Abstract
القدرة على الحفاظ على وظيفة خلايا الكبد في المختبر، لغرض اختبار السمية الخلوية الاكسيوبيوتك "، ودراسة عدوى الفيروس وتطوير عقاقير تستهدف الكبد، يتطلب منصة في الخلايا التي تستقبل الإشارات البيوكيميائية والميكانيكية المناسبة. وقد استخدمت النظم الهندسية أنسجة الكبد الأخيرة ثلاثية الأبعاد (3D) السقالات تتألف من الهلاميات المائية الاصطناعية أو الطبيعية، بالنظر إلى احتباس الماء العالية وقدرتها على توفير المحفزات الميكانيكية التي تحتاجها الخلايا. وكان هناك اهتمام متزايد في السقالة مقلوب الكريستال الغروية (ICC)، والتطورات الأخيرة، والذي يسمح منظمة عالية المكانية، مثلي النمط والتفاعل خلية مغاير، وكذلك المصفوفة (ECM) التفاعل بين الخلايا خارج الخلية. هنا، نحن تصف بروتوكول لافتعال سقالة للمحكمة الجنائية الدولية باستخدام بولي (جلايكول الإثيلين) diacrylate (PEGDA) وطريقة الجسيمات الرشح. لفترة وجيزة، يتم إجراء شعرية من الجسيمات microsphere، وبعد ذلك وقبل البوليمريضاف حل ص، بلمرة بشكل صحيح، ثم تتم إزالة الجزيئات، أو تتسرب، وذلك باستخدام المذيبات العضوية (على سبيل المثال، رباعي هيدرو الفوران). حل النتائج شعرية في السقالة المسامية العالية مع أحجام المسام للرقابة وinterconnectivities أن السماح لوسائل الإعلام للوصول إلى خلايا أكثر سهولة. هذا الهيكل الفريد يسمح مساحة عالية للخلايا التمسك فضلا عن سهولة الاتصال بين المسام، والقدرة على معطف المحكمة الجنائية الدولية سقالة PEGDA مع البروتينات ويظهر أيضا تأثير ملحوظ على أداء الخلية. نحن نحلل مورفولوجية السقالة وكذلك الخلايا سرطانة الكبد السلوك (هاه 7.5) من حيث الجدوى وتعمل لاستكشاف تأثير هيكل المحكمة الجنائية الدولية والطلاء ECM. وعموما، فإن هذه الورقة بروتوكول تفصيلي لسقالة الناشئة التي لها تطبيقات واسعة في هندسة الأنسجة، وخاصة الهندسة أنسجة الكبد.
Introduction
الكبد هو الجهاز أوعية دموية للغاية مع العديد من المهام، بما في ذلك إزالة السموم من الدم، والتمثيل الغذائي للالاكسيوبيوتك، وإنتاج البروتينات في الدم. أنسجة الكبد لديها معقدة ثلاثية الأبعاد (3D) المجهرية، التي تتألف من أنواع متعددة الخلايا، نفيق الصفراء، والجيوب، ومناطق مختلفة التكوين بايوماتريكس وتركيزات الأكسجين مختلفة. ونظرا لهذا الهيكل تفصيلا، فقد كان من الصعب لخلق نموذج الكبد السليم في المختبر 1. ومع ذلك، هناك الطلب المتزايد على وظيفية نماذج في المختبر استضافة خلايا الكبد البشرية كمنصات لسمية اختبار المخدرات 2 ودراسة الأمراض المرتبطة الكبد 3.
وتبسيط مناهج هندسة الأنسجة الكبد الحالية تعقيد الكبد عن طريق عزل واحدة، أو التركيز على عدد قليل من المعلمات الكبد، وهي ثقافة مشتركة من الخلايا 4، تكوين كيميائي حيوي من زوناmicroenvironments ل 5، ديناميكية تدفق 6،7 وتكوين بايوماتريكس 8. تكوين بايوماتريكس يمكن تقسيم إلى معلمات مثل المواد سقالة، تكوين المصفوفة خارج الخلية البروتينات (ECM)، وتصلب مصفوفة وكذلك تصميم وهيكل السقالة. كان هناك ارتفاع في دراسات هندسة الأنسجة باستخدام الهلاميات المائية الاصطناعية، خاصة بولي (جلايكول الإثيلين) (PEG) الهلاميات المائية 9، نظرا لقدرتها على ضبط الخصائص الميكانيكية، والنشاط الحيوي، ومعدل التدهور هيدروجيل ل. وفيما يتعلق البحوث المتعلقة الكبد، تم تطبيق هيدروجيل حيويا للدراسة عدوى فيروس مرض الكبد 3. ونتيجة لتصميم منصة الكبدية، وقد استخدمت العديد من الدراسات الكبدية الثقافات شطيرة 10،11 والتغليف خلية داخل هيدروجيل 12،13 لتوفير بيئة 3D وخلية ECM والتفاعل خلية خلية التي تعتبر ضرورية لتقليد في المكروية الجسم الحي. هاوالاصدار، هذه المنابر لا تمتلك درجة عالية من التحكم والتنظيم المكاني، مما يؤدي إلى خصائص غير موحدة من خلال منصة الاعدام 14.
والغروية وضوح الشمس مقلوب (ICC) 14 سقالة هي سقالة 3D درجة عالية من التنظيم للثقافة الخلية التي تم تقديمها لأول مرة في 2000s في وقت مبكر. ويمكن أن يعزى بنية فريدة من نوعها السقالة لعملية التصنيع بسيطة باستخدام الكريستال الغروية، وهي شعرية أمر من الجسيمات الغروية من قطر متغير. لفترة وجيزة، لتلخيص العملية، جزيئات مرتبة بدقة ومطوع باستخدام الحرارة لتشكيل شعرية. رشح هذا شعرية، عن طريق المذيبات العضوية، في النتائج هيدروجيل بلمرة في تجاويف كروية معبأة سداسي 15 مع مساحة سطح عالية. تم عرض هذه السقالة أمر غاية التي سبق مع المواد الاصطناعية والطبيعية على حد سواء، بما في ذلك سبيل المثال لا الحصر بولي (الأكريلاميد) 16-21، وبولي (اللبنيك المشترك، حمض الجليكوليك) 15،22-30، وبولي (جلايكول الإثيلين) 31،32، بولي (ميتاكريليت 2-هيدروكسي) 21،33-35، والشيتوزان 36-39. السقالات للمحكمة الجنائية الدولية مصنوعة من مواد غير قاذورات تميل إلى تعزيز الكروية الخلوية داخل تجاويف 14،23،40. وقد ثبت أن أنواع الخلايا متعددة لتتكاثر بنجاح، تمييز وظيفة ضمن هذا التكوين، بما في ذلك غضروفية 41، خلايا انسجة نخاع العظم 42، والخلايا الجذعية 43،44. وفيما يتعلق الكبدية، وقد أجريت دراسات مع السقالات للمحكمة الجنائية الدولية مصنوعة من نا 2 شافي 3 و بولي (الأكريلاميد)، ولكن ليس PEG. مع استراتيجيات bioconjugation بسيطة (أي أمين اقتران من خلال EDC / NHS)، ويمكن أن تكون ملفقة السقالات ECM البروتينات مترافق أساس PEG، التي يمكن أن تثبت مواقع الربط المزيد من الخلية لتكون أكثر في الجسم الحي مثل البيئة وتعزيز وظيفة الكبد.
في هذه المخطوطة والفيديو المرتبطة بها، ونحن بالتفصيل تصنيع السقالة للمحكمة الجنائية الدوليةباستخدام بولي (جلايكول الإثيلين) diacrylate (PEGDA) هيدروجيل وشعرية البوليسترين microsphere الأمثل لسرطانة الكبد (هاه 7.5) الثقافة. ونحن لشرح الفروق بين nonadhesive عموما العارية السقالات للمحكمة الجنائية الدولية PEGDA والمغلفة الكولاجين PEGDA للمحكمة الجنائية الدولية سقالة من حيث طوبولوجيا سقالة وأداء الخلية. يتم قياس بقاء الخلية وظيفة نوعيا وكميا لتقييم سلوك الخلية هوه 7.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. للمحكمة الجنائية الدولية سقالة التصنيع (الشكل 1)
- إعداد البوليسترين (PS) السياج (القطر = 6 مم؛ 8-13 طبقات من الخرز).
