Summary
Her benytter vi FISH metode for å spore LINE-en retrotransposition på enkelt kjerner nivå i kromosom sprer av HepG2 cellelinjer stabilt uttrykker syntetisk LINE-en.
Introduction
Menneskelig Long ispedd Nuclear Element-en (Linje 1 eller L1) er en autonom mobil element som forplanter seg i genomet gjennom en "kopier og lim" retrotransposition mekanisme. En typisk human L1 er ~ 6 kb langt og består av en 5'UTR (ikke-translatert område) som fungerer som en promoter, to åpne leserammer (ORF): L1 -ORF1 og L1 -ORF2, og en 3'UTR med en polyA . tail L1 -ORF1 protein har tre forskjellige domener: en spiral spiral domene, RNA anerkjennelse Motif og C-terminal domene, mens L1 -ORF2 protein har endonuklease, reverstranskriptasehemmere og cystein rike domener 1,2,3,4,5. L1 -ORF1 viser nukleinsyre anstand aktiviteter, mens L1 -ORF2 gir enzymatiske aktiviteter, med både proteiner som kreves for retrotransposition 1,2,6.
En syklus av L1 retrotransposition starter med transkripsjon fra 5'UTR av L1 L1 -ORF1 utstillinger enten cis -binding hvor det pakker sin egen RNA eller trans -binding hvor det pakker andre RNA (dvs. sinus / SVAs / pseudogener) for å danne en ribonucleoprotein partikkel (RNP) med L1 -ORF2p 7, 8. RNPs translocate inn i kjernen der endonuklease-aktiviteten til L1 -ORF2p hakk genomisk DNA (gDNA) for å eksponere en OH - gruppe 9, som er i sin tur anvendes ved revers transkriptase for å prime revers og syntetisere RNA til DNA fra 3'-enden. Under revers syntese, er den andre DNA bretter 7-20 bp fra den opprinnelige nick området for å skape forskjøvet pauser som er fylt til å danne signatur L1 innsetting sekvenser (f.eks TTTTAA) kalt target språk duplikasjoner (TSD) 9,10. Denne prosessen er kjent som target prime revers transkripsjon (TPRT) og fører til insertipå av full eller avkortede kopier av L1 / andre DNA med TSDs i begge ender av den innførte sekvens. L1 retrotransposition har også vist seg å være mediert gjennom TPRT-lignende ikke-homologe ende-sammenføyning i visse celletyper 11.
L1 retrotransposition vektor anvendt i våre studier er ikke-episomale og består av merket L1 -ORF1 & 2p drevet av kombinerte CMV-promotere L1-5'UTR (figur 1) 12. Tidligere versjoner av denne konstruksjonen har blitt beskrevet i studier med gjær og humane cellekulturer 13,14,15. To distinkte CMV promotorer som ligger ved 5 'og 3' ender av vektoren, sammen med 3'-enden som er lagt inn i motsatt retning for å drive ekspresjon av neomycin etter spleising og integrasjon. Den retrotransposition indikatoren kassetten ved 3'-enden inneholder et neomycin-genet innsatt antisense til L1 -ORFs og gjøres inaktive ved separasjon i to halvdeler ved en globi intron med skjøtes donor (SD) og skjøtes akseptor (SA) nettsteder (figur 1). Ved integrering inn i et kromosom er L1 transkribert fra en felles promoter for å fremstille et mRNA som består av en bicistronisk mRNA og inaktive neomycin mRNA. Under RNA prosessering, blir globin intron spleiset ut av neomycin-genet for å gjenopprette en fullstendig funksjonell neomycin-genet. Det hybride mRNA er pakket inn i en RNP i cis- og translokert til kjernen, hvor det er integrert i genomet som enten full lengde eller avkortet innføringer ved hjelp av TPRT.
