Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Flowcytometri-baserede assay for Overvågning af NK cellefunktioner

Published: October 30, 2016 doi: 10.3791/54615
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 1,2, 1,2
1Childrens Hospital, Department of Pediatric Stem Cell Transplantation and Immunology, Johann Wolfgang Goethe-University, 2LOEWE Center for Cell and Gene Therapy, Johann Wolfgang Goethe-University, 3Institute for Cancer Research, Department of Cancer Immunology, Oslo University Hospital, Radiumhospital, 4The KG Jebsen Center for Cancer Immunotherapy, Institute of Clinical Medicine, University of Oslo
* These authors contributed equally

Summary

En enkel og pålidelig fremgangsmåde er beskrevet her for at analysere et sæt af NK cellefunktioner såsom degranulering, cytokin og chemokin produktion inden for forskellige NK-celle delmængder.

Introduction

Som en del af det medfødte immunsystem naturlige dræberceller (NK-celler) bidrager til den første linje i forsvar mod virus-inficerede eller malignt transformerede celler. Et system af inhiberende og aktiverende receptorer gør dem i stand til at skelne mellem raske og transformerede celler uden forudgående antigenpriming i modsætning til T-celler. Ved target celle støder NK-celler frigiver indholdet af deres cytotoksiske granulat (f.eks perforin, granzymer) i immunsystemet synapsen til at dræbe deres mål. Desuden NK-celler producerer og udskiller forskellige slags cytokiner (fx interferon-y: IFN-γ; tumornekrosefaktor-α: TNF-α) og chemokiner (f.eks makrofag inflammatorisk protein-1β: MIP-1) efter målcelle interaktion eller cytokinstimulering 1.

Tilstrækkelige NK celle funktioner såsom cytotoksicitet, chemokin og cytokinproduktion har en betydelig indvirkning på den skæbne diverse disletter. Leukæmi patienter viser øget tilbagefald, hvis de udviser en defekt NK-celle-profil ved diagnose bestående af reduceret IFN-γ produktion og reduceret ekspression af aktiverende NK celle receptorer 2. En tidlig genopretning af NK celle numre og funktion, herunder cytokinproduktion på target celle interaktion er forbundet med en reduceret tilbagefald og forbedret overlevelse hos patienter i allogen stamcelletransplantation 3. Desuden ved initiering af interferonbehandling i virus-inficerede patienter hepatitis C i degranulering kapacitet af perifere NK-celler er stærkere i de tidlige respondenter end hos ikke-responders 4. NK celle tal (> 80 / ul) på dag 15 efter autolog stamcelletransplantation (autoSCT) hos patienter, der lider af lymfom eller myelomatose er prædiktive for en forbedret progressionsfri og samlet overlevelse fem. I melanompatienter ekspressionen af ​​T-celle immunoglobulin- og mucin-domæne-containing molekyle-3 (TIM-3), en immun-regulatorisk protein på NK-celler, korrelerer med sygdom fase og prognose 6.

Forskere har overvåget NK cellefunktioner gennem de seneste årtier. Den indledende analyse af NK-celle cytotoksicitet mod tumorceller uden forudgående priming blev behandlet ved hjælp af en 51 Cr-release assay 7. For nylig har forskere udviklet en ikke-radioaktiv fremgangsmåde til evaluering af cytotoksicitet af ekspanderede NK-celler 8. Cytokin og chemokin produktion er ofte blevet evalueret ved brug enzymmaerket assay (ELISA) teknikker 9,10. I de sidste årtier disse metoder er blevet suppleret med flowcytometri-baserede assays. Brugen af protein transport hæmmere (f.eks Brefeldin A og monensin) og celle permeabilisering metoder i kombination med konventionel overflade farvningsprotokoller har aktiveret forskere til at studere chemokin og cytokinproduktion i forskellige specifikke lymfeknuderocyte delmængder (fx T, B eller NK-celler) 11. Desuden har forskellige flowcytometri assays blevet udviklet til at overvåge T og NK-cellers cytotoksicitet. I 2004 beskrev Alter et al. Overfladeekspressionen af lysosomet-associeret protein CD107a (Lamp1) på NK-celler ved målcelle støder som markør for degranulering af cytotoksiske granuler 12. Da en lang række forskellige fluorochromer og flerkanals-flowcytometre er tilgængelige i vore dage er det blevet muligt samtidigt at overvåge forskellige NK cellefunktioner (cytotoksicitet, cytokinreceptorer og kemokinproduktion) i forskellige NK-celle delmængder. Dette bliver især vigtigt i situationer, hvor stikprøve størrelse er begrænset, f.eks i biopsier eller blodprøver fra patienter, der lider leukopeni.

