפרטורות חישול אופטימליות עבור בדיקות אחרות. - הפוך 0.7-1% ג'ל כאמור בסעיף 1.1.1, עומס ולדמיין את הלהקה בדיקה כאמור בסעיף 1.1.4.
- חותכים ולטהר את החללית SNeo שכותרתו כאמור בסעיף 1.1.5.
- הפעל שוב 5 μl של SNeo שכותרתו בדיקה עם חללית SNeo שכותרתו האו"ם לאשר עליית גודל ואובדן עוצמת אות (ראה איור 2).
- לכמת את כמות תווית בדיקה SNeo ידי ספיגת מדידה ב 260 ננומטר ו לדלל החללית SNeo עד 10 ng / aliquots μl ב nuclease חינם H 2 O.
2. ממרחי כרומוזום הכינו
- ליצור שיבוטים יציבים להביע עמוד שדרת וקטור (control) או ורטרו-טרנספוזיציה המוסמכות L1 באמצעות מתודולוגיות מבחר סטנדרטי. 12,16 בעוד הכתבים הלא episomal שימשו לתאם הממצאים עם מחקרים של שעתוק, וקטורים episomal יכול לשמש גם. לגדל תאים המבטאים שליטה ביציבות או וקטור L1 (1 x 10 6 תאים לכל צלחת 10 ס"מ, עם התאמות בגודל צלחת עשה כנדרש) בתקשורת צמיחה מלאה. עבור תאים HepG2, להשתמש RPMI-1600, 10% FBS ו -200 מיקרוגרם / מ"ל של hygromycin. לגדול תרבויות כדי מפגש 70% ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
הערה: הבחירה של מדיום הגידול תלויה בסוג התא. בהתחשב בכך פלסמידים משמשים כאן לשאת קלטות בחירה היא hygromycin ו neomycin, מבחר יציב של שיבוטים יכול להיעשות גם עם neomycin לאחר בחירה על hygromycin, אבל כמות neomycin צריך להיות מותאמת כדי לקבוע רמות סובלנות כלפי כל סוג תא. - להוסיף colcemid (0.4 מיקרוגרם / מ"ל) עד בינוני תרבות דגירה במשך 90 דקות כדי לעצור התאים ב metaphASE. אם באמצעות תאים מסוגים שונים, לקבוע את הריכוז האופטימלי של colcemid וזמן חשיפה (60, 90, ו -120 דקות) מעצר metaphase אופטימלי באופן אמפירי.
- לשטוף את התאים 2X עם 10 מ"ל של PBS של 1x Dulbecco (DPBS), trypsinize על ידי הוספת 3-5 מ"ל של 0.25% פתרון טריפסין אל התאים דגירה במשך 5 דקות כדי לנתק את התאים. להשבית טריפסין עם כמות שווה של התקשורת המכיל 10% FBS.
- צנטריפוגה התאים למשך 2 דקות XG ב 1000 ב 4 מעלות צלזיוס, לשאוב את המדיום מן התא גלולה לשטוף את התאים עם DPBS. לשאוב כל DPBS, עוזב 200 μl של DPBS מחדש להשעות את התאים. ודאו תאים מעורבבים היטב שכל הגושים מפוזרים. השתמש מהבהב או pipetting עדין לערבב לפזר גושים ולהימנע vortexing.
- הוסף 5 מ"ל של תמיסת hypotonic (כלומר, 75 מ"מ KCl) כי הוא מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס ירידה מבחינת תוך סיבוב הצינור 15 מ"ל אופקית ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. ראה טבלה של חומרים Reagents לקבלת מידע על האופן שבו תוכל להשיג את הפתרון hypotonic.
- תאים צנטריפוגה ב 120 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C וחזור על שלבים 2.4 - 2.5 3x עוזב כ 200 μl של פתרון hypotonic מחדש להשעות את התאים לאחר כל שטיפה. ודא כי בסוף של 3 שוטף, הגלולה היא בעליל לבן ונפוח.