Her beskriver vi en metode som bruker fluorescens in situ hybridisering (FISH) med prober spesifikt rettet mot skjøtes neomycin-genet (sneo) for å spore L1 -retrotransposiition mønstre og innsetting priser på enkelt kjernen nivå. Effektiviteten og spesifisitet for påvisning ble bekreftet ved hjelp retrotransposition kompetent og inkompetente konstruerer og sonder til Detect sneo eller neomycin og globin intron veikryss 16. Denne metodikken står for noen av svakhetene i cellekultur basert retrotransposition analyser, for eksempel flere innsettinger, koloni motstand og gunstig klon ekspansjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTE: Alle trinn bør utføres ved romtemperatur med mindre annet er angitt. Vennligst referer til Reagenser seksjon for detaljer om hvordan å forberede enkelt reagenser.
1. merking L1 prober
MERK: prober kan merkes ved kjemisk eller PCR merking.
- kjemisk merking
- Gjør 0,7 til 1% agarosegel i Tris-acetat-EDTA (TAE) -buffer, varme i en mikrobølgeovn inntil smeltet, at gelen avkjøles, og deretter legge til etidiumbromid (0,5 ug / ml). Hell over i gel skuffen, tilsett kammer og tillate gelen å stivne ved romtemperatur.
- Merke sneo probe (1-2 ug) med Cy3 eller FITC ved 37 ° C i 1 time i henhold til produsentens protokoll.
MERK: sneo betegner S pliced Neo mycin genet uttrykkes etter en hel syklus av retrotransposition. Sonden er ~ 1000 bp i størrelse. Sneo kan PCR amplifisert fra en hvilken som helst vektor eller fra genomic DNA. Se tabell for Materialer og reagenser for informasjon om streptavidin-Cy3 / FITC merking reagenser. - Bland den merkede sneo probe løsning med 1x DNA lasting buffer, belastning i hver brønn og kjøre på 75-100 volt for 15-20 min.
- Visual sonden bandet ved hjelp av en Ultra-Violet (UV) Illuminator. Legg merke til at størrelsen på sneo sonden kan justeres, og at låse kjerner syre (LNA) kan også bli tilsatt (figur 2).
- Snitt merket probe sneo fra gelen med en ren blad, oppløseliggjøre og rense sneo sonden fra gelen ved anvendelse av en PCR Clean Up-kit ifølge produsentens protokoll.
FORSIKTIG: Cover hver eksponert del av kroppen med beskyttende skjold (dvs. laboratoriefrakker og UV klart ansiktsmaske) når du ser og kutte gel. Se tabell over Materiale og reagenser for informasjon til gel rense PCR-produkter. - Re-run 5 mL av sneo merket probe med en un-merket sneo sonde på en 0,7% agarosegel (se 1.1.1) å lurefast størrelse økning og tap av signalintensitet (figur 2).
- Kvantifisere mengden av merket probe sneo ved å måle absorbansen ved 260 nm og fortynner det sneo sonden til 10 ng / mL alikvoter i nuklease fri H 2 O. Oppbevar alikvoter ved -20 ° C.
- PCR Merking (Alternativ metode for sonde merking)
- Kombiner sneo spesifikke primere (5'-ggatagcattgggagatatacct-3 'og 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3') med PCR-reagenser inn i et enkelt rør: 13,6 ul nuklease fri H 2 O; 0,1 mL dATP, dCTP, dGTP (10 nM); 0,05 mL dTTP (10 nM); 0,05 mL dUTP-biotin / dUTP-FITC / Cy3 (10 nM); 4 pl Gå Tag 5x buffer; 0,4 mL Gå Tag Polymerase; 1 pl sneo mal (10 ng). Se tabell for Materialer og reagenser for informasjon om PCR-reagenser.
- Justere mengden av hvert reagens ved å multiplisere med det totale antall prøver.
- Bruk følgende PCR sykling parameters for å forsterke og etikett sneo prober: 95 ° C i 2 min; 35 sykluser av 95 ° C i 30 sek, 62 ° C i 30 sek, 72 ° C i 60 sekunder; 72 ° C i 2 minutter; Hold ved 4 ° C på ubestemt tid.
MERK: glødetemperaturen kan justeres eller gradient PCR kan gjennomføres for å bestemme optimale annealing temperaturer for andre sonder. - Gjør 0,7-1% gel som i avsnitt 1.1.1, last og visualisere sonden bandet som i avsnitt 1.1.4.
- Klipp og rense den merkede sneo probe som i avsnitt 1.1.5.