For at teste globale NK cellefunktioner, kan de forskellige flowcytometri assays effektivt kombineres. Theorell et al. Stimulerede NK-celler fra healthy donorer med tumoren K562 og analyseret NK-celle degranulering, inside-out signal og chemokin produktion via flowcytometri 13. Senest NK-celle-undergrupper, fænotyper og funktioner i tumor patienter under autoSCT blev analyseret ved anvendelse af flowcytometri-baserede assays. Det blev påvist, at NK-celler var i stand til at degranulere og producere cytokiner / chemokiner upon tumorcelle anerkendelse på meget tidlige tidspunkter efter autoSCT 11.

Her en protokol er beskrevet for at evaluere NK celle funktioner ved interaktion med tumorceller inklusiv degranulering kapacitet, chemokin og cytokinproduktion ved anvendelse af en flow-cytometri-baseret assay, der gør det muligt at overvåge NK celle funktioner i forskellige undersæt samtidigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne fra den lokale etiske udvalg fra University of Frankfurt.

1. Dyrkning af K562-celler

  1. Kultur K562-celler i R10 medier (RPMI1640 med glutamin-medium, 1% penicillin / streptomycin, 10% føtalt kalveserum) ved en densitet på 0,5-1 x 10 6 celler pr ml i en cellekultur kolbe ved 37 ° C og 5% CO 2.
  2. Harvest K562 Cells 24 timers Før starten af ​​et nyt eksperiment.
    1. cellekulturen kolbe indeholdende K562-celler fra inkubatoren fjerne. Resuspender K562 celler i kulturmedier ved forsigtigt at pipettere op og ned.
    2. Overfør dyrkningsmedierne indeholdende K562-celler i en 15 eller 50 ml rør og pelletere cellerne ved 400 x g i 8 min. Supernatanten fjernes, og re-suspendere cellerne i 5 ml R10 medier og bland godt.
    3. Transfer 20 pi af cellen opløsning i en brønd af en 96-U-brønds plade. Tilsæt 20 pi trypanblåt ogbland godt ved pipettering op og ned i mindst 5 gange. Afpipetteres 10 pi af opløsningen i en celle tællekammer og tælle cellerne.
    4. Pelletere cellerne ved 400 x g i 8 min. Re-suspendere cellerne i R10 medier og justere koncentrationen K562 celle til 0,5-1 x 10 6 celler pr.
    5. Inkubér K562-celler i en cellekultur kolbe ved 37 ° C og 5% CO2 indtil anvendelse.