- لإعداد العفن، وقطع نصائح من من 0.2 مل أنابيب microcentrifuge واقية من الغليان على مستوى 40 ميكرولتر. تلتزم الجزء العلوي من قطع الأنابيب إلى 24 × 60 مم 2 المجهر زلات غطاء زجاجي مع الغراء واقية من الماء.
- وضع المجالات PS (قطر = 140 ميكرون) الواردة في تعليق المياه إلى 20 مل قارورة، بعناية ماصة من تعليق المياه، وإضافة 18 مل من 70٪ من محلول الإيثانول في قنينة. وضع حل المجال في حمام بالموجات فوق الصوتية لتخفيف المجالات مجمعة. كرر هذه الخطوة غسل عدة مرات من أجل إزالة مكونات الماء وقابل للذوبان في الماء تماما.
- ماصة 100 ميكرولتر من الايثانول في قوالب.
- قطع الجزء العلوي من 200 ميكرولتر micropipette غيض من 4 مم. ماصة 25 ميكرولتر من المجالات في القالب مرتين باستخدام micropipette ميكرولتر 200 إلى تحقيقالحجم الكلي لل50 ميكرولتر في كل قالب.
- وضع قوالب على شاكر هزاز عند 120 دورة في الدقيقة ليلة وضحاها.
- تحقق من ترتيب المجالات في كل قالب تحت المجهر الضوئي. إذا لم يتم ترتيب المجالات سداسي، إضافة 50 ميكرولتر من 70٪ من الإيثانول ويهز يدويا في اتجاه المحور الطولي والجانبي لتصحيح هذا الترتيب.
- السماح لليتبخر الإيثانول في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة ليلتين. وضع القالب ومجمع حبة في C فرن 130 درجة لمدة 6 ساعات ليصلب حبات PS.
- إعداد السقالات PEGDA العارية والمغلفة ECM.
- توليف macromers PEGDA باستخدام البروتوكولات المعمول 45،46 لacrylating macromers PEG الخطية (M ث = 4.6 كيلو دالتون).
- تجهيز 50٪ (ث / ت) حل PEGDA في (DI) المياه المتأينة دي والسماح للmacromer بحل بشكل صحيح عن طريق الطرد المركزي في 4713 x ج حتى يذوب تماما.
- لECM مترافق السقالات للمحكمة الجنائية الدولية، ويحل إضافي10٪ (ث / ت) Acryloyl-PEG-NHS (M ث = 3.4 كيلو دالتون) في حل PEGDA 50٪.
- إعداد 20٪ (ث / ت) حل سهم 2-هيدروكسي-4 "- (2-hydroxyethoxy) -2-methylpropiophenone (PI) في 70٪ من الإيثانول.
- إضافة 50 ميكرولتر من 20٪ (ث / ت) حل سهم PI لكل 1 مل من 50٪ (ث / ت) من PEGDA. ضبط المبلغ اللازم من PI حل الأسهم على أساس الوزن الجزيئي للPEGDA.
- دوامة الخليط في أنبوب الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة للوصول إلى حل متجانس.
- قشر قوالب من الشريحة الزجاجية (من الخطوة 1.1.7)، وإزالة الغراء من القوالب، ودفع الشبكات بعناية باستخدام ملعقة ووضع كل منها في أنبوب 1.5 مل. ماصة 300 ميكرولتر من الحل PEGDA وأجهزة الطرد المركزي في 845 x ج لمدة 5 دقائق للسماح PEGDA السليم حل تسلل في الشبكة.
- إزالة شعرية من الأنبوب باستخدام الملقط وصمة عار بعناية الجافة حل PEGDA الزائد على قفازات. ضع شعرية على الزجاج المغطى فيلم البارافين مع سي آي آر شقةدائرية سطح مواجهة.
- فضح حل PEGDA تسلل سقالة إلى 365 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية (UV) ضوء (10.84 ميغاواط / سم 2) لمدة 5 دقائق باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية بقعة.
- وضع المشابك الكريستال PEGDA-بلمرة في قوارير جديدة (حوالي 10 الشبكات في القارورة) وإضافة 20 مل من رباعي هيدرو الفوران (THF). هز قارورة على شاكر المداري في 300 دورة في الدقيقة. تغيير THF على الأقل 3 مرات مع فاصل من 1-2 ساعة.
ملاحظة: لا تقم بإزالة THF تماما عند تغيير THF من أجل منع الفقاعات من دخول السقالات، وهذا بدوره يمكن أن يسبب إزالة كاملة من PS. ترك حل ما يكفي لتغطية الأسوار وإضافة THF الجديد.
تحذير: THF سامة. ارتداء القفازات، معطف المختبر ونظارات واقية. تجنب استنشاق كتبها تعمل تحت غطاء الدخان. - تحقق إذا تم حل المجالات PS عن طريق وضع الماء في حل THF المستخدمة ومراقبة لون الحل. كرر الخطوة 1.2.9 إذا لم يتم حل المجالات PS بشكل صحيح.
ملاحظة: اللون الحل سوف تتغير إلىأبيض إذا كان هناك أي مجالات PS المتبقية.
- تنظيف السقالات في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (BSC).
- لتعقيم السقالات، وإعداد أنبوب 50 مل الطرد المركزي مع 2 مل من الايثانول 70٪ في السقالة ووضع السقالات في الأنبوب باستخدام ملعقة. السماح السقالات لنقع في الإيثانول لمدة 1 ساعة. من هذه الخطوة إلى الأمام، وإجراء كافة الإجراءات في ش.
- بعناية صب الإيثانول من واستبدالها مع المياه المالحة العازلة الفوسفات (PBS) (2 مل لكل سقالة) وأجهزة الطرد المركزي في 524 x ج لمدة 3 دقائق لإزالة الفقاعات. يبقيه في الثلاجة وتغيير برنامج تلفزيوني عدة مرات مع فاصل من 1-2 ساعة.
- لنوع الكولاجين السقالات أنا المغلفة، وإعداد أنبوب آخر 50 مل الطرد المركزي التي تحتوي على الكولاجين من النوع 1 حل سهم (1 مل لكل سقالة)، ونقل السقالات تعقيمها لهذا الأنبوب باستخدام ملعقة، وأجهزة الطرد المركزي في 524 x ج لمدة 3 دقائق. يهز السقالات في 400 دورة في الدقيقة على شاكر المداري لمدة 30 دقيقة والحفاظ على أنبوب في الثلاجاتأو بين عشية وضحاها.
- غسل السقالات مع برنامج تلفزيوني مرتين قبل استخدامها من قبل غمر السقالات في برنامج تلفزيوني جديد ثم الشفط برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: يمكن أيضا البروتينات ECM أخرى أن تستخدم بدلا من الكولاجين النوع الأول لأن الكيمياء NHS يتطلب مجموعة أمين لتشكيل السندات (الشكل 2).
الشكل 1. نظرة عامة على تلفيق للمحكمة الجنائية الدولية. ملفقة السقالات المحكمة الجنائية الدولية في الربط بين استخدام تقنيات التصنيع الدقيق مع وبدون ECM-functionalization. السقالات ICC-المغلفة ECM تتطلب الربط بين NHS وكذلك PEGDA (كما هو مبين في الشكل 2). شعرية PS التي يبلغ قطرها 6 ملم وارتفاعها 8-13 طبقات حبة. PS، البوليستيرين. PEGDA، بولي (جلايكول الإثيلين) diacrylate. الأشعة فوق البنفسجية، الأشعة فوق البنفسجية. THF، رباعي هيدرو الفوران. ECM، المصفوفة خارج الخلية. تم تعديل هذا الرقم و تستعمل بإذن من وايLEY 47. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. للمحكمة الجنائية الدولية هيكل توصيف
- لتحليل هيكل للمحكمة الجنائية الدولية مع أو بدون البروتينات مترافق، استخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) 47.