- Re- להשעות גלולה ב 200 μl של פתרון Carnoy מקבע ולעשות 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 דילולים בתמיסה Carnoy מקבע. ירידה של כ -10 μl של דילול כל לשקופית נקיה ויבשה מכ 1 סנטימטר מעל ומייד לחשוף את הצד ללא התפשט אדים חמים מים רותחים למשך 30 שניות. ראה טבלה של חומרים ריאגנטים עבור מידע על איך לעשות פתרון Carnoy מקבע.
- יבש את המרווחים בטמפרטורת החדר, כתם עם 0.1 מיקרוגרם / מ"ל Hoechst-33342 על ידי טבילה למשך 15-20 דקות בצנצנת Coplin ולשטוף 3x עם DPBS. ראה טבלה של חומרים ריאגנטים עבור מידע על איך לעשות את הפתרון Hoechst-33342. <li> צפה מתפשט על מיקרוסקופ פלואורסצנטי / שלב בניגוד בהגדלה 40X. לאחר אופטימיזציה הכנה התפשטות, ממרחים לא צריך להיות מוכתם Hoechst-33342. צפו מתפשט על מיקרוסקופ שלב בניגוד בהגדלה 10X לקבוע איכות הפרדת התפשטות כפי שמתוארת בסעיף התוצאות (ראה איור 3).
- בחר ולכרוך ממרחים טובים עם מרקר פוינט יהלומים בצד הנגדי של השקופית (כלומר, להפיץ ללא צד).
- חנות מתפשטת ב -20 ° C עד חודש. המנעו מחשיפה ללחות.
3. הקרינה הכלאה באתרו (FISH)
- ייצוב dehydrating ממרחים
הערה: לאזן כרומוזום metaphase פורש לטמפרטורת חדר אם מאוחסן ב -20 ° C. ראה טבלה של חומרים ריאגנטים עבור מידע על איך להשיג ולעשות ריאגנטים.- כרומוזום metaphase דגירה מתפשט באות A RNase 200 μl עבורשעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
- לשטוף מחליק חיץ 2x-SSC פעמיים במשך 5 דקות כל אחד ואחריו שטיפה עם 10 פתרון מ"מ HCl.
- דגירה ממרחים עם פפסין 1% למשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לשטוף עם deionized H 2 O ולשטוף פעמיים עם חיץ 2x-SSC במשך 5 דקות כל אחד.
- דגירת ממרחים עם paraformaldehyde 4% במשך 10 דקות ולשטוף במאגר SSC 2x פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
- מייבשים שהפיץ דוגרים במשך 2 דקות בסדרת אתנול: 70%, 80%, ו -95% אתנול.
- שקופיות אוויר יבשות.
- הכלאה ממרחים עם בדיקות -labeled ורטרו-טרנספוזיציה L1 (כלומר, SNeo)
זהירות: לקבלת בדיקות ישירות שכותרתו, להתרחק מן האור בכל העת. ראה טבלה של חומרים ריאגנטים עבור מידע על איך להשיג ולעשות ריאגנטים.- להוסיף 30 ng של SNeo למאגר הכלאה, חום 72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ומצננים במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף 30 μl של פתרון בדיקה SNeo לדוארהתפשטות ACH, ומכסים coverslip וסוגרים את הקצוות עם מלט גומי. ודא שלא היווצרות בועה.
- מחמם את השקופית על 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות על גוש חום, טיפה את הטמפרטורה בהדרגה ל -37 מעלות צלזיוס, דגירת הלילה בתא humidified בחושך ב 37 ° C.
- כביסה והצגה (או תוספת של נוגדנים משני)
זהירות: לקבלת בדיקות ישירות שכותרתו, להתרחק מן האור בכל העת.
הערה: ראה טבלה של חומרים ריאגנטים עבור מידע על איך להכין. שימוש נפח מספיק כדי לכסות את התפשטות כרומוזום כולו מומלץ. זכור כי נפח עודף יאבדו כאשר coverslip מתווסף.- לטבול שקופיות חיץ 2x SSC להסיר coverslips.