2. Isolering af NK-celler

  1. Ifølge godkendelse og retningslinier for den lokale etiske komité, indhente skriftligt informeret samtykke fra rask donor eller patient før indsamling af 6-10 ml enten EDTA eller hepariniseret perifert blod.
  2. Opbevar reagenser til NK-celle isolation ved 4 ° C, indtil starten af ​​eksperimentet og derefter bruge dem ved stuetemperatur (RT) under sterile betingelser. Isoler NK-celler fra perifert blod anvendelse af magnetiske mikroperler og en specifik magnet for celleisolering ifølge than producentens anvisninger.
    1. Rekonstituer et hætteglas af lyofiliseret NK-celle negativ isolation antistofcocktail ved pipettering 7,5 ml af den billede buffer A (indbefattet inden for NK-celle isolation kit) i hætteglasset. Bland forsigtigt ved pipettering op og ned 3-4 gange.
      BEMÆRK: Sørg for, at suspensionen er homogen før hver brug.
    2. Forbered den endelige cocktail løsning ved at blande passende mængder af den opløste pellet fra trin 2.2.1 og buffer B (inkluderet i NK-celle isolation kit). For at bestemme disse mængder, definere volumenet af prøven af ​​helblod i ml som volumen = 1,0. Bruge 0,25 volumener af den rekonstituerede pellet (fra trin 2.2.1) og 0,25 volumener puffer B til at behandle 1 volumen helblod.
    3. Overfør blandingen til en passende rør indeholdende prøven af ​​helblod. Må ikke pipette op og ned for at undgå tab af blod i pipetten. I stedet lukke røret og flytte det forsigtigt op og ned, indtil suspennen er homogen. Undlad at slynge.
    4. Yderligere homogenisere prøven under anvendelse af et rør rotator i 5 minutter ved stuetemperatur.
    5. Under sterile forhold, fjerne hætten og læg røret i den magnetiske separator i 15 min, som anbefalet af producenten. Sørg for, at røret etiketterne vender mod bagsiden af ​​magneten for at tillade uforstyrret synlighed skillelinien. Flyt ikke magneten under separation, da denne procedure vil blive forstyrret.
    6. overføre forsigtigt supernatanten til et nyt 15 ml glas og fylde op med komplette medier (CM; hæmatopoietisk celle medier, 1% penicillin / streptomycin, 5% humane sera). Pelletere cellerne ved 400 x g i 8 min.
      1. Valgfrit: Hvis pelleten er rød, genopslæmmes cellerne i 1 ml erythrocyt lyseringsbuffer (f.eks 1 ml ammonium-chlorid-kalium (ACK) lyseringsbuffer: 155 mM NH4CI; 0,1 mM EDTA; 10 mM KHCO3 i 1 L destilleret vand (DW)) og inkuberes i 8 minutter ved stuetemperatur. Alternativt kan du bruge en ERythrocyte depletion kit.
        BEMÆRK: Husk, at brugen af ACK buffer negativt kan påvirke NK cellefunktioner 14.
      2. Hurtigt fortyndes ACK buffer ved tilsætning af mindst 1 ml CM at stoppe lysis og der centrifugeres ved 400 xg i 8 min for at pelletere cellerne.
    7. Re-suspendere cellepelleten i 1 ml CM og fortsætte med at tælle. Overfør 20 pi af NK-celle opløsning på en 96-U-brønds plade. Tilsæt 20 pi methylenblåt til hver brønd og bland godt ved pipettering op og ned i mindst 5 gange. Afpipetteres 10 pi af opløsningen i en celle tællekammer og tælle celler. Alternativt kan du bruge 30 pi af ufortyndet celle suspension til tælling med en kommercielt tilgængelig celletæller.
    8. Justér cellerne til en koncentration på mindst 2 x 10 4 NK celler pr 100 pi CM.
    9. Udfør en overflade antistoffarvning af det isolerede NK-celle population at kontrollere renheden anvendelse af et flowcytometer.
      1. prepare en master mix løsning ved at blande de mængder af de angivne antistoffer som pr tabel 1.
      2. Resuspender cellerne i 88,5 pi vaskebuffer (WB; 0,5% bovint serumalbumin (BSA), 0,1% NaN3 i PBS), og der tilsættes 11,5 pi af master mix opløsning. Inkubér cellerne i 20 minutter ved 4 ° C i mørke.
        Forsigtig: NaN3 er giftigt og mutagen. Håndtere det i overensstemmelse hermed til den tilsvarende sikkerhedsdatablad (MSDS).
      3. Tilsæt 1 ml WB og pelletere cellerne ved 400 xg i 4 min.
      4. Re-suspendere cellerne i 300 pi farvning buffer plus DAPI. Erhverve cellerne under anvendelse et flowcytometer.
        BEMÆRK: Fortsæt videre med forsøget, hvis NK celle renhed er mindst 80% af alle levende lymfocytter.

3. Høst af K562 celler til NK Cell Stimulation

  1. cellekulturen kolbe indeholdende K562-celler (fra trin 1.2) fra th Fjern e inkubator. Resuspender K562 celler i kulturmedier ved forsigtigt at pipettere op og ned.
  2. Overfør hele kulturen medier i en 15 eller 50 ml rør og pelletere cellerne ved 400 x g i 8 min. Supernatanten fjernes, og genopslæmmes cellerne i 5 ml phosphatbufret saltvand (PBS) og bland godt.
  3. Transfer 20 pi af cellen opløsning i en brønd af en 96-U-brønds plade. Tilsæt 20 pi trypanblåt og bland godt ved pipettering op og ned i mindst 5 gange. Afpipetteres 10 pi af opløsningen i en celle tællekammer og tælle cellerne. Alternativt kan 30 pi af ufortyndet cellesuspension at tælle med en kommercielt tilgængelig celletæller.
  4. Pelletere cellerne ved 400 x g i 8 min. Resuspender celler i CM i en koncentration på mindst 2 x 10 4 K562 celler pr 100 pi medier.
    BEMÆRK: Brug samme K562 og NK cellekoncentrationer for at inkubere både ved et effektor: mål (E: T) forhold på 1: 1 senere.
"> 4. Stimulering af NK-celler med Tumor K562 og Cytokiner