- إصلاح السقالات مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA)، يذوى بالتسلسل لهم في 25 و 50 و 75 و 95 و 100 حلول٪ من الإيثانول، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى يتبخر الإيثانول تماما.
- العينات الجافة في أكثر جفافا تجميد لمدة 48 ساعة.
- يلصق العينة على صاحب العينة باستخدام شريط الكربون ومكان في المغطي تفل.
- بعد كنس التلقائي، ومعطف مع فيلم حزب العمال من سماكة 10 نانومتر الاخرق لمدة 60 ثانية في 20 مللي أمبير.
- السقالات صورة للمحكمة الجنائية الدولية باستخدام ووزارة شؤون المرأة في الجهد من 5 كيلو فولت (الشكل 3A، 4A الشكل).
- لقياس المسام وقطر الربط من تسوس الأسنان، وتحليل الميكروسكوب SEM باستخدام صورة برامج التحليل 48 (على سبيل المثال، يماغيج، الشكل 3B، C).
- لتصور الكولاجين مترافق إلى منصة الاعدام دون الخلايا، العلامة fluorescently الكولاجين باستخدام الأجسام المضادة (1: 100) ضد نوع الكولاجين أنا وصورة مع ليزر متحد البؤر المسح المجهري 47 (CLSM، الشكل 4B).
3. هوه 7.5 زراعة الخلايا والبذر
- ثقافة هوه 7.5 الخلايا في مناطق ذات كثافة البذر من 2-2،5 × 10 6 خلية / مل في أطباق زراعة الخلايا 100 ملم مع 10 مل Dulbecco لتعديل النسر المتوسط (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 100 U / مل البنسلين ستربتومايسين (وسائط النمو) عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. تغيير وسائل الاعلام كل ثلاثة أيام في BSC حتى وصلت إلى 75-80٪ confluency.
- إعداد السقالات بذر خلية في ش.
- وضع بعناية سكافالذين تتراوح أعمارهم بين في 24 لوحة جيدا مع سطح مستو مواجهة.
- لغسل سقالة، ماصة 2 مل برنامج تلفزيوني لاحتواء كل بئر سقالة. نضح في برنامج تلفزيوني وماصة 2 مل برنامج تلفزيوني جديد في كل بئر.
- نضح في برنامج تلفزيوني وماصة 2 مل من وسائط النمو (راجع الخطوة 3.1) وتترك لمدة 30 دقيقة. نضح في وسائل الاعلام والسماح للسقالة لتجف لمدة 1 ساعة.
- فصل متموجة هوه 7.5 الخلايا (من الخطوة 3.1) من لوحة الثقافة في BSC باستخدام طريقة الهضم التربسين.
- وسائل الإعلام نضح من لوحة، وإضافة 4 مل في برنامج تلفزيوني لغسل الخلايا الملتصقة ثم نضح برنامج تلفزيوني.
- ماصة ،75-1 مل 0.25٪ التربسين وضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 3 دقائق.
- إزالة لوحة من الحاضنة وماصة 5 مل وسائل الاعلام لوقف رد الفعل التربسين. وسائل الإعلام ماصة، خلايا منفصلة، وخليط التربسين في أنبوب 15 مل.
- أجهزة الطرد المركزي في 524 x ج لمدة 3 دقائق، وإزالة طاف و resuspend بيليه في 5 مل وسائل الاعلام.
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وحساب حجم تعليق الخلية التي تحتوي على الخلايا في العدد المستهدف، N 0، في 25 ميكرولتر (لتجربة القياسية، N 0 هو 1 × 10 6 خلايا).
حجم تعليق خلية = (العدد المستهدف من الخلايا) / (تركيز تعليق خلية) - ماصة ببطء 25 ميكرولتر من تعليق الخلية (التي تحتوي على N 0 الخلايا) مباشرة فوق بعضها سقالة (من الخطوة 3.1.4). وضع 24 لوحة جيدا في الحاضنة.
- بعد 12 ساعة، ونقل السقالات بعناية مع استخدام ملعقة إلى 24 لوحة جيدا جديدة وماصة 2 مل من وسائل الاعلام في كل بئر. وضع 24 لوحة جيدا في الحاضنة.
- تغيير وسائل الاعلام كل 3 أيام أو اعتمادا على عندما يتم جمعها وسائل الإعلام لتحليل إفراز بروتين (انظر الخطوة 5.1).
الجدوى 4. خلية
- لتحليل نوعي بقاء الخلية، استخدم يعيش الفلورسنت / مجموعات تلطيخ ميتة وصمة عار على الخلايا والصورة باستخدام Cمغلق.
- بعد تعليمات عدة، يعد حل مع 4 ميكرومتر AM calcein و 8 ميكرومتر إيثيديوم وطي ديمر-1 في وسائل الإعلام (راجع الخطوة 3.1.3).
ملاحظة: تحسين اعتمادا على عدد الخلايا. استخدام ضعف المبلغ من كاشف إذا تتكاثر الخلايا وضعف في عدد (حوالي 2 مليون دولار). - في BSC، ووسائل الإعلام نضح في كل بئر مع سقالة (الخطوة 3.7) وماصة 500 ميكرولتر من محلول استعداد. احتضان العينات في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- تغطية لوحات في احباط لحماية العينات من الضوء عند إزالة لوحة من الحاضنة. عينات الصور باستخدام CLSM49.
- بعد تعليمات عدة، يعد حل مع 4 ميكرومتر AM calcein و 8 ميكرومتر إيثيديوم وطي ديمر-1 في وسائل الإعلام (راجع الخطوة 3.1.3).
- لتقييم كمي بقاء الخلية، وقياس النشاط الأنزيمي (في الخلايا الحية) باستخدام فحوصات اللونية 50 (أي 2- (2-ميثوكسي-4-nitrophenyl) -3- (4 nitrophenyl) -5- (2،4-disulfophenyl) -2H-نتروبلو (الصوديوم الملح الكاشف)).
- إنشاء منحنى القياسية لمنصة للمحكمة الجنائية الدولية (أي رسم بياني لإمتصاص OD) ضد (ersus نظرا عدد الخلايا).
ملاحظة: البذر الخلية ليست 100٪ كفاءة بالمقارنة مع غيرها من المنصات، منذ خلايا يمكن أن تمر من خلال تجاويف السقالات.- تحديد أعداد الخلايا البذر، N 0 التي سيتم استخدامها لجعل منحنى القياسية.
ملاحظة: اختر النطاق الذي يتضمن الأرقام الخلية التي تقدر في التجربة. على سبيل المثال، إذا كان عدد الخلايا الأولي هو 5 × 10 5 خلايا، وهناك ما يقدر ب ~ 3 أضعاف في اليوم الأخير من التجربة، واختيار 2.5 × 10 5، 5 × 10 5، 1 × 10 6، و2 × 10 6 الخلايا كما N 0. - أداء البذر الخلايا في السقالات للمحكمة الجنائية الدولية (واحد N 0 في سقالة مع حجم البذر من 25 ميكرولتر) كما هو موضح في الخطوات 3،1-3،6.
- بعد 6 ساعات، ونقل السقالات لوحة 24-جيدا أخرى أيضا. حدد الوقت الذي يسمح الالتزام الخلية ولكن ليس الخلية انتشار الأسلحة النووية.
- أداء عد الخلايا على سقالة للمحكمة الجنائية الدولية نقلها.
- تمييع 10X أحادية الصوديوم الملح كاشف (MSR) حل ل1x أخرى مع وسائل الإعلام في BSC وماصة 500 ميكرولتر حل 1X MSR في كل بئر مع سقالة. احتضان لوحة 24-جيدا عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- من كل بئر، ونقل 100 ميكرولتر إلى لوحة 96-جيدا جيدا. كما فارغة، ماصة 100 ميكرولتر من جديد 1X أحادية الصوديوم الملح حل كاشف في آبار مختلفة على لوحة 96-جيدا. يدويا إزالة أي فقاعات الحالية باستخدام ماصة الجافة وتغطية لوحة 96-جيدا في احباط لحمايته من الضوء.