- לשטוף שקופיות על ידי טבילת חיץ 2x-SSC על 45 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- לשטוף שקופיות על ידי טבילת חיץ לשטוף ב 45 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 2x.
- לשטוף שקופיות על ידי טבילת חיץ SSC 0.1x על 45 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- לשטוף שקופיות על ידי טבילת חיץ 2x SSC על 45 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
הערה: מקום בצנצנת Coplin המכיל מאגר מומלץ באמבט מים, להתאים הטמפרטורה ל -45 מעלות צלזיוס. - מגלשות מצננים לטמפרטורת החדר לאזן שקופיות במאגר זיהוי.
- עבור בדיקות שכותרתו ישירות, דלג לשלב 3.4.10.
- עבור בדיקות שכותרתו עקיפות, בלוק בחסימת מאגר במשך 20-30 דקות ולשטוף 3x ב DPBS.
- דגירה עם 50 μl של נוגדנים משני (למשל, 5 מיקרוגרם / מ"ל streptavidin-FITC, או αCY3 בחסימת המאגר) במשך שעה 1.
- לשטוף שקופיות 2x SSC למשך 5 דקות פעמיים.
- Counterstain עם פתרון Hoechst-33342 (0.1 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 10 דקות.
הערה: מכתים זה נעשה כדי להכתים הכרומוזומים עבור שיתוף לוקליזציה עם החללית. - לשטוף DPBS 3x, להוסיף טיפה של הרכבה בינונית, במקום coverslip וסוגרים את הקצוות עם לק.
- לנתח ורטרו-טרנספוזיציה L1 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב 40X magnification.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תרשים סכמטי של וקטור ורטרו-טרנספוזיציה L1 מוצג באיור 1. וקטור מורכב גן neomycin באוריינטציה antisense כדי ORFs L1 כי מופרעת על ידי אינטרון גלובין באוריינטציה השכל ליברפול זכתה SD ואתרי SA. כאשר משולבים ביציבות לתוך כרומוזום, L1 mRNA הוא עבד מן CMV המשולב אמרגן L1-5'UTR (איור 1). במהלך עיבוד RNA, האינטרון גלובין עובר שחבור מתוך הגן neomycin. רנ"א הניא L1 ארוז, translocated והשתלב הגנום כמו גם באורך מלא או החדרה קטומה. כפי שצוין, ורטרו-טרנספוזיציה L1 יכול להיות מועבר על ידי FISH באמצעות בדיקות ספציפיות עבור neomycin שחבור (איור 1).
איור 2 מראה ייצוג סכמטי של החללית neomycin, עם labeleד חקרה שתופס יותר בגודלם קרינה לקויה בשל הבדלים באורכי גל עירור. ראוי לציין, כי CY3 ו FITC לרגש באורכי גל שונים מאשר DNA מוכתם ברומיד ethidium.
הצפיפות של ממרחי כרומוזום metaphase נקבעה על ידי דילול פתרון המניות המקורי לתוך 1: 2, 1: 4, 1: 8 ו 1:16 דילולים וכל התפשטות הערכת צפיפות, הפצה ומרחק ממרחים מהגרעין בהגדלה 10X ( איור 3 א). התוצאות מראות צפיפות גבוהה, clumpy ופרצה ממרחים (איור 3 א-א-ב), כמו גם מופץ באופן שווה וממרחים-מרווחים היטב (איור 3 א-III-IV). צפיפות נמוכה מתפשטת עם חלוקה שווה נבחרה לניתוח שלאחר מכן.