  1. Bland forsigtigt cellerne ved pipettering dem op og ned i mindst 5 gange. Fordel 100 pl / brønd af NK-celle-opløsning til de foreskrevne brønde i en 96-V-brønds plade.
    1. Brug mindst to brønde for hver donor, en med og en uden en stimulus (f.eks, K562 tumorceller og cytokiner). Når det er muligt, udføre eksperimentet i det mindste i to eksemplarer og tilføje en positiv kontrol (f.eks phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) og ionomycin, endelig koncentration: 50 nM PMA, 1 pM ionomycin per brønd). Forbered opdateret flowcytometri kompensationer for datoen for eksperimentet.
      BEMÆRK: titreres antistofferne tidligere brug (se diskussionen).
  2. Slukke lyset og tilsæt anti-CD107a antistof (2 pi, slutkoncentration: 1: 100) til hver brønd med NK-celler på 96-V-brønds plade.
  3. Bland forsigtigt K562-celler ved pipettering dem op og ned imindst 5 gange.
    1. Fra brøndene, der indeholder NK celle / anti-CD107a antistof løsning, identificere de planlagte stimulation med K562-celler dem. Der tilsættes 100 pl / brønd af K562 celle opløsning ind i disse brønde. Bland forsigtigt ved pipettering op og ned i mindst 5 gange.
    2. Tilføj interleukin-2 (IL-2; slutkoncentration 100 U / ml) og interleukin-15 (IL-15; slutkoncentration 10 ng / ml) til brøndene indeholdende K562-celler og NK-celle / anti-CD107a antistofopløsning.
      1. Valgfrit: Test virkningen af ​​enten K562-celler eller cytokiner alene på de distribuerede NK-celler til at dechifrere tumorinduceret versus cytokin-induceret NK celle funktioner.
    3. Identificere brøndene på 96-V-brønds plade planlagt som negative kontroller uden stimulus. Der tilsættes 100 pl / brønd CM til disse brønde, der kun indeholder NK-celle / anti-CD107a antistofopløsning. Bland forsigtigt ved pipettering op og ned i mindst 5 gange.
      1. Valgfrit: For en positiv kontrol, tilsættes 100 μL CM indeholdende PMA og ionomycin (slutkoncentration: 50 nM PMA, 1 pM ionomycin per brønd) til en brønd med NK-celle / anti-CD107a antistofopløsning.
  4. Inkubér cellerne i 3 timer i mørke ved 37 ° C og 5% CO2.
  5. Der fremstilles en protein transport inhibitor opløsning (f.eks brefeldin A og / eller monensin) i CM. Efter 1 times inkubering tilsættes opløsningen til hver brønd af 96-V-brønds plade med lyset slukket (slutkoncentration: 0.5-1μM Brefeldin A og 2-3 pM monensin). Bland forsigtigt ved pipettering op og ned i mindst 5 gange. Fortsæt inkubation i de resterende 2 timer.

5. Overflade- og Intracellulær farvning

  1. Efter 3 timer inkubationsperiode, blandes cellerne i brøndene i 96-V-brønds plade omhyggeligt ved pipettering op og ned i mindst 5 gange og overføre dem til flowcytometri rør. Tilsæt 1 ml / rør af WB. Pellet cellerne ved 400 x g i 4 min.
    1. Valgfrit: Inden centrifugering skyl brøndene med 100 pl / brønd PBS, for at optimere cellens nyttiggørelse, ved pipettering op og ned i mindst 5 gange før overførsel af cellerne ind i den respektive FACS rør.
  2. Supernatanten fjernes, og Fortsæt med Surface Farvning.
  3. Omfatter en amin-reaktivt fluorescerende farvestof, som er ikke-permeant at levende celler med en maksimal emission på 423 nm som en fixable dødt cellemarkør (DCM). Udfør farvning før (se nedenfor) eller parallelt med antistoffet overfladefarvning afhængigt af typen af ​​DCM anvendes.
    1. Resuspender celler i 99 pl / rør PBS, og der tilsættes 1 ul / rør i fixable DCM (slutkoncentration: 1: 100). Bland cellerne brønd med en vortex og inkuber dem i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke.
    2. Forbered en master mix opløsning ved blanding af "overflade" antistoffer, der er anført i tabel 2 (se farvning trin kolonne fremhævet med blåt). Brug idicated volumener / rør og multiplicerer dem med antallet af flowcytometri rør, der skal farves.
    3. Efter inkubation tage flowcytometri rør med cellerne, og der tilsættes 1 ml / rør af WB. Pelletere cellerne ved 400 x g i 4 min.
    4. Supernatanten fjernes, re-suspendere cellerne i 84 pl / tube WB og tilsæt 16 ul / rør af master mix løsning. Bland cellerne brønd med en vortex. Cellerne inkuberes i 20 minutter ved 4 ° C i mørke.
    5. Efter 20 min tilsættes 1 ml / rør WB og pellet celler ved 400 xg i 4 min.
  4. Supernatanten fjernes, og re-suspendere cellerne i 100 ul / rør af en kold fiksering løsning (f.eks 2% (endelig) paraformaldehyd eller formaldehyd). Bland cellerne brønd med en vortex. Cellerne inkuberes i 10 minutter ved 4 ° C i mørke.
    1. Farv cellerne for intracellulære cytokiner / kemokiner efter dette trin eller opbevare dem natten over ved 4 ° C i WB.
      BEMÆRK: Efter inkubation natten over, kan der opstå en lavere celle opsving.
  5. Vask cellerne i 1 ml / rør WB ved 400 xg i 4 min og fortsætte med permeabilisering trin.
  6. Forbered en permeabilisering buffer (PB) (f.eks 0,2% saponin, 1% BSA-opløsning i PBS).
  7. Vask cellerne to gange i 1 ml / rør af PB ved 400 xg i 4 min. Fortsæt med den intracellulære farvning.
    Forsigtig: Saponin er potentielt irriterende. Håndtere det i overensstemmelse hermed til den tilsvarende sikkerhedsdatablad (MSDS).
  8. Forbered en master mix løsning ved hjælp af de angivne "intracellulære" antistof mængder i tabel 2 (fremhævet med grønt). Multiplicer disse mængder med antallet af rør, der skal farves.
    1. Resuspender cellerne i 90 pl / rør PB og anvende 10 pl / rør af antistoffet hovedblandingskammeret opløsning. Bland godt under anvendelse af en vortex og inkuber cellerne i 30 minutter ved 4 ° C i mørke.
  9. Vask cellerne to gange i 1 ml / rør af PB ved 400 xg i 4 min.
  10. Supernatanten fjernes, og re-suspendere cellerne i 400 ul / rør PB. Bland cellerne brønd med en vortex. Placere celler på is i mørke indtil måling.