- OD التدبير في λ = 450 نانومتر القراءة باستخدام معمل. طرح OD فارغة من القيم الأخرى للعثور على OD دقيقة 51.
- حساب عدد الخلايا (N L) المتبقية في البئر بعد نقل سقالة (الخطوة 4.2.1.3) باستخدام عدادة الكريات.
ملاحظة: استخدم 300 ميكرولتر من التربسين يعرض للتريبسين الخلايا. - حساب عدد الخلايا الفعلي، N A.
= الفعليةالأولي - غادر بشكل جيد
N A = N 0 -N L - جعل منحنى القياسية بالتآمر OD تم الحصول عليها في الخطوة 4.2.1.4.3 مقابل عدد الخلايا الفعلي (N أ) واستخدام هذه لتقدير عدد الخلايا في التجارب.
ملاحظة: تأكد منحنى قياسي جديد إن وجدت المعلمات للمحكمة الجنائية الدولية (أي حجم porogen، أبعاد السقالة، البروتين ECM، الخ) يتم تغيير.
- تحديد أعداد الخلايا البذر، N 0 التي سيتم استخدامها لجعل منحنى القياسية.
- إنشاء منحنى القياسية لمنصة للمحكمة الجنائية الدولية (أي رسم بياني لإمتصاص OD) ضد (ersus نظرا عدد الخلايا).
وظيفة 5. خلية
- تحليل إفراز البروتين من الخلايا هوه 7.5 (أي الزلال واليوريا) من وسائل الإعلام التي تم جمعها (من الخطوة 3.7) بواسطة انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) 52.
ملاحظة: تمييع وسائل الإعلام، وهذا يتوقف على عدد الخلايا المصنفة وكمية من وسائل الإعلام التي تم جمعها. لمدة 5 × 10 5 خلايا المصنفة في المحكمة، واستخدام ~ نسبة 1: 25، قبل أن تنقله إلى الآبار الضد المكسوة مسبقا والمحمولة. - لتحليل نوعي وظيفة الخلية، immunostain البروتينات داخل الخلايا المحددة(أي الزلال)، والأنزيمات (أي CYP450)، والمكونات وصمة عار الهيكلية (أي الأكتين الخلوية) وكذلك النوى والصورة باستخدام CLSM 49.
- وسائل الاعلام نضح (من الخطوة 3.7) وماصة 2 مل برنامج تلفزيوني لغسل السقالات ICC-خلية لادن.
- ماصة 1 مل من 4٪ PFA واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتثبيت.
- غسل 3X مع 2 مل برنامج تلفزيوني.
- Permeabilize الأغشية التي يحتضنها السقالات في 1 مل من 0.1٪ 4- (1،1،3،3-tetramethylbutyl) فينيل البولي ايثيلين جلايكول (السطحي) لمدة 30 دقيقة.
- غسل 3X مع 2 مل PBS لإزالة أي البروتينات تسرب.
- ماصة 500 ميكرولتر 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، واحتضان في RT لمدة 1 ساعة لمنع غير محددة وملزمة.
- إعداد الأجسام المضادة الأولية المخفف (أي الزلال، CYP450) حل.
- ماصة 500 ميكرولتر من محلول 1٪ BSA في أنبوب 15 مل وإضافة 4.5 مل من 0.1٪ السطحي حل لإعداد 5 مل من 0.1٪ BSA حلا شاملا.
- ماصة 98 ميكرولتر من حل جيش صرب البوسنة 0.1٪ إلى أنبوب microcentrifuge 200 ميكرولتر و 2 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية لإنتاج 01:50 (الأجسام المضادة الأولية: 0.1٪ BSA) حل الأجسام المضادة الأولية.
- ماصة 40 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية على منصة الاعدام وتغطية الركيزة مع فيلم البارافين. التفاف 24 لوحة جيدا بورق الألمنيوم وتخزين طبق في 4 درجات مئوية خلال الليل.
- غسل 3X مع 2 مل برنامج تلفزيوني ويهز لوحة بلطف بين الغسيل.
- إعداد المخفف الضد الثانوية المعقدة البيروكسيديز (أي مكافحة فأر الضد) حل سهم.
- ماصة 198 ميكرولتر 0.1٪ محلول BSA و 2 ميكرولتر الضد الثاني لإنتاج 1: 100 (الضد الثانوية: 0.1٪ BSA) حل الضد الثانوية.
- إعداد 0.1٪ محلول المخزون من رودامين أو فلوريسئين المسمى phalloidin (وصمة عار على خيوط الأكتين الخلوية) في حل جيش صرب البوسنة 0.1٪.
- ماصة 25 ميكرولتر من كل حل في أنبوب وتخلط ثالذراع.
- ماصة 50 ميكرولتر من محلول المخزون الضد الثانوية على منصة الاعدام. تغطية سقالة مع فيلم البارافين، والتفاف الطبق بورق الألمنيوم وتخزينها في RT لمدة 2 ساعة.
- غسل 3X مع 2 مل برنامج تلفزيوني.
- ماصة 200 ميكرولتر من 0.2٪ 4'-6-diamidino-2-phenylindole (دابي، وصمة عار النواة) الحل على منصة الاعدام والحفاظ على RT لمدة 2-3 دقيقة. تغطية لوحة بورق الألمنيوم.
- غسل 2X مع 2 مل برنامج تلفزيوني.
- استخدام قطارة، وضع قطرة من وسائل الاعلام المتزايدة على الركيزة.
- وضع بعناية سقالة على شريحة زجاجية والصورة باستخدام CLSM 47.
- تقييم التعبير الجيني من قبل في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (QPCR). استخدام مجموعات موحدة لعكس الناسخ PCR (RT-PCR) 53 و 54 QPCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا كما هو موضح أدناه.
- ضع سقالة (من الخطوة 3.7) في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
- ماصة 200 ميكرولتر من كلوروفورم في كل أنبوب microcentrifuge ويهز الأنبوب بقوة في متناول اليد لمدة 15-20 ثانية. إبقاء الأنابيب في RT ل~ 3 دقائق حتى مراحل منفصلة.
- أجهزة الطرد المركزي في العينة 13000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، وإزالة الأنابيب بعناية بحيث مراحل لا يختلطان.
- بعناية ماصة 500-600 ميكرولتر من المرحلة المائية العليا من الأنبوب الأول في أنبوب microcentrifuge الثاني.
- إضافة حجم ما يعادل (500-600 ميكرولتر) من الأيزوبروبانول لهذا الأنبوب الثاني.
- عكس الأنبوب 3-5 مرات وترك الأنبوب يقف عند RT لمدة 10 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي في العينة 13000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- إذا كان بيليه هو غير مرئي في الجزء السفلي من الأنبوب، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: إذا كان لا يزال هناك بيليه وضوحا، وكمية من الحمض النووي الريبي قد لا تكون كافية.
- إذا كان بيليه هو غير مرئي في الجزء السفلي من الأنبوب، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق.
- أناأنابيب nvert مع غطاء مفتوحة للتجاهل وطاف ماصة في 1 مل 70٪ من الإيثانول المخفف في الماء DEPC في أنبوب.
- قليلا دوامة أنبوب حتى يفصل بيليه من جدار الأنبوب ومن ثم السماح للالجافة أنبوب الهواء.
- إضافة 50 ميكرولتر من المياه DPEC ل resuspend بيليه.
- الحفاظ pipetting لحتى يذوب بيليه.
- الاحتفاظ لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 55 مئوية لتفسد RNA المزدوج تقطعت بهم السبل في الحمض النووي الريبي واحد الذين تقطعت بهم السبل.
- بخفة حشد الأصابع على الجزء السفلي الأنبوب ثم الطرد المركزي الأنابيب لفترة وجيزة (7500 x ج، 4 دقائق، 4 درجة مئوية).