ממרחים כרומוזום הוכתמו איכות צבע והתפשטות Hoechst הערכה בהתבסס על האורך של כרומוזומים, העגלגלות של היםpreads ומרחק כרומוזום היתר (איור 3B). מדדים אלה הושפעו משך הזמן התאים טופלו colcemid, פתרון hypotonic, פתרון Carnoy מקבע ו / או את האופן שבו התאים היו שנעצר לשחרר הכרומוזומים. אם תאים הודגרו במשך תקופה קצרה פתרון hypotonic, ממרחים כרומוזום הפכו מהודק ו כרומוזומים בודדים היו קשים לדמיין (איור 3 ב-ט). מצד השני, דגירה כבר פתרון hypotonic הביאה לקרע של הגרעינים, פיזור של כרומוזומים, ו / או אובדן של כרומוזומים (איור 3 ב-ii). Incubations כבר colcemid הגדיל את מספר תאי metaphase, אבל להוביל התעבות של כרומוזומים (איור 3 ב-iii). ככזה, פער כרומוזום באיכות טוב דורש תקופות דגירה אופטימליות בשני colcemid פתרון KCl hypotonic. בידיים שלנו, דגירה 90 דקות ב colcemid, 20 בתמיסה hypotonic ב 37 ° C והשימוש של אדים חמים להתפוצץ בתאים נמצאו להיות תנאים אופטימליים הדור ממרחים איכותיים (איור 3 ב-ד).
ממרחים כרומוזום היו מוכתמים עבור ורטרו-טרנספוזיציה L1 באמצעות בדיקות המכוונות SNeo. החללית סומנה עם שני FITC ו CY3 להראות כי בשני המקרים ורטרו-טרנספוזיציה L1 נתפסה רק בתאי המבטאים L1 סוג בר (איור 4). אין מכתים נתפס בתאים המבטאים את עמוד שדרת הווקטור בלבד (איור 4; להשוות לוחות עליונים תחתונים עבור כל fluorophore). בידיים שלנו, אות בדיקה זוהה 80-90% של גרעינים, עם הרוב המכריע של האות המייצגת אירועים ורטרו-טרנספוזיציה יחיד. אנחנו רק בקיע ורטרו-טרנספוזיציה בגרעינים עם יותר מ החדרה אחד ואיכות ההתפשטות תמיד נבדקה לפני FISH.
ין-page = "1"> 
איור 1. תרשים סכמטי של וקטור ורטרו-טרנספוזיציה L1. תרשים המתאר את תהליך שעתוק לאחור ממשלת היעד מוביל הוספות L1 מלא או הקטוע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. תווית SNeo ו בדיקות neomycin ללא תווית. חללי שכותרתו מפגין פחות קרינה והוא גדול בגודל לעומת החללית ללא תווית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ין-page = "1"> 
איור 3. ניגודיות שלב (מואר שדה) וממרחי כרומוזום כתם Hoechst. א) מציג דילול של ממרחים להשיג הכנות מרווחות היטב. סרגל קנה מידה הוא 50 מיקרומטר. B) כרומוזום כתם Hoechst מראה את ההשפעה של colcemid, פתרון hypotonic, פתרון Carnoy מקבע ואת מתפרצת על איכות התפשטות. סרגל קנה מידה הוא 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ניתוח FISH איור 4. ורטרו-טרנספוזיציה L1. הכתמה של SNeo התאור בתאים שליטה, אך נוכח תאים המבטאים וקטור wildtype L1. סרגל קנה מידה הוא 10 מיקרומטר.אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מתודולוגיות כמו רצף הגנום כולו, הפוך PCR סופג דרומי הועסקה ללמוד ורטרו-טרנספוזיציה L1. למרות מתודולוגיות אלה הן בעלי ערך רב באיתור שבו הוספות L1 להתרחש בתוך הגנום, אתגר מבלבל עבור כל אחד מהם הוא הצורך תיכנות ב-סיליקון לצרף יחד רצפים. המתודולוגיה FISH המתואר כאן נועדה להשלים שיטות אלה, במיוחד במקרה של מחקרים הדורשים ניתוח ורטרו-טרנספוזיציה L1 אקטופי בתאים בתרבית. הגישה יכולה לשמש הן הערכה כמותית ואיכותית של אירועים ורטרו-טרנספוזיציה וכן להחיל שלבי גרעינים. מתודולוגיה זו מתגאה את הדיוק של שיטות יישור רצף ב-סיליקון עוקבות מועסקות על מנת לקבוע אתרי החדרת L1 אקטופי 16. מערך של רצפים חוזרים יכול להיות מעורפל עקב ההיווצרות של homopolymers, בעוד sequen חוזרתCES יכול ללכת לאיבוד במהלך הגברה פריימר של התבנית וכתוצאה מכך underrepresentation של רצפים חוזרים. המתודולוגיה FISH יכול להתגבר על בעיות אלה בגלל בדיקות FISH יכול לחשל את homopolymers והם צפויים להיות מוטה נגד רצפים חוזרים ללא פגע 16. בנוסף, בהשוואה לתא תרבות מבוססת מבחנים ורטרו-טרנספוזיציה, דגים יכולים לקבוע שיעורים ורטרו-טרנספוזיציה ברמת הגרעין היחידה. ככזה, גישה זו מונעת הן מתחת ומעל להערכת השיעורים ורטרו-טרנספוזיציה גם תוספות מרובות יכולות להתרחש לתוך יחיד גרעיני 16. נתונים אחרונים המתקבל NGS אישרו כי מתודולוגיות תרבית תאים מבוסס לזלזל תדרים ורטרו-טרנספוזיציה 25.