- Re-run 5 mL av sneo merket probe med un-merket sneo probe for å bekrefte størrelsen økning og tap av signalintensitet (se figur 2).
- Kvantifisere mengden av merket probe sneo ved å måle absorbans ved 260 nm og fortynner sneo sonde til 10 ng / mL alikvoter i nuklease fri H 2 O.
2. Å Kromosom Spreads
- Generere stabile kloner uttrykker vektor ryggrad (control) eller retrotransposition vedkommende L1 ved anvendelse av standard seleksjonsmetoder. 12,16 Mens ikke-episomale reportere ble anvendt for å korrelere funn med studier av transkripsjon, kan episomale vektorer også anvendes. Grow-celler som stabilt uttrykker kontroll eller L1 vektor (1 x 10 6 celler per 10 cm plate, med justeringer i platestørrelse laget etter behov) i komplett vekstmedier. For HepG2 celler ved å bruke RPMI-1600, 10% FBS og 200 ug / ml hygromycin. Dyrke kulturer til 70% konfluens ved 37 ° C og 5% CO2.
MERK: valg av vekstmedium er avhengig av celletype. Gitt at plasmidene er brukt her bære seleksjons kassetter for både hygromycin og neomycin, kunne stabile seleksjon av kloner også gjøres med neomycin etter seleksjon på hygromycin, men mengden av neomycin må optimaliseres for å etablere toleransenivåer for hver celletype. - Legg colcemid (0,4 ug / ml) for å kulturmedium og inkuber i 90 minutter for å stanse celler ved metaphase. Ved anvendelse av forskjellige celletyper, bestemme den optimale konsentrasjonen av colcemid og eksponeringstiden (60, 90 og 120 min) for optimal metafase-hemning empirisk.
- Vask cellene 2x med 10 ml 1 x Dulbeccos PBS (DPBS), trypsineres ved tilsetning av 3-5 ml 0,25% trypsinoppløsning til cellene og inkuberes i 5 minutter for å løsne cellene. Inaktivere trypsin med en lik mengde av medium inneholdende 10% FBS.
- Sentrifuger cellene i 2 minutter ved 1000 xg ved 4 ° C, aspirere mediet fra cellepelleten og vaske cellene med DPBS. Sug alle DPBS, forlater 200 ul DPBS å re-suspendere cellene. Sikrer cellene blir blandet godt og at alle klumper er dispergert. Bruk flimring eller forsiktig pipettering å blande og spre klumper og unngå virvling.
- Tilsett 5 ml hypotonisk oppløsning (dvs. 75 mM KCl) som er forvarmet til 37 ° C dråpevis mens rotasjon av 15 ml rør horisontalt og inkuber ved 37 ° C i 20 min. Se tabell av materialer og Reagents for informasjon om hvordan du får tak i og gjøre hypoton løsning.
- Sentrifuger cellene ved 120 xg i 5 min ved 4 ° C og gjenta trinn 02.04 til 02.05 3x forlater ca 200 mL hypoton løsning for å re-suspendere cellene etter hver vask. Sikre at ved slutten av 3 vaskinger, er det pellet synlig hvit og hoven.
- Re-suspendere pellet i 200 ul Carnoy Fixative løsning og gjøre 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 fortynninger i Carnoy fiksativ løsning. Drop 10 mL av hver fortynning på en tørr ren lysbilde fra ca 1 cm over og umiddelbart avsløre spredning frie side til varm damp fra kokende vann i 30 sek. Se tabell for Materialer og reagenser for informasjon om hvordan du gjør Carnoy fiksativ løsning.
- Tørk de sprer ved romtemperatur flekken med 0,1 ug / ml Hoechst 33342-ved nedsenkning i 15-20 min i Coplin Jar og vaskes 3 ganger med DPBS. Se tabell for Materialer og reagenser for informasjon om hvordan du gjør det Hoechst-33342 løsning. <li> Vis sprer seg på fluorescens / fase-kontrast mikroskop på 40X forstørrelse. Etter å optimere spredning forberedelse, trenger sprer ikke farget med Hoechst-33342. Vis sprer seg på fasekontrastmikroskop ved 10X forstørrelse for å fastslå spredning kvalitet og separasjon som skissert under resultatene (se figur 3).