- إبقاء الأنابيب في الثلج حتى أداء عكس الناسخ 55 وفي الوقت الحقيقي PCR كما هو موضح في 56.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتظهر نتائج ممثلة لتوصيف الهيكلي للسقالة المحكمة الجنائية الدولية والمقارنة بين فعالية كل ICC حالة سقالة في زراعة خلايا الكبد وأوضح أدناه. شروط سقالة للمحكمة الجنائية الدولية المستخدمة في هذه النتائج هي الطلاء الكولاجين 0 ميكروغرام / مل (باري)، و 20 ميكروغرام / مل (الكولاجين 20)، 200 ميكروغرام / مل (الكولاجين 200)، و 400 ميكروغرام / مل (الكولاجين 400) والأولي هاه 7.5 خلية رقم البذر هو 1X10 6.
توصيف الترابط المسام المحكمة الجنائية الدولية وطوبولوجيا سقالة.
SEM التصوير، وبعد تثبيت وتجميد التجفيف من السقالات للمحكمة الجنائية الدولية، وقد استخدم لأول مرة لتحديد ما إذا تم تشكيل الترابط المناسبة بين المسام المحكمة الجنائية الدولية ولرؤية تأثير اقتران تركيزات الكولاجين متنوعة على طوبولوجيا سقالة. التحليل الكمي للد اثنينimensional العارية الصور للمحكمة الجنائية الدولية ووزارة شؤون المرأة (الشكل 3A) باستخدام برنامج ImageJ، كشفت أن متوسط قطر المسام من 102.3 ± 9.3 ميكرون ويبلغ متوسط قطرها الربط بين 38.6 ± 4.3 ميكرومتر (الشكل 3B، C). هذا الربط بين المسام يلعب دورا هاما في نشر الصحيح من العناصر الغذائية إلى الخلايا وكذلك التفاعل خلية خلية في جميع أنحاء سقالة. نتج عن طلاء من الكولاجين في شبكة شبكة الألياف التي تم تعريفها أكثر على تركيزات أعلى من الاقتران الكولاجين (الشكل 4A). صور مبائر تكشف حتى طبقات الكولاجين على أسطح التجويف وارتفاع سطح تغطية المنطقة مع زيادة في تركيز الكولاجين (الشكل 4B).
تأثير الظروف منصة المحكمة الجنائية الدولية يوم هوه 7.5 خلية الجدوى وظيفة.
تعرض هاه 7.5 الخلايا إلى لايف / وصمة عار الميت الفلورسنتجي فحص (4 ميكرومتر calcein AM و 8 ميكرومتر EthD-1) وتصويرها باستخدام CLSM، كما هو مبين في الشكل (5). خلايا المصنف في السقالات العارية، ICC غير لاصقة تميل إلى تجميع في وسط المسام وخلية خلية الربط بين واعتبر المسام في أوقات لاحقة (أيام 7 و 10). وجود طلاء الكولاجين على السقالات للمحكمة الجنائية الدولية سمح خلايا التمسك سطح سقالة فضلا عن أمور المسام خلية خلية التفاعل في وقت مبكر من يوم 1. بقاء الخلية، التي أشار إليها وصمة عار الخضراء، ازدادت مع الوقت وكان أعلى بشكل عام في السقالات المغلفة الكولاجين، كما يتضح من مخضر العالي. ويبين الشكل 6 نتائج MSR الكمية لمزيد من التحقيق للتأثير على بنية البروتين وتركيز للمحكمة الجنائية الدولية 3D على بقاء الخلية. تم إجراء فحص اللونية بقاء الخلية على الخلايا المستزرعة في الظروف سقالة للمحكمة الجنائية الدولية فضلا عن بيانات لوحة الثقافة البوليسترين والامتصاصية 2D (تقاس في 450 نانومتر) وتطبيع لرانه التحكم (يوم 1). حافظت خلايا مثقف على لوحات 2D بقاء الخلية ولكن لم يلاحظ أي زيادة في تكاثر الخلايا. 3D العارية للمحكمة الجنائية الدولية سقالة تتعزز بشكل كبير تكاثر الخلايا بالمقارنة مع حالة 2D، مما يدل على أهمية مصفوفة 3D. مع إضافة طلاء الكولاجين، وزيادة تكاثر الخلايا مع مرور الوقت في جميع التركيزات الكولاجين وعثر على الحد الأقصى للانتشار في 200 ميكروغرام / سقالة للمحكمة الجنائية الدولية المغلفة مل يوم 14. وهذا يؤكد الملاحظات نوعية في الشكل (5).
تم تقييم وظيفة خلايا الكبد من خلال رصد التغيرات في إفراز الزلال وكذلك الملف الشخصى التعبير الجيني من ثلاثة بروتينات التصاق في مختلف الظروف سقالة للمحكمة الجنائية الدولية. الشكل 7 يوضح علاقة إيجابية بين ألبومين المصل يفرز، كما كميا بواسطة الألبومين ELISA، وتركيز الكولاجين مترافق ل السقالة. في يوم 14، هوه 7.5 الخلايا المستزرعة في400 ميكروغرام / السقالات للمحكمة الجنائية الدولية المغلفة مل يفرز أكثر من ثلاثة أضعاف كمية الزلال مثل تلك المثقف في السقالة العارية. تظهر نتائج لملامح التعبير الجيني E-كادهيرين، N-كادهيرين، وإنتغرين البروتينات β1 في مختلف الظروف سقالة المحكمة الجنائية الدولية في الشكل 8. ارتفع معدل التعبير مرنا E-كادهيرين في 400 ميكروغرام / السقالات للمحكمة الجنائية الدولية المغلفة مل بأكثر من 4 أضعاف بالمقارنة مع الظروف طلاء أخرى (الشكل 8A). وكان التغيير أضعاف في التعبير الجيني N-كادهيرين أكبر في تركيزات أعلى من طلاء الكولاجين. ومع ذلك، فإن إنتغرين β1 التعبير الجيني بقي ثابتا نسبيا أو انخفضت في جميع الظروف السقالات للمحكمة الجنائية الدولية باستثناء 200 ميكروغرام / السقالات للمحكمة الجنائية الدولية المغلفة مل.