6. flowcytometri Kompensation og Acquisition

  1. Vælg de kanaler, for de forskellige fluorokromer (se tabel 2) inden for flowcytometri erhvervelse software i parameter setup mappen. Derudover vælger kanalerne for FSC-A og -H samt for SSC-A og -H.
  2. Læg en kompensation matrix skabt til de valgte parametre i købet fil.
    1. Opret en kompensation matrix anvendelse af isolerede NK celler fra trin 2.2.8 ved udførelse af en enkelt farve plet for hver brugt fluorochrom (se tabel 2). Brug overfladefarvning protokollen beskrevet i trin 5,1-5,4. Omfatte en ufarvet kontrol (uden antistoffer) samt isotypekontroller og / eller fluorescens minus én kontroller (FMO).
      BEMÆRK: Som et alternativ til celle-baseret kompensation, bruge IgG-bindende perler som kompensation kontroller.
    2. Placer hvert rør for enlige pletten prøver og prøven uden antistoffer i prøven injektion port (SIP). Klik på "record" knappen i flowcytometri erhvervelse software og erhverve en celle nummer på mindst 5 x 10 3 NK celler pr prøve.
    3. Brug beregningen kompensation anvendelsen af ​​cytometri erhvervelse software til at skabe en kompensation matrix.
  3. Opret Dot Grunde til Identifikation af NK Cell Befolkning.
    1. Identificer enkelte celler ved hjælp af FSC-A / FSC-H og SSC-A / SSC-H dot plots. Klik på "polygon gate" knappen. Tegn en gate omkring celler, som har en lineær fordeling mønster i begge dot plots. Dobbeltklik på portene at åbne en ny dot plot.
    2. Vælg en FSC-A / SSC-A dot plot til at identificere lymfocyt/ NK-celle population (se figur 1). Tegn en polygon gate omkring det og dobbeltklik på porten.
  4. Placer hver prøve rør af NK-celle stimulation assay i SIP. Klik på "record" knappen og få en celle nummer på mindst 5 x 10 3 NK celler pr prøve.