- Velg og sirkel gode marginene med Diamond Point markør på motsatt side av raset (dvs. spre fritt side).
- Oppbevares sprer ved -20 ° C i opptil en måned. Unngå eksponering for fukt.
3. Fluorescens In Situ Hybridisering (FISH)
- Stabilisere og dehydrerende sprer
MERK: Stabilisere meta kromosom sprer seg til romtemperatur hvis de oppbevares ved -20 ° C. Se tabell for Materialer og reagenser for informasjon om hvordan du kan få tak i og gjøre reagenser.- Inkuber meta kromosom sprer med 200 mL RNase A for1 time ved 37 ° C.
- Vask glir i 2 x SSC-buffer to ganger i 5 minutter hver, fulgt av skylling med 10 mM HCl-oppløsning.
- Inkuber sprer med 1% pepsin i 10 minutter ved 37 ° C, skylles med avionisert H2O og vask to ganger med 2 x SSC-buffer i 5 min hver.
- Inkuber sprer med 4% paraformaldehyd i 10 minutter og vask i 2 x SSC-buffer to ganger i 5 minutter hver.
- Dehydrere spres ved inkubasjon i 2 min i etanol serie: 70%, 80% og 95% etanol.
- Luft tørre lysbilder.
- Hybridisering Sprer med L1 -merket retrotransposition sonder (dvs. sneo)
FORSIKTIG: For direkte-merkede prober, holde seg borte fra lys til alle tider. Se tabell for Materialer og reagenser for informasjon om hvordan du kan få tak i og gjøre reagenser.- Tilsett 30 ng av sneo til hybridiseringsbuffer, oppvarm til 72 ° C i 10 minutter og avkjøles i 2 minutter ved romtemperatur.
- Legg 30 mL av sneo probe løsning for each spredning, dekk med dekkglass og forsegle kantene med gummi sement. Sikre at ingen bobledannelse.
- Oppvarm glide ved 72 ° C i 5 minutter på en varmeblokk, gradvis slippe temperaturen til 37 ° C, og inkuberes over natten i et mørkt fuktet kammer ved 37 ° C.
- Vasking og vise (eller Tilsetting av sekundært antistoff)
FORSIKTIG: For direkte-merkede prober, holde seg borte fra lys til alle tider.
MERK: Se tabell over Materialer og reagenser for informasjon om hvordan du kan tilberede. Det anbefales å bruke tilstrekkelig volum til å dekke hele kromosomet spredning. Husk at overskytende volumet vil gå tapt når dekkglass er lagt til.- Fordyp lysbilder i 2x SSC buffer for å fjerne dekk.
- Vask objektglass ved nedsenking i 2 x SSC-buffer ved 45 ° C i 5 minutter.
- Vask objektglass ved nedsenking i vaskebuffer ved 45 ° C i 5 minutter, 2 x.
- Vask objektglass ved neddykking i 0,1 X SSC-buffer ved 45 ° C i 10 min.
- Vask objektglass ved nedsenking i 2 x SSC-buffer ved 45 ° C i 10 min.
MERK: Plasser en Coplin Jar inneholder anbefalte buffer i et vannbad, justere temperaturen til 45 ° C. - Cool lysbilder til romtemperatur og stabilisere lysbilder i deteksjon buffer.
- For direkte merkede prober, hopp til trinn 3.4.10.
- For indirekte merkede prober, blokk i blokkeringsbuffer i 20-30 min og vaske 3x i DPBS.
- Inkuber med 50 ul av sekundært antistoff (for eksempel, 5 ug / ml streptavidin-FITC, eller αCY3 i blokkeringsbuffer) i 1 time.
- Vask slides i 2x SSC i 5 min to ganger.
- Counterstain med Hoechst 33342-løsning (0,1 pg / ml) i 10 minutter.
MERK: Dette farging er gjort for å flekke kromosomer for samlokalisering med sonde. - Vask i DPBS 3x, tilsett en dråpe montering medium, plasserer en dekkglass og forsegle kantene med neglelakk.