עדיין לא ברור היכן L1s הצעיר מעדיף להכניס והאם מנגנון מיקוד קיים לכוון הוספות אלה בתוך הגנום. באמצעות מתודולוגיה לעיל הראינו כי L1 מחדיר מועדף לתוך מחדש גן עניgions של הגנום 16. אחרים הראו כי השפע של רצפי L1 הוא הגידול כרומוזומים עם צפיפות גן פחותה 17,18. יחדיו, ממצאים אלה מצביעים על מצב מוסדר של הכנסה במקום איומים לתא הם מזעריים על ידי החדרת L1 לאזורים "פעילים במיעוטו" של הגנום. דפוס הפעולה של תנועת טרנספוזון באורגניזמים נמוך הביע את תמיכתה פרשנות זו. לדוגמה, retrotransposon שמרים ביקוע, TF1, המשלבת 95% מהזמן במעלה הזרם של היזמים הגן ואת רוב הגנים האלה מעורבים ברגולציה מתח 19,20. בתאי שמרים שאין להם אפשרות גישה חנקן, Ty5 משתלב ORFs במקום אזורים heterochromatin 21. ניסויים תירס הראו כי שילוב של transposons DNA להוביל פנוטיפים צבע תירס ססגוני ואינטגרציה של transposon DNA Hatvine1-rrm לאזור האמרגן של גנים VvTFL1A הוכח influenCe דפוס הסתעפות ואת גודל פרי וגפנים 22,23.
השלבים הקריטיים להצלחת המתודולוגיה FISH המפורטים כאן הם הדור של ממרחי כרומוזום טובים וסימון נכון, טיהור הכלאה של בדיקות. אם חלליות לא מנקה כמו שצריך, את אות רקע גבוה וכתוצאה מכך תקשה לפתור בדיקת מחייב הכרומוזומים. רצוי, בדיקות צריכות להיות ג'ל מטוהר לחסל קרינה השיורית מן dNTPs. כמו כן, את משך הזמן שמתפשט מודגרת בתמיסת Carnoy מקבע חשוב להכין ממרחי כרומוזום טובים. אם יותר מדי זמן, קרום התא עלול להתפוצץ בטרם עת ולגרום לאובדן כרומוזום. אם קצר מדי, זה עלול להיות קשה להשיג ממרחים מתאימים בגלל קרע בקרום לקוי. כמות / ריכוז של לפוראמיד קובע את מוקד כרומטידה ולכן חשוב לייעל באופן אמפירי עבור התוצאות הטובות ביותר. שוטף כל צריך להיות יסודי כדי ensיור שכל הבדיקות המאוגדות נוגדנים משני נשטפים את.