7. Analyse og Statistik

  1. Åbn flowcytometrianalyse softwareprogram. Klik på knappen lastning prøve at åbne ustimulerede kontrolprøve.
  2. Opret en gating System for de forskellige NK cellesubpopulationer (se figur 1).
    1. Klik på knappen dot plot til at skabe en FSC-A / SSC-Et plot. Klik på rektangel gate knap og tegne et rektangel gate i alle arrangementer med en FSC-En værdi> 5 x 10 4 at udelukke snavs. Åbn porten ved at dobbeltklikke på porten.
    2. Vælg igen det FSC-A / SSC-A parametre inden den nye dot plot og klik på polygonen gate-knappen. Drå en polygon gate omkring lymfocytpopulationen (se figur 1). Åbne porten.
    3. Vælg SSC-A / SSC-H parameter for den nye dot plot og tegne en polygon gate rundt om alle enkelte celler. Enkelte celler udviser en lineær fordeling på tværs af FSC-A / FSC-H og SSC-A / SSC-H parametre (se figur 1). Åbn porten ved at dobbeltklikke på den.
    4. Gentag trin 7.2.3 ved hjælp af FSC-A / FSC-H parametre denne gang.
    5. Brug parameteren CD45 og Dump kanal (CD3, CD14, CD19, DCM) for at udelukke døde celler. Tegn et rektangel gate omkring alle CD45 positive og Dump kanal negative celler. Åbn porten ved at dobbeltklikke på porten.
    6. Identificer hele NK-celle populationen ved hjælp af CD56 og Dump kanal parametre. Skabe et rektangel gate omkring CD56 positive og Dump kanalisere negative celler. Åbn porten ved at dobbeltklikke på den.
    7. Tegn et rektangel gate omkring alle tre NK celle-undergrupper inden for en CD56 / CD16 dot plot. identify de forskellige undersæt som CD56 ++ CD16 -, CD56 ++ CD16 + og CD56 + CD16 ++ NK-celle delmængder.
  3. Analyser NK celle funktioner for hver enkelt NK Cell Subset.
    1. Klik på et af de tre NK celle undergruppe porte for at åbne det. Opret tre forskellige dot grunde til CD56 / CD107a, CD56 / IFN-γ og CD56 / MIP-1β.
    2. Tegn et rektangel gate for CD56-positive celler, som er positive såvel for CD107a, IFN-γ eller MIP-1β henholdsvis (se figur 1).
    3. Gentag trin 7.3.1-7.3.2 for hvert resterende NK celle delmængde.
  4. Gentag trin 7.2 og 7.3 for alle stimulerede prøver. Gem alle statistiske værdi af hver enkelt prøve ved at klikke på statistik-eksport knap inden for analyse software.
  5. Åbn filer, der indeholder den statistiske værdi af de enkelte prøver at analysere NK celle funktioner. Vælg værdierne for enkelte NK-celledelmængder (f.eks CD56 ++ CD16 - NK-celler) ved at kopiere dem i en anden fil.
    1. Fratræk den procentdel af CD107a positive NK-celler, som ikke er blevet behandlet med en stimulus, fra den procentdel af CD107a positive NK-celler, som er blevet behandlet med en stimulus.
      BEMÆRK: Brug resultat at demonstrere degranulering kapacitet af denne særlige NK-celle delmængde som reaktion på stimulus.
    2. Gentag trin 7.5.1 for IFN-γ og MIP-1SS-positive NK-celler til at påvise cytokin og chemokin produktion som reaktion på stimulus.
    3. Gentag trin 7.5.1-7.5.2 for hvert resterende NK celle delmængde at evaluere deres degranulering kapacitet og cytokin / chemokin produktion ved stimulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gating strategi til analyse af degranulering, cytokin og chemokin fremstillingen af hele NK-celle population og tre forskellige NK-celle delmængder er illustreret i figur 1.

Repræsentative resultater af en rask donor er illustreret i figur 2. NK-celler uden stimulus produceret hverken IFN-γ eller MIP-1β og udtrykte ikke CD107a på deres overflade (figur 2A). I modsætning hertil NK-celler stimuleret med tumorceller og cytokiner produceret signifikante mængder af intracellulær IFN-γ og MIP-1β. Endvidere over 20% af dem degranulerede ved tumorcelle interaktion indikeret ved at udtrykke CD107a på deres overflade (figur 2C). PMA og lonomycin stimulering blev anvendt som en kontrol (figur 2B).

e 1 "src =" / files / ftp_upload / 54615 / 54615fig1.jpg "/>
Figur 1:. Gating strategi Efterfølgende porte er plottet. Først vragrester udelukkes i en FSC-A / SSC-Et plot. Derefter lymfocytter identificeres og dubletter er udelukket under anvendelse af to grunde med SSC-A / SSC-H og FSC-A / FSC-H. Derefter er en låge herunder alle CD45 + celler og udelukke alle døde, CD3 +, CD14 + og CD19 + celler sat ved at plotte CD45 / Dump kanal. Dernæst NK-celler identificeres ved gating på CD56 + celler. Et plot med CD56 / CD16 kan bruges til at identificere de vigtigste NK celle delmængder. Endelig i hele NK-celle populationen, er funktionelle markører identificeret ved afbildning CD56 versus CD107a, IFN-γ og MIP-1β, hhv. Dette kan gøres så godt for alle de forskellige former for NK celle delmængder. Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 2:. Repræsentative resultater fra en rask NK-celle donor Brug af gating-strategi beskrevet i figur 1, NK-celle funktionelle markører som CD107a (for degranulering), IFN-γ og MIP-1β kan identificeres. Den venstre kolonne (A) viser resultaterne under anvendelse af NK-celler i fravær af en stimulus. Den midterste kolonne (B) viser resultaterne i nærværelse af den positive kontrol PMA / ionomycin. Den højre kolonne (C) præsenterer resultater for NK-celler stimuleret med tumoren K562 og i nærværelse af cytokinerne IL 2 (100 U / ml) og IL-15 (10 ng / ml). Klik her for at se en større version af denne figur.