- Analyser L1 retrotransposition med fluorescens mikroskop på 40X magnification.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et skjematisk diagram av L1 retrotransposition vektoren blir presentert i figur 1. Vektoren inneholder et neomycin-genet i antisense-orientering for å L1 ORF'er som er avbrutt av et globin intron i sense-orientering og klemt til SD og SA områder. Når stabilt integrert inn i et kromosom er L1 mRNA transkribert fra det kombinerte CMV og L1-5'UTR promoteren (figur 1). Under RNA prosessering, blir globin intron spleiset ut av neomycin-genet. Den neo-L1 RNA blir pakket, translokaliseres og integrert i genomet som enten en full lengde eller avkortet innsetting. Som indikert, kan L1 retrotransposition spores av fisk ved anvendelse av prober som er spesifikke for skjøtes neomycin (figur 1).
Figur 2 viser en skjematisk fremstilling av neomycin sonde, med labeled probet som er større i størrelse og fluorescens mangelfull på grunn av forskjeller i eksitasjonsbølgelengdene. Merk at Cy3 og FITC opphisse ved ulike bølgelengder enn etidiumbromid beiset DNA.
Tettheten av metafase-kromosom sprer ble bestemt ved å fortynne den opprinnelige stamløsning til 1: 2, 1: 4, 1: 8 og 1:16 fortynninger og hvert oppslag evaluert med hensyn til tetthet, fordeling og avstand av oppslag fra kjernen ved 10X forstørrelse ( Figur 3A). Resultatene viser høy tetthet, klumpete og sprenge ut sprer (figur 3A-I-II), samt jevnt fordelt og godt adskilte sprer (figur 3A-III-IV). Lav tetthet sprer seg med jevn fordeling ble valgt for etterfølgende analyse.
Kromosom oppslag var farget med Hoechst fargestoff og spredning kvalitet vurderes ut lengden av kromosomer, rundhet av spreads og inter-kromosom avstand (figur 3B). Disse indeksene var påvirket av lengden av tiden ble cellene behandlet med colcemid, hypoton oppløsning, Carnoy Fixative løsning og / eller den måte på hvilken cellene ble ødelagt for å frigjøre kromosomer. Hvis cellene ble inkubert i en kort periode i hypoton oppløsning, ble kromosom sprer seg tett knyttede og de enkelte kromosomer var vanskelig å visualisere (figur 3B-i). På den annen side, lengre inkubasjon i hypoton oppløsning resulterte i brudd av kjernene, spredning av kromosomer, og / eller tap av kromosomer (figur 3B-ii). Lengre inkubasjoner i colcemid øket antall celler i metafasen, men føre til kondensering av kromosomer (figur 3B-iii). Som sådan krever en god kvalitet kromosom spredningen optimale inkubasjonsperioder i både colcemid og hypoton KCl-oppløsning. I våre hender, en 90 min inkubasjon i colcemid, 20 i hypotonisk oppløsning ved 37° C og bruk av en varm damp for å sprenge cellene ble funnet å være optimale betingelser for generering av kvalitets sprer høy (figur 3B-IV).
Kromosom sprer ble farget for L1 retrotransposition å bruke sonder som er rettet mot sneo. Proben ble merket med både FITC og Cy3 å vise at i begge tilfeller L1 retrotransposition er bare sett i celler som uttrykker villtype L1 (Figur 4). Ingen farging ble observert i celler som uttrykker vektoren ryggraden alene (figur 4; sammenligne topp- og bunnplater for hver fluorofor). I våre hender, ble sonde signal påvist i 80-90% av kjerner, med overveldende flertall av signal som representerer enkelt retrotransposition hendelser. Vi bare scoret retrotransposition i kjerner med mer enn én innsetting og spredning kvalitet var alltid undersøkes før FISH.