לסיכום, המתודולוגיה FISH המתואר כאן יכול לשמש כדי לזהות הן באורך מלא ואירועים ורטרו-טרנספוזיציה אקטופי L1 קטועה והוא יכול להיות מיושם על וקטורים ורטרו-טרנספוזיציה אחרים באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כמו קלטת אינדיקטור ורטרו-טרנספוזיציה. למרות הוספות באורך מלא L1 ניתן לקבוע באמצעות מתודולוגיה זו, זה לא יהיה להבחין הוספות קטומות אנדוגני חדשים בשל מספר L1 קטום הים בתוך הגנום. גברת הנגישות של חללית עשויה גם להיות מוגבלת על ידי היווצרות heterochromatin העלייה 16,24. עם זאת, הכללת LNA בתוך בדיקות FISH יכולה להיות מועסקת על מנת לשפר חישול חללי. איתור של SNeo מותנה מחזור מלא של ורטרו-טרנספוזיציה והוספות קטנה יותר הבדיקה / מחיקה ניתן לפספס.
לקבלת תיאורים מפורטים של ניסויים which שימוש וקטורים אלה לבין הביטוי של חלבוני L1 ורטרו-טרנספוזיציה מאופיין, מעיין שפורסם עובד 12,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שום אינטרסים מתחרים פוטנציאליים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labeling Probes | |||
| Go Tag DNA polymerase | Promega | M3178 | |
| GO Tag 10x colorless buffer | Promega | M3178 | |
| Individual dNTP | Sigma | DNTP10 | Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2 mM and dTTP to 1.5 mM in nuclease free water. |
| dUTP-16-Biotin (0.5 mM) | Roche | 11093070910 | |
| dUTP-FITC (0.5 mM) | Thermo Scientific | R0101 | |
| dUTP-CY3 (0.5 mM) | Sigma | GEPA53022 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3625 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3225 | |
| NucleoSpin PCR Clean-Up kit | Qiagen | 1410/0030 | Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit |
| PCR Machine | Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product. | ||
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Preparing chromosome Spreads | |||
| Colcemid | Life Technologies | 15212-012 | Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/ml |
| 1 M KCl | Sigma | P9541 | Dilute 1 M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution |
| Carnoy Fixative Solution | Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime. | ||
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Diamond Point Marker | Thermo Scientific | 750 | |
| Frosted Slides | Thermo Scientific | 2951-001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | R001100 | To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 min and inactive with equal volume of complete media. |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Heat Block | Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended. | ||
| Beaker (600 ml) | Sigma | CLS1003600 | Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes. |
| Nikon Microscope | Nikon | 125690 | Any microscope can be used to look at spread quality. |
| Reagents and Materials for FISH | |||
| Trisodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Sodium Chroride | Sigma | S3014 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Tween-20 | Sigma | F1379 | |
| Detran Sulfate | Sigma | D8906 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Salmon Sperm DNA | Life Technologies | 15632-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A8531 | |
| HCl (N) | Sigma | 38283 | |
| Ethyl Alcohol | Sigma | 459844 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Rnase A | Sigma | R4642 | |
| Pepsin | Sigma | P6887 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Rubber Cement/Cytobond Sealant | 2020-00-1 | ||
| Seven Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Dark Humidified chamber | Sigma | CLS2551 | |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Dry Digital Heat Block | VWR | 13259 | |
| Fluorescence Microscope | |||
| 20x Saline-Sodium Citrate (20x SSC) | Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 ml of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C. | ||
| 1 mg/ml of Rnase A | Dilute 20x SSC buffer to 2x SSC buffer. Dissolve RNase A in 2x SSC buffer to a final concentration of 1 mg/ml. Make fresh solution every time. | ||
| 1% Pepsin | Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1% solution. Make fresh every time. | ||
| 4% Paraformaldehyde (4% PFA) | Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 ml of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 ml, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 ml aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde. | ||
| Wash Buffer | Combine 100 ml of Formamide (20%) with 2.5 ml of 20x SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 ml with molecular grade H2O. | ||
| Hybridization Buffer | Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/ml Salmon Sperm DNA in 2x SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are; titrate the amount. | ||
| Detection Buffer | Dilute 20x SSC buffer to 4x and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer. | ||
| Blocking Buffer | Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4x SSC buffer. | ||
| Dehydrating Solution | Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions. | ||
References
- Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. Reverse transcriptase encoded by a human transposable element. Science. 254, 1808-1810 (1991).
- Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition. Cell. 87, 905-916 (1996).