الشكل 2. الإقتران من الكولاجين لالسقالة PEGDA عبر NHS الكيمياء. السقالات النشطة بيولوجيا تستخدم PEG-NHS يحتوي على استر أمين رد الفعل succinimidyl (NHS) أن يتفاعل مع مجموعة أمين في الكولاجين مما يسمح اقتران إلى السقالة. PEG، بولي (جلايكول الإثيلين)؛ NHS، N -hydroxysuccinimide. الأشعة فوق البنفسجية، الأشعة فوق البنفسجية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وقد تم تحليل الشكل 3. تحليل حجم تجاويف المحكمة الجنائية الدولية والترابط. (A) الميكروسكوب SEM من سقالة للمحكمة الجنائية الدولية (مقياس بار = 100 ميكرون) باستخدام برنامج ImageJ وكميا ممثلة على النحو المدرج الاحصائي من (ب) مسام وقطرها (C) قطر الربط. تم تعديل هذا الرقم و تستعمل بإذن من وايلي 47. "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54331/54331fig3large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. تأثير طلاء الكولاجين في طوبولوجيا سقالة للمحكمة الجنائية الدولية. (A) صور SEM و (ب) وقد أخذت صور مبائر لتقييم نوعيا طوبولوجيا سطح السقالات المغلفة مع 20 ميكروغرام / مل، 200 ميكروغرام / مل، و 400 ميكروغرام / مل من الكولاجين. مربعات حمراء تحيط تجويف هو مبين في الصور أعلى التكبير أدناه. الحانات هي مقياس (A) 5 ميكرون، (ب) 200 ميكرون، و 100 ميكرون (أعلى التكبير). تم تعديل هذا الرقم و تستعمل بإذن من وايلي 47. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> 
الرقم 5. تأثير الظروف منصة للمحكمة الجنائية الدولية على بقاء الخلية ومورفولوجيا باستخدام النوعي لايف / فحص الميت. الصور متحد البؤر من الميت هوه 7.5 الخلايا الحية / ملطخة المصنف في السقالات للمحكمة الجنائية الدولية مع مختلف الطلاء تركيز الكولاجين (0، 20، 200، و 400 ميكروغرام / مل) تم اتخاذها بعد 1 و 4 و 7 و 10 أيام البذر. وصمة عار الخضراء (calcein) إلى الخلايا الحية وبقعة حمراء (إيثيديوم homodimer-1) يشير إلى موت الخلية. وتشير الحانات مقياس 200 ميكرون. [تم تعديل هذا الرقم و تستعمل بإذن من وايلي 47] يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6. تأثيرمن نوع النظام الأساسي والنظام الأساسي للمحكمة الجنائية الدولية الظروف على بقاء الخلية باستخدام الكمية اللونية الفحص بقاء الخلية. هوه 7.5 خلايا المصنف على لوحة الثقافة البوليسترين 2D وفي السقالات للمحكمة الجنائية الدولية مع مختلف الطلاء تركيز الكولاجين (0، 20، 200، و 400 ميكروغرام / مل ) تعرضوا إلى MSR اللونية جدوى الفحص 1، 4، 7، 10، وبعد 14 يوما البذر. وقد تم قياس الامتصاصية في 450 نانومتر، وتم تطبيع البيانات إلى يوم 1 القيم الامتصاصية. (ن = 3، يعني ± SD؛ ***: P <0.001 مقارنة MSR حل الامتصاصية قراءة ليوم 1 من كل مجموعة.) [تم تعديل هذا الرقم و تستعمل بإذن من وايلي 47] الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. تأثير للمحكمة الجنائية الدولية صحالة latform على هوه 7.5 وظيفة باستخدام الزلال تركيز تحليل ELISA يفرز. وقد استخدم الزلال ELISA لقياس إفراز ألبومين المصل في وسائل الإعلام التي تم جمعها من السقالات ICC-الخلية محملة مختلفة الطلاء تركيز الكولاجين (0، 20، 200، و 400 ميكروغرام / مل) على أيام 1 و 4 و 7 و 10 و 14 بعد البذر. كل نقطة البيانات تمثل في المتوسط 3 عينات وغير طبيعية لعدد من الخلايا الموجودة باستخدام اللونية MSR فحص سلامة الخلية والمنحنى القياسي خلق (ن = 3، يعني ± SD). [تم تعديل هذا الرقم و تستعمل بإذن من وايلي 47] يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 8. تأثير حالة منصة المحكمة الجنائية الدولية يوم هوه 7.5وظيفة باستخدام تحليل التعبير الجيني. وقد استخدم في الوقت الحقيقي الكمي PCR لمحة التعبير الجيني للخلايا المستزرعة في السقالات للمحكمة الجنائية الدولية مع مختلف الطلاء تركيز الكولاجين (0، 20، 200، و 400 ميكروغرام / مل) على أيام 1 و 4 و 7 بعد البذر. وقد تم اختيار ثلاثة بروتينات تقاطع، وهي (أ) E-كادهيرين، (ب) N-كادهيرين، و (C) إنتغرين بيتا 1. مرنا وتم تطبيع مستويات التعبير GAPDH. (ن = 3، يعني ± SD *: P <0.05 **:.. P <0.01 بالمقارنة مع التعبير الجيني من يوم 1 من كل مجموعة) [تم تعديل هذا الرقم وتستخدم مع إذن من وايلي 47] يرجى النقر هنا ل عرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والسقالات هندسة الأنسجة تتطور بسرعة لتقديم كل الاشارات الجسدية والكيميائية الحيوية اللازمة لتجديد وصيانة أو إصلاح الأنسجة لتطبيق استبدال الجهاز، ودراسة الأمراض وتطوير الأدوية، وغيرها الكثير 57. في هندسة الأنسجة الكبد وخلايا الكبد البشرية الأولية يفقد بسرعة وظائف الأيض مرة واحدة معزولة عن الجسم، وخلق حاجة كبيرة لالسقالات الهندسية وتطوير منصات للحفاظ على وظائف الكبد. وقد استخدمت التيار في منصات ثقافة الكبدية المختبر الحيوية المختلفة. وقد تركزت الأبحاث في هذا المجال على محاكاة ميزات مختلفة من الجسم الحي في المكروية الكبدية، مثل تكوين البروتين ECM 58،59، وشارك في ثقافة 60،61، وmicropatterning 62. ومع ذلك، فقد كان هناك نقص في السقالات مع المسامية للرقابة والتنظيم المكاني عالية. في هذا الصدد، وصفت محكمة الجنائية الدولية platf ثقافة الخليةمكتب إدارة السجلات، مع خصائص الخواص والتنظيم عالية، ويتناول هذا الفراغ. ونحن لشرح سقالة للمحكمة الجنائية الدولية PEGDA هي عبارة عن منصة مناسبة لزراعة الخلايا سرطانة الكبد، وهو نوع من الخلايا نموذجا لخلايا الكبد، وذلك طلاء المزيد من الكولاجين يعزز سلوك الخلية 47.
في الممارسة العملية، وحجم تجويف سقالة للمحكمة الجنائية الدولية يمكن ضبطها حسب حجم المجهرية PS. وبالإضافة إلى ذلك، فإن حجم مترابطة من السقالة يمكن التحكم في الوقت ودرجة الحرارة من عملية الصلب. ارتفاع درجة الحرارة الصلب أو أطول النتائج الوقت الصلب بأقطار الربط أكبر. لذلك، يجب أن يتم تحديد هذه المعايير بدقة كما أقطار الربط أكبر سوف يعرض للخطر الاستقرار الميكانيكي للسقالة. في هذا العمل، وقد تم اختيار المجالات PS قطرها 140 ميكرون لزراعة الخلايا الكبدية للحد من حجم hepatospheres مما أدى إلى السقالات للمحكمة الجنائية الدولية العارية لمنع نخر من الخلايا في وسط كانpatocyte كروي. 63 كما هو مبين في نتائج التمثيلية، والهندسة المعمارية 3D من سقالة للمحكمة الجنائية الدولية تسمح أعلى هوه 7.5 تكاثر الخلايا بالمقارنة مع 2D زراعة الخلايا لوحة البوليسترين. وتشير النتائج إلى أن تسوس الأسنان موحدة مترابطة من سقالة للمحكمة الجنائية الدولية تسمح كفاءة التفاعل خلية خلية والحديث المتبادل بين تجاويف.
تركيز على نوع الكولاجين أنا طلاء المتضررين خلية التشكل، والسلامة وظيفة. نوع الكولاجين أنا هو بروتين ECM المهم وجدت في الفضاء من ديس، وهي منطقة مجاورة للخلايا الكبد 64. روجت Nonadhesive، عارية PEGDA السقالات للمحكمة الجنائية الدولية تشكيل كروي الكبدية في حين، طلاء الكولاجين أصدرت النشطة بيولوجيا سقالة وهوه 7.5 خلايا انضمت إلى سطح سقالة، الاستفادة من مساحة كبيرة الحاضر. وECM المغلفة البروتين السقالات للمحكمة الجنائية الدولية حسنت كلا من التفاعل خلية خلية، وكذلك تفاعل الخلايا ECM، كما يدل على ذلك upregulated كادهيرين E، N-cadheرين وإنتغرين تعبيرات الجين β1، والتي تلعب دورا في تنظيم سلوك الخلية. كانت الكولاجين النوع الأول تركيزات من 200 ميكروغرام / مل و 400 ميكروغرام / مل مناسبة لهوه 7.5 ثقافة، وتحسين كل من تكاثر الخلايا وإفراز الزلال.