Figur 1. Skjematisk diagram av L1 retrotransposition vektor. Diagram viser prosessen med målet prime revers transkripsjon fører til full eller avkortet L1 innsettinger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Merket sneo og umerkede neomycin sonder. Merket probe viser mindre fluorescens og er større i størrelse i forhold til den umerkede probe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Fase-kontrast (Bright Field) og Hoechst flekk kromosom sprer seg. A) Viser fortynning av oppslag for å oppnå god avstand forberedelser. Scale bar er 50 mikrometer. B) Hoechst flekk kromosom viser påvirkning av colcemid, hypoton løsning, Carnoy Fixative løsning og sprengning på spredningen kvalitet. Scale bar er 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. FISH-analyse av L1 retrotransposition. Farging av sneo er fraværende i kontrollceller, men til stede i celler som uttrykker villtype-L1 vektor. Scale bar er 10 mikrometer.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoder som hele genomsekvensering, invers PCR og sørlige blotting har blitt ansatt for å studere L1 retrotransposition. Selv om disse metodene er svært verdifulle i å finne hvor L1 innsett skje innen genomer, en confounding utfordring for dem alle er behovet for in-silico programing å montere sekvenser. FISH metoden beskrevet her, er utformet for å komplettere disse metoder, særlig i tilfelle av studier som krever analyse av ektopisk L1 retrotransposition i dyrkede celler. Fremgangsmåten kan brukes for både kvantitativ og kvalitativ vurdering av retrotransposition hendelser og påføres interfase kjerner. Denne metodikken kan skryte nøyaktigheten av senere i-silico sekvens justerings metoder som benyttes for å bestemme ektopisk L1 innstikk 16. Innretting av repetitive sekvenser kan være tvetydig på grunn av dannelsen av homopolymerer, mens repeterende SekvensCES kan gå tapt under primer forsterkning av malen som resulterer i underrepresentasjon av repeterende sekvenser. FISH metodikk kan overvinne disse problemene fordi FISH prober kan binde til homo- og er usannsynlig å være forutinntatt mot intakte gjentatte sekvenser 16. I tillegg, sammenlignet med cellekultur-baserte retrotransposition analyser, kan FISH bestemme retrotransposition priser på enkelt kjernen nivå. Som sådan, hindrer denne tilnærmingen både under og over estimering av retrotransposition priser som flere innsett kan oppstå i enkeltkjerner 16. Nyere data fra NGS har bekreftet at cellekultur baserte metoder undervurderer retrotransposition frekvenser 25.
Det er fortsatt uklart hvor unge L1S foretrekker å sette inn, og om en målretting mekanisme finnes for å lede disse innskudd i genomet. Ved hjelp av den ovennevnte metode har vi vist at L1 setter fortrinnsvis inn i genet dårlig gjenområder har fra genomet 16. Andre har vist at overflod av L1-sekvenser er økningen i kromosomene med en mindre gen tetthet 17,18. Sammen utgjør disse funnene tyder på en regulert modus for innsetting hvor trusler mot cellen blir minimalisert ved innsetting av L1 til "mindre aktive" regioner av genomet. Mønsteret av transposable element bevegelse i lavere organismer har lånt støtte til denne tolkningen. For eksempel, spalting gjær retrotransposon, TF1, integrerer 95% av tiden oppstrøms for genet promotorer, og de fleste av disse genene er involvert i reguleringen spenning 19,20. I gjærceller som mangler tilgang til nitrogen, integrerer Ty5 inn i ORF stedet for heterochromatin regioner 21. Eksperimenter i mais har vist at integrering av DNA transposoner føre til spraglete mais farge fenotyper og integrering av Hatvine1-RRM DNA transposon inn i promoter-regionen i VvTFL1A-genet er blitt vist å influenCE forgrening mønster og frukten størrelsen på vinranker 22,23.
Trinnene kritiske til suksess for FISH metodikken beskrevet her er generering av gode kromosom sprer og riktig merking, rensing og hybridisering av sonder. Dersom prober ikke er renset på riktig måte, vil det resulterende høye bakgrunnssignal gjør det vanskelig å løse sonde binding til kromosomer. Fortrinnsvis bør probene være gelrenset for å fjerne gjenværende fluorescens fra dNTPs. Dessuten er det lenge sprer inkuberes i Carnoy Fixative løsning viktig å lage gode kromosom sprer seg. Hvis for lenge, kan cellemembranen briste for tidlig og føre til kromosom tap. Ved for kort, kan det være vanskelig å få tak i egnede sprer seg på grunn av manglende membran ruptur. Mengden / konsentrasjon av formamid bestemmer fokus for kromatider og derfor er det viktig å optimalisere empirisk for best resultat. Alle vasker bør være grundig til ensure at alle ubundne prober og sekundære antistoffer er vasket av.