"Tabel Tabel 1: Antistoffer til check-renhed.

tabel 2
Tabel 2: Antistoffer til ekstra- og intracellulær farvning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den beskrevne fremgangsmåde er en let, hurtig og pålidelig metode til at studere NK celle funktioner fra prøver af fuldblod fra raske donorer eller patienter. Denne fremgangsmåde giver den store fordel at direkte oprense NK-celler fra fuldblod, undgå tidskrævende densitetsgradientcentrifugering, som er obligatorisk for mange andre oprensningsmetoder 15. Desuden kræver det en mindre stikprøve i forhold til "klassiske" NK-celle isolation / berigelse metoder, hvilket gør det til et egnet alternativ til prøver af pædiatriske og / eller immun-mangel patienter. Denne protokol kan anvendes til at opnå basale værdier af NK cellefunktioner ex vivo, men det giver også mulighed for yderligere NK kultur og ekspansion, bliver på denne måde supplerer andre fremgangsmåder tidligere beskrevet 8. Ikke desto mindre nogle kritiske skridt der skal tages i betragtning. Da assay er baseret på ekstra- og intracellulær antistoffarvning, er det afgørende at bestemme den optimale working koncentration for hvert antistof først. Især for den intracellulære farvning, er en nøje vurdering af de anvendte antistoffer stærkt anbefales. En god metode er at teste en fortyndingsrække af det anvendte antistof (fx 1: 100 til 1: 12,5) i en cellesuspension stimuleret med eller uden PMA / ionomycin. Efterfølgende forholdet mellem positive begivenheder mellem stimulerede og ustimulerede prøver beregnes og plottes. Antistoffet fortynding med den højeste positive fold-change-forhold (bedste signal-til-baggrund-forhold) bør anvendes til yderligere eksperimenter 16. Endvidere kan brugen af ​​kontroller som isotype- og FMO kontroller vise sig at være afgørende især til intracellulær farvning for at gate korrekt på de positive cellepopulationer.

Der er imidlertid store begrænsninger af den beskrevne fremgangsmåde. CD107a udtryk er en degranulering markør og derfor kun indirekte indikerer NK-cellers cytotoksicitet. NK-cellers cytotoksicitet and degranulering kapacitet kan være anderledes. Opregulering af autofagi pathway i tumorceller resulterer i nedbrydningen af secerneret granzym B og reducerer celledød ved NK-celle interaktion 17. Derfor en yderligere DCM (f.eks spaltet caspase 3) kan tilføjes til farvning panel for at overvåge celledød begivenheder inden målcellerne 18. Derudover er NK-cellers cytotoksicitet påvirket af størrelsen af cytotoksiske proteiner i deres granuler (f.eks perforin, granzym B), der kan kvantificeres ved en intracellulær farvning 19,20.

Desuden er der forskellige muligheder for at ændre protokollen. I stedet for isolerede NK celler, kan mononukleære celler fra perifert blod (PBMC'er) anvendes. Selvom man skal være opmærksom på, at det absolutte NK celle nummer i PBMC populationen varierer mellem forskellige donorer og selv mellem prøver, der stammer fra den samme donor på forskellige tidspunkter. NK-celle degranulation er stærkt afhængig af E: T-forhold. For at kunne sammenligne NK celle funktioner mellem forskellige donorer eller på forskellige tidspunkter, bør den absolutte NK celleantal i PBMC populationen bruges til at etablere en konstant E: T-forhold i alle eksperimenter. Hvis overvåges NK cellefunktioner på forskellige tidspunkter inden for den samme donor, kan PBMC'er fryses og analysen kan udføres på én gang for alle de forskellige tidspunkter for at reducere inter-eksperimentelle variationer 11.

Siden farvning paneler med op til 18 farver er mulige, kan analyse af NK cellefunktioner udvides til en langt mere detaljeret. Brug yderligere overflademarkører herunder CD57, NKG2A og killer celle immunglobulin-lignende receptorer (KIR'er), kan yderligere NK celle delmængder identificeres. Uddannede NK-celler udtrykker mindst en selvstændig KIR degranulere stærkere ved interaktion med K562 celler end uuddannede NK-celler. I modsætning hertil mere differentieret CD57 + CD56 + - CD56 + NK celler 21. Derudover kan andre markører af NK celle funktion tages op. LFA-1 er et vigtigt molekyle for NK-celle adhæsion og udtrykkes i dens åbne konformation ved NK-celleaktivering. Denne såkaldte "inside-out signal" er en tidlig NK-celle-aktivering markør 22.