القيد الرئيسي الذي يشكله تلفيق المحكمة الجنائية الدولية هو السيطرة على محاذاة PS المجال، وعدد عندما جعل الأسوار. تبخر سريع من الإيثانول أثناء تحميل المجالات في قوالب يمكن أن يسبب كثافة المجال مختلفة، مما أدى إلى عدد مختلف من طبقات من المجالات في الشبكات. ومع ذلك، فإن استخدام محلول أقل تقلبا مثل الماء له أيضا مساوئ. أن يؤدي إلى بطاقات الإئتمان أقل أمر في نظام تعويم التجمع 65، وهناك احتمال كبير لسطح سقالة للغاية منحني بسبب تشكيل الغضروف المفصلي. الحد الآخر هو المحاذاة الصحيحة من المجالات في قوالب لضمان أعلى كفاءة من الترابط. لذا ج الخطوة تهز (الخطوة 1.1.5 و1.1.6) هيritical إلى تقنية تصنيع للمحكمة الجنائية الدولية. إن لم يكن لوحظ ترتيب جيد بواسطة المجهر، كرر الخطوة 1.1.6.
وعموما، فإن سقالة للمحكمة الجنائية الدولية PEGDA، مع بروتوكولها تلفيق بسيط، ويمكن استخدامها بسهولة كمنصة لتطبيقات زراعة الخلايا 3D. التنشيط الحيوي للسقالة عارية مع البروتينات يعزز الخصائص الوظيفية 14. في هذه المخطوطة، ونحن مصممة بروتوكول تلفيق لواختار فحوصات تقييم خلية لتطبيق الكبد هندسة الأنسجة. ومع ذلك، مجموعة من أنواع الخلايا يمكن تربيتها داخل هذه السقالة فريدة من نوعها، ولكل نوع من الخلايا قد يتطلب تغيير بعض المعلمات. يمكن لجميع ستضاف أيضا طبقات من التعقيد من حيث عدة أنواع البروتين ECM، شارك في الثقافة، والثقافة الديناميكية باستخدام مفاعل حيوي لتعزيز أداء الخلية إلى أبعد من ذلك. هذا البرنامج لديه القدرة للمساعدة في تجديد الأنسجة وتطوير الأدوية، لدراسة أمراض الكبد، واستخدامها للزرع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
الكتاب نود أن نعترف بدعم من مؤسسة أبحاث زمالة الوطنية (جبهة الخلاص الوطني -NRFF2011-01) وبرنامج البحوث التنافسية (جبهة الخلاص الوطني، CRP10-2012-07).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 ml PCR tube | Axygen Scientific | PCR-02D-C | Boil-proof |
| Gorilla Glue | Gorilla Glue, Inc. | Depends on vendor. This was purchased from a local store. | |
| Glass slides | VWR | 631-1575 | Dimensions: 24×60 mm2 |
| Polystyrene spheres | Fisher Scientific | TSS#4314A | Diameter = 140 µm; 3x104 particles per milliliter and 1.4% size distribution |
| Ethanol | Merck | 1.00983.1011 | absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water |
| Ultrasonic Bath | Elma | S10H | Equiment |
| Furnace | Nabertherm | N7/H | Equipment |
| 200 µl pipette tip | Axygen Scientific | T-210-Y-R-S | |
| Rocking shaker | VWR | 444-0142 | |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Merck | 1.09727.0100 | Mw= 4 kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6 kDa |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | Equipment |
| Acrylate-Poly(Ethylene Glycol) - Succinimidyl Valerate | Laysan Bio | ACRL-PEG-SVA-3400-1g | Mw = 3.4 kDa |
| 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma Aldrich | 410896 | |
| Vortex | VWR | 58816-123 | Equipment |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5404 000.413 | |
| Paraffin Film | Parafilm M | #PM996 | Kept at 9" with allows intensity of 10.84 mW/cm2 |
| Bluewave 200 UV spotlight | Blaze Technology | 120008, 122300 | |
| Tetrahydrofuran (THF) | Merck | 107025 | |
| Orbital shaker | Heidolph | 543-123120-00-5 | |
| Collagen Type I | Sigma Aldrich | C3867-1VL | From rat. 1x, w/o CaCl2 & MgCl2; pH = 7.2 |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 20012-027 | 16% W/V AQ. 10 x 10 ml |
| Paraformaldehyde | VWR | 43368.9M | Equipment |
| Freezone 4.5 freeze drier | Labconco | 7750020 | Equipment |
| Sputter coater | Jeol Ltd. | JFC-1600 | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Jeol Ltd. | JSM 5310 | |
| Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I | Abcam | ab6308 | |
| Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21121 | |
| Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon) | Bio-Rev PTE LTD | 3820-024 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 2.5 g/L Glucose w/ L-Gln |
Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | A15-151 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Life Tchnologies | 15140-122 E | |
| 100 mm Corning non-treated culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430591 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Equipment; 37 °C, 5% Humidity |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubators | Thermofisher Scientific | 371 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer | Thermofisher Scientific | 02-671-6 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for mammalian cells | Life Technologies | L3224 | |
| CCK-8 Assay | Dojindo Laboratories | CK04-11 | Monosodium-salt reagent (MSR) |
| Infinite 200 PRO microplate reader | Tecan | ||
| Albumin Human ELISA kit | Abcam | ab108788 | |
| Triton X-100 | Bio-Rad | #1610407 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin) | Santa Cruz Biotechnology | sc-53850; sc-271605 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| Alexa Fluor 555 labeled Phalloidin | Life Technologies | A34055 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | |
| Chloroform | VWR | 22706.326 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
| DPEC water | Thermofisher Scientific | AM9916 | |
| Nanodrop 2000c Spectrophotometer | Thermofisher Scientific | ND-2000 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708840 | |
| SYBR select Master Mix for CFX | Life Technology | 4472937 | |
| Primers (to be chosen) | |||
| CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler | Bio Rad Laboratories | SOFT-CFX-31-PATCH |
References
- Yamada, M., et al. Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions. Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).
- Abboud, G., Kaplowitz, N.
- Cho, N. J., et al. Viral infection of human progenitor and liver-derived cells encapsulated in three-dimensional PEG-based hydrogel. Biomed Mater. 4 (1), (2009).
- Revzin, A., et al. Designing a hepatocellular microenvironment with protein microarraying and poly (ethylene glycol) photolithography. Langmuir. 20 (8), 2999-3005 (2004).
- Sato, A., Kadokura, K., Uchida, H., Tsukada, K. An in vitro hepatic zonation model with a continuous oxygen gradient in a microdevice. Biochem Bioph Res Com. 453 (4), 767-771 (2014).
- Domansky, K., et al. Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering. Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).
- Hegde, M., et al. Dynamic interplay of flow and collagen stabilizes primary hepatocytes culture in a microfluidic platform. Lab Chip. 14 (12), 2033-2039 (2014).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat methods. 2 (2), 119-125 (2005).
- Underhill, G. H., Chen, A. A., Albrecht, D. R., Bhatia, S. N. Assessment of hepatocellular function within PEG hydrogels. Biomaterials. 28 (2), 256-270 (2007).
- Dunn, J., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Hepatocytes in collagen sandwich: evidence for transcriptional and translational regulation. J cell biol. 116 (4), 1043-1053 (1992).
- Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol progr. 7 (3), 237-245 (1991).
- Ling, Y., et al.
- Kim, M., Lee, J. Y., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31 (13), 3596-3603 (2010).
- Kotov, N. A., et al. Inverted Colloidal Crystals as Three-Dimensional Cell Scaffolds. Langmuir. 20 (19), 7887-7892 (2004).
- Shanbhag, S., Woo Lee, J., Kotov, N. Diffusion in three-dimensionally ordered scaffolds with inverted colloidal crystal geometry. Biomaterials. 26 (27), 5581-5585 (2005).
- Lee, Y. H., Huang, J. R., Wang, Y. K., Lin, K. H. Three-dimensional fibroblast morphology on compliant substrates of controlled negative curvature. Integr Biol. 5, 1447-1455 (2013).
- da Silva, J., Lautenschlager, F., Kuo, C. H. R., Guck, J., Sivaniah, E. 3D inverted colloidal crystals in realistic cell migration assays for drug screening applications. Integr Biol. 3, 1202-1206 (2011).
- da Silva, J., Lautenschlager, F., Sivaniah, E., Guck, J. R. The cavity-to-cavity migration of leukaemic cells through 3D honey-combed hydrogels with adjustable internal dimension and stiffness. Biomaterials. 31, 2201-2208 (2010).