Som konklusjon kan det FISH metoden beskrevet her brukes for å påvise både i full lengde og avkortede ektopiske L1 retrotransposition hendelser, og kan anvendes på andre retrotransposition vektorer ved hjelp av grønn fluorescens protein (GFP) som en indikator retrotransposition kassett. Selv om full lengde L1 insersjoner kan bestemmes ved hjelp av denne metoden, vil den ikke skjelne nye endogene avkortede innsettinger på grunn av antallet av avkortede L1 s i genomet. Tilgjengeligheten av sonde kan også være begrenset av økningen heterochromatin dannelse 16,24. Imidlertid kan inkludering av LNA innen fiske prober bli anvendt for å forbedre sonde gløding. Påvisning av sneo er betinget av en full syklus av retrotransposition og innsett mindre enn sonden / sletting kan være savnet.
For detaljerte beskrivelser av eksperimenter i hh bruken av disse vektorer og uttrykk for L1 proteiner og retrotransposition er preget, vennligst se publisert fungerer 12,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen potensielle konkurrerende interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labeling Probes | |||
| Go Tag DNA polymerase | Promega | M3178 | |
| GO Tag 10x colorless buffer | Promega | M3178 | |
| Individual dNTP | Sigma | DNTP10 | Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2 mM and dTTP to 1.5 mM in nuclease free water. |
| dUTP-16-Biotin (0.5 mM) | Roche | 11093070910 | |
| dUTP-FITC (0.5 mM) | Thermo Scientific | R0101 | |
| dUTP-CY3 (0.5 mM) | Sigma | GEPA53022 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3625 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3225 | |
| NucleoSpin PCR Clean-Up kit | Qiagen | 1410/0030 | Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit |
| PCR Machine | Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product. | ||
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Preparing chromosome Spreads | |||
| Colcemid | Life Technologies | 15212-012 | Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/ml |
| 1 M KCl | Sigma | P9541 | Dilute 1 M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution |
| Carnoy Fixative Solution | Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime. | ||
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Diamond Point Marker | Thermo Scientific | 750 | |
| Frosted Slides | Thermo Scientific | 2951-001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | R001100 | To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 min and inactive with equal volume of complete media. |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Heat Block | Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended. | ||
| Beaker (600 ml) | Sigma | CLS1003600 | Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes. |
| Nikon Microscope | Nikon | 125690 | Any microscope can be used to look at spread quality. |
| Reagents and Materials for FISH | |||
| Trisodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Sodium Chroride | Sigma | S3014 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Tween-20 | Sigma | F1379 | |
| Detran Sulfate | Sigma | D8906 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Salmon Sperm DNA | Life Technologies | 15632-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A8531 | |
| HCl (N) | Sigma | 38283 | |
| Ethyl Alcohol | Sigma | 459844 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Rnase A | Sigma | R4642 | |
| Pepsin | Sigma | P6887 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Rubber Cement/Cytobond Sealant | 2020-00-1 | ||
| Seven Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Dark Humidified chamber | Sigma | CLS2551 | |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Dry Digital Heat Block | VWR | 13259 | |
| Fluorescence Microscope | |||
| 20x Saline-Sodium Citrate (20x SSC) | Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 ml of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C. | ||
| 1 mg/ml of Rnase A | Dilute 20x SSC buffer to 2x SSC buffer. Dissolve RNase A in 2x SSC buffer to a final concentration of 1 mg/ml. Make fresh solution every time. | ||
| 1% Pepsin | Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1% solution. Make fresh every time. | ||
| 4% Paraformaldehyde (4% PFA) | Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 ml of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 ml, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 ml aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde. | ||
| Wash Buffer | Combine 100 ml of Formamide (20%) with 2.5 ml of 20x SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 ml with molecular grade H2O. | ||
| Hybridization Buffer | Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/ml Salmon Sperm DNA in 2x SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are; titrate the amount. | ||
| Detection Buffer | Dilute 20x SSC buffer to 4x and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer. | ||
| Blocking Buffer | Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4x SSC buffer. | ||
| Dehydrating Solution | Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions. | ||
References
- Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. Reverse transcriptase encoded by a human transposable element. Science. 254, 1808-1810 (1991).
- Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition. Cell. 87, 905-916 (1996).
- Clements, A. P., Singer, M. F. The human LINE-1 reverse transcriptase:effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain. Nucl Acids Res. 26, 3528-3535 (1998).
- Martin, S. L., Branciforte, D., Keller, D., Bain, D. L. Trimeric structure for an essential protein in L1 retrotransposition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13815-13820 (2003).
- Khazina, E., et al. Trimeric structure and flexibility of the L1ORF1 protein in human L1 retrotransposition. Nat Struct Mol Biol. 18, 1006-1014 (2011).
- Martin, S. L., Li, J., Weisz, J. A. Deletion analysis defines distinct functional domains for protein-protein and nucleic acid interactions in the ORF1 protein of mouse LINE-1. J Mol Biol. 304, 11-20 (2000).
- Martin, S. L. Ribonucleoprotein particles with LINE-1 RNA in mouse embryonal carcinoma cells. Mol Cell Biol. 11 (9), 4804-4807 (1991).
- Hohjoh, H., Singer, M. F. Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA. EMBO J. 15, 630-639 (1996).
- Cost, G. J., Feng, Q., Jacquier, A., Boeke, J. D. Human L1 element target-primed reverse transcription in vitro. EMBO J. 21, 5899-5910 (2002).
- Szak, S. T., et al. Molecular archeology of L1 insertions in the human genome. Genome Biol. 3, (2002).
- Sen, S. K., Huang, C. T., Han, K., Batzer, M. A. Endonuclease-independent insertion provides an alternative pathway for L1 retrotransposition in the human genome. Nucl Acids Res. 35, 3741-3751 (2007).
- Bojang, P. Jr, Roberts, R. A., Anderton, M. J., Ramos, K. S. Reprogramming of the HepG2 genome by long interspersed nuclear element-1. Mol Oncol. 7, 812-825 (2013).
- Boeke, J. D., Garfinkel, D. J., Styles, C. A., Fink, G. R. Ty elements transpose through an RNA intermediate. Cell. 40, 491-500 (1985).
- Heidmann, T., Heidmann, O., Nicolas, J. F. An indicator gene to demonstrate intracellular transposition of defective retroviruses. PNAS. 85, 2219-2223 (1988).
- Moran, J. V., et al. High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells. Cell. 87, 917-927 (1996).
- Bojang, P. Jr, Anderton, M. J., Roberts, R. A., Ramos, K. S. De novo LINE-1 retrotransposition in HepG2 cells preferentially targets gene poor regions of chromosome 13. Genomics. 104, 96-104 (2014).
- Rozen, S., et al. Abundant gene conversion between arms of palindromes in human and ape Y chromosomes. Nature. 423, 873-876 (2003).
- Graves, J. A., Koina, E., Sankovic, N. How the gene content of human sex chromosomes evolved. Curr Op Gen Develop. 16, 219-224 (2006).
- Leem, Y. E., et al. Retrotransposon Tf1 is targeted to Pol II promoters by transcription activators. Mol Cell. 30, 98-107 (2008).
- Guo, Y., Levin, H. L. High-throughput sequencing of retrotransposon integration provides a saturated profile of target activity in Schizosaccharomyces pombe. Genome Res. 20, 239-248 (2010).
- Dai, J., Xie, W., Brady, T. L., Gao, J., Voytas, D. F. Phosphorylation regulates integration of the yeast Ty5 retrotransposon into heterochromatin. Mol Cell. 27, 289-299 (2007).
- McClintock, C. B. The origin and behavior of mutable loci in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 344-355 (1950).
- Fernandez, L., Torregrosa, L., Segura, V., Bouquet, A., Martinez-Zapater, J. M. Transposon-induced gene activation as a mechanism generating cluster shape somatic variation in grapevine. Plant J Cell Mol Biol. 61, 545-557 (2010).
- Garcia-Perez, J. L., et al. Epigenetic silencing of engineered L1 retrotransposition events in human embryonic carcinoma cells. Nature. 466 (7307), 769-773 (2010).
- Rodic, N., et al. Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductual adenocarcinoma. Nat Med. 21 (9), (2015).