- Clements, A. P., Singer, M. F. The human LINE-1 reverse transcriptase:effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain. Nucl Acids Res. 26, 3528-3535 (1998).
- Martin, S. L., Branciforte, D., Keller, D., Bain, D. L. Trimeric structure for an essential protein in L1 retrotransposition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13815-13820 (2003).
- Khazina, E., et al. Trimeric structure and flexibility of the L1ORF1 protein in human L1 retrotransposition. Nat Struct Mol Biol. 18, 1006-1014 (2011).
- Martin, S. L., Li, J., Weisz, J. A. Deletion analysis defines distinct functional domains for protein-protein and nucleic acid interactions in the ORF1 protein of mouse LINE-1. J Mol Biol. 304, 11-20 (2000).
- Martin, S. L. Ribonucleoprotein particles with LINE-1 RNA in mouse embryonal carcinoma cells. Mol Cell Biol. 11 (9), 4804-4807 (1991).
- Hohjoh, H., Singer, M. F. Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA. EMBO J. 15, 630-639 (1996).
- Cost, G. J., Feng, Q., Jacquier, A., Boeke, J. D. Human L1 element target-primed reverse transcription in vitro. EMBO J. 21, 5899-5910 (2002).
- Szak, S. T., et al. Molecular archeology of L1 insertions in the human genome. Genome Biol. 3, (2002).
- Sen, S. K., Huang, C. T., Han, K., Batzer, M. A. Endonuclease-independent insertion provides an alternative pathway for L1 retrotransposition in the human genome. Nucl Acids Res. 35, 3741-3751 (2007).
- Bojang, P. Jr, Roberts, R. A., Anderton, M. J., Ramos, K. S. Reprogramming of the HepG2 genome by long interspersed nuclear element-1. Mol Oncol. 7, 812-825 (2013).
- Boeke, J. D., Garfinkel, D. J., Styles, C. A., Fink, G. R. Ty elements transpose through an RNA intermediate. Cell. 40, 491-500 (1985).
- Heidmann, T., Heidmann, O., Nicolas, J. F. An indicator gene to demonstrate intracellular transposition of defective retroviruses. PNAS. 85, 2219-2223 (1988).
- Moran, J. V., et al. High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells. Cell. 87, 917-927 (1996).
- Bojang, P. Jr, Anderton, M. J., Roberts, R. A., Ramos, K. S. De novo LINE-1 retrotransposition in HepG2 cells preferentially targets gene poor regions of chromosome 13. Genomics. 104, 96-104 (2014).
- Rozen, S., et al. Abundant gene conversion between arms of palindromes in human and ape Y chromosomes. Nature. 423, 873-876 (2003).
- Graves, J. A., Koina, E., Sankovic, N. How the gene content of human sex chromosomes evolved. Curr Op Gen Develop. 16, 219-224 (2006).
- Leem, Y. E., et al. Retrotransposon Tf1 is targeted to Pol II promoters by transcription activators. Mol Cell. 30, 98-107 (2008).
- Guo, Y., Levin, H. L. High-throughput sequencing of retrotransposon integration provides a saturated profile of target activity in Schizosaccharomyces pombe. Genome Res. 20, 239-248 (2010).
- Dai, J., Xie, W., Brady, T. L., Gao, J., Voytas, D. F. Phosphorylation regulates integration of the yeast Ty5 retrotransposon into heterochromatin. Mol Cell. 27, 289-299 (2007).
- McClintock, C. B. The origin and behavior of mutable loci in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 344-355 (1950).
- Fernandez, L., Torregrosa, L., Segura, V., Bouquet, A., Martinez-Zapater, J. M. Transposon-induced gene activation as a mechanism generating cluster shape somatic variation in grapevine. Plant J Cell Mol Biol. 61, 545-557 (2010).
- Garcia-Perez, J. L., et al. Epigenetic silencing of engineered L1 retrotransposition events in human embryonic carcinoma cells. Nature. 466 (7307), 769-773 (2010).
- Rodic, N., et al. Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductual adenocarcinoma. Nat Med. 21 (9), (2015).