- Lee, J., Lilly, G. D., Doty, R. C., Podsiadlo, P., Kotov, N. A. In vitro toxicity testing of nanoparticles in 3D cell culture. Small. 5, 1213-1221 (2009).
- Lee, J., Kotov, N. A. Notch ligand presenting acellular 3D microenvironments for ex vivo human hematopoietic stem-cell culture made by layer-by-layer assembly. Small. 5, 1008-1013 (2009).
- Liu, Y., et al. Rapid aqueous photo-polymerization route to polymer and polymer-composite hydrogel 3D inverted colloidal crystal scaffolds. J Biomed Mater Res. Part A. 83, 1-9 (2007).
- Ma, P. X., Choi, J. W. Biodegradable polymer scaffolds with well-defined interconnected spherical pore network. Tissue Eng. 7, 23-33 (2001).
- Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Poly (lactic-co-glycolic acid) bone scaffolds with inverted colloidal crystal geometry. Tissue Eng Part A. 14, 1639-1649 (2008).
- Choi, S. W., Zhang, Y., Xia, Y. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering: the importance of uniformity in pore size and structure. Langmuir. 26, 19001-19006 (2010).
- Choi, S. W., Zhang, Y., Thomopoulos, S., Xia, Y. In vitro mineralization by preosteoblasts in poly(DL-lactide-co-glycolide) inverse opal scaffolds reinforced with hydroxyapatite nanoparticles. Langmuir. 26, 12126-12131 (2010).
- Choi, S. W., Zhang, Y., Macewan, M. R., Xia, Y. Neovascularization in biodegradable inverse opal scaffolds with uniform and precisely controlled pore sizes. Adv Healthc Mater. 2, 145-154 (2013).
- Zhang, Y., Choi, S. W., Xia, Y. Modifying the Pores of an Inverse Opal Scaffold With Chitosan Microstructures for Truly Three-Dimensional Cell Culture. Macromol Rapid Commun. 33, 296-301 (2012).
- Cai, X., et al. Investigation of neovascularization in three-dimensional porous scaffolds in vivo by a combination of multiscale photoacoustic microscopy and optical coherence tomography. Tissue Eng. Part C, Meth. 19, 196-204 (2013).
- Zhang, Y. S., Yao, J., Wang, L. V., Xia, Y. Fabrication of Cell Patches Using Biodegradable Scaffolds with a Hexagonal Array of Interconnected Pores (SHAIPs). Polymer. 55, 445-452 (2014).
- Zhang, Y. S., Regan, K. P., Xia, Y. Controlling the Pore Sizes and Related Properties of Inverse Opal Scaffolds for Tissue Engineering Applications. Macromol Rapid Commun. 34, 485-491 (2013).
- Stachowiak, A. N., Bershteyn, A., Tzatzalos, E., Irvine, D. J. Bioactive Hydrogels with an Ordered Cellular Structure Combine Interconnected Macroporosity and Robust Mechanical Properties. Adv Mater. 17, 399-403 (2005).
- Stachowiak, A. N., Irvine, D. J. Inverse opal hydrogel-collagen composite scaffolds as a supportive microenvironment for immune cell migration. J Biomed Mater Res. Part A. 85, 815-828 (2008).
- Liu, Y., Wang, S. 3D inverted opal hydrogel scaffolds with oxygen sensing capability. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 58, 8-13 (2007).
- Bryant, S. J., Cuy, J. L., Hauch, K. D., Ratner, B. D. Photo-patterning of porous hydrogels for tissue engineering. Biomaterials. 28, 2978-2986 (2007).
- Bhrany, A. D., Irvin, C. A., Fujitani, K., Liu, Z., Ratner, B. D. Evaluation of a sphere-templated polymeric scaffold as a subcutaneous implant. JAMA facial plastic surgery. 15, 29-33 (2013).
- Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Inverted colloidal crystal scaffolds with laminin-derived peptides for neuronal differentiation of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 32 (3), 819-831 (2011).
- Yang, J. T., Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Peptide-modified inverted colloidal crystal scaffolds with bone marrow stromal cells in the treatment for spinal cord injury. Colloids Surf. B, Biointerfaces. 84, 198-205 (2011).
- Kuo, Y. C., Tsai, Y. T. Inverted colloidal crystal scaffolds for uniform cartilage regeneration. Biomacromolecules. 11, 731-739 (2010).
- Choi, S. W., Xie, J., Xia, Y. Chitosan-Based Inverse Opals: Three-Dimensional Scaffolds with Uniform Pore Structures for Cell Culture. Adv Mater. 21, 2997-3001 (2009).
- Long, T. J., Sprenger, C. C., Plymate, S. R., Ratner, B. D. Prostate cancer xenografts engineered from 3D precision-porous poly(2-hydroxyethyl methacrylate) hydrogels as models for tumorigenesis and dormancy escape. Biomaterials. 35, 8164-8174 (2014).
- Kuo, Y. C., Tsai, Y. T. Inverted colloidal crystal scaffolds for uniform cartilage regeneration. Biomacromolecules. 11, 731-739 (2010).
- Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Inverted colloidal crystal scaffolds with laminin-derived peptides for neuronal differentiation of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 32, 819-831 (2011).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Cater, G. M., Kotov, N. A. Engineering liver tissue spheroids with inverted colloidal crystal scaffolds. Biomaterials. 30 (27), 4687-4694 (2009).
- Galperin, A., et al. Integrated bi-layered scaffold for osteochondral tissue engineering. Adv Healthc Mater. 2, 872-883 (2013).
- Waters, D. J., et al. Morphology of Photopolymerized End-linked Poly(ethylene glycol) Hydrogels by Small Angle X-ray Scattering. Macromolecules. 43 (16), 6861-6870 (2010).
- Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Conjugate addition reactions combined with free-radical cross-linking for the design of materials for tissue engineering. Biomacromolecules. 2 (2), 430-441 (2001).
- Kim, M. H., et al. Biofunctionalized Hydrogel Microscaffolds Promote Three-Dimensional Hepatic Sheet Morphology. Macromol Biosci. , (2015).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. , http://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html#toc-Subsection-30.1 (2012).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
- Tominaga, H., et al. A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay. Anal Commun. 36 (2), 47-50 (1999).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to the Microplate Reader. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1, 1559-1582 (2006).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Environmental Microbiology. RNA Analysis of Environmental Samples Using RT-PCR. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
- JoVE Science Education. Essentials of Environmental Microbiology. , JoVE. (2015).
- Jeong, S., et al. The evolution of gene regulation underlies a morphological difference between two Drosophila sister species. Cell. 132 (5), 783-793 (2008).
- Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering--current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), 1009-1014 (2002).
- Hegde, M., et al. Dynamic Interplay of Flow and Collagen Stabilizes Primary Hepatocytes Culture in a Microfluidic Platform. Lab Chip. 14, 2033-2039 (2014).
- Kim, Y., Lasher, C. D., Milford, L. M., Murali, T., Rajagopalan, P. A comparative study of genome-wide transcriptional profiles of primary hepatocytes in collagen sandwich and monolayer cultures. Tissue Eng Pt C. 16 (6), 1449-1460 (2010).
- Baimakhanov, Z., et al. Efficacy of multi-layered hepatocyte sheet transplantation for radiation-induced liver damage and partial hepatectomy in a rat model. Cell Transplant. , (2015).
- Li, C. Y., et al. Micropatterned Cell-Cell Interactions Enable Functional Encapsulation of Primary Hepatocytes in Hydrogel Microtissues. Tissue Eng Pt A. 20 (15-16), 2200-2212 (2014).
- Shlomai, A., et al. Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems. P Natl A Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).
- Curcio, E., et al. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).
- Martinez-Hernandez, A., Amenta, P.
- Liu, Y., Wang, S., Lee, J. W., Kotov, N. A. A Floating Self-Assembly Route to Colloidal Crystal Templates for 3D Cell Scaffolds. Chem Mater. 17 (20), 4918-4924 (2005).