Endelig kan stimuli til test NK cellefunktioner modificeres også. Det er vores erfaring frisk isolerede NK-celler kun degranulerer dårligt på K562 celle interaktion, hvis der tilsættes ingen cytokiner. Brug frisk isolerede PBMC'er uden yderligere cytokin tilføjelse omgå dette problem, på grund af påvirkning af tilskuer celler. Desuden cytokinproduktion, især IFN-γ og TNF-α, kan indledes på grundlag IL-12 og IL-18-stimulering 23. IFN-γ produktion inden for NK celle delmængder kan variere depending af den anvendte stimulus (cytokin- versus target-induceret stimulering) 24. Derudover, i stedet for at bruge K562-celler som målceller, primære tumorceller afledt af tumor patienter kunne anvendes for at teste NK celle funktioner mod autologe tumorceller før eller under immunmodulerende behandlinger (f.eks, behandling med monoklonalt antistof eller immuno-modulerende lægemidler (IMiDs)).

Inden for de seneste par år, har inden for immunterapi hurtigt blevet udvikler sig med den kliniske godkendelse af immun checkpoint hæmmere (f.eks ipilumumab, nivolumumab, pembrolizumab) 25 og vellykkede forsøg med genetisk modificerede kimære antigen receptor (CAR) udtrykkende T-celler samt som CAR-NK-celler (gennemgået i henvisning 26), til behandling af hæmatologiske tumor patienter 27. Derfor NK-celle-baserede immunterapi bliver stadig mere i fokus. Anti-CD20 antistoffer har været en stor succes i treatment af maligne lymfomer inden for de sidste to årtier 28. Langt størstedelen af ​​NK celler udtrykker lav affinitet Fc-receptor CD16 muliggør cellerne til at genkende og dræbe antistof-mærkede målceller (antistof-afhængig cellulær cytotoksicitet - ADCC). Antistoffets evne til at udløse NK cellefunktioner kan testes in vitro under anvendelse af beskrevne protokol 29. Terszowski et al. Analyserede NK-celler 'ADCC mod et B lymfoblastoidcellelinje anvendelse af forskellige klinisk godkendte anti-CD20 antistoffer. Mens ADCC induceret ved rituximab behandling (første klinisk godkendte anti-CD20-antistof 30) blev negativt påvirket af KIR / HLA interaktion, blev denne effekt ikke observeret, når anvendelse af obinutuzumab (en roman glycomanipuleret type II CD20 monoklonalt antistof) 31, 32. Desuden er NK cellefunktioner påvirket af forskellige hidtil ukendte antitumorlægemidler såsom imid lenalidomid 33 og forskellige tyrosin-Kinase-hæmmere (TKI) 34. Øjeblikket NK cellespecifikke checkpoint inhibitorer er afprøvet i kliniske forsøg. Eksempler er anvendelsen af anti-KIR 35,36 eller anti-NKG2A antistoffer (NCT02331875) samt aktiverende agonister som et anti-CD137-antistof (NCT01775631; NCT02110082).

Vigtigere, har adoptiv NK-celle overdragelse udført i en række forskellige maligne sygdomme med lovende kliniske virkninger 37. Med det formål at vælge den bedste donor, kan NK cellefunktioner mod patientens tumor testes in vitro ved anvendelse blodprøver fra potentielle NK-celle donorer.

Sammenfattende er den beskrevne protokol designet til at analysere forskellige NK cellefunktioner fra raske donorer eller patienter. Disse funktioner kan overvåges i forskellige NK celle-undergrupper upon forskellige stimuli på udvalgte tidspunkter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 + glutamine Invitrogen 6187-044
penicilin/streptomycin Invitrogen 15140-122
BD Falcon Round Bottom Tube BD 352008
fetal calf serum Invitrogen 10270-106 heat inactivated before use
T-flask Greiner Bio-One 690195
K562 tumor cell line DSMZ GmbH ACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer made in house / components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1,000 ml Plastipur Fresenius Kabi 1088813
Megafuge 40R Centrifuge Heraeus /
EDTA blood collector tubes Sarstedt 386453 S-Monovette 7.5 ml, K3EDTA
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Hematopoietic media (XVIVO) Lonza Group Ltd BE04-743Q
human serum DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M  / healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright line Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. 0640030/ 1110000
trypan blue solution (0.4%) Invitrogen 15250-061
3% acetic acid with methylene blue Stemcell Technologies  07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates Corning  3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates Corning  351177
DPBS (Ca2+- and Mg2+-free) Gibco Invitrogen 14190-169
BSA Sigma Aldrich A2153-100G
NaN3 Sigma Aldrich 08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Merck 524400-1MG
ionomycin  PromoKine PK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15) PeproTech 200-15
Proleukin S (IL-2)  Novartis Pharma 730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD Biosciences 554724 This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) BD Biosciences 555029
paraformaldehyde AppliChem UN2209
saponin Sigma Aldrich 47036
flow cytometer: Canto10C BD Biosciences /
FlowJo TreeStar Inc. /
Graph Pad Graph Pad Inc. /
MACSxpress Separator Miltenyi Biotec  130-098-308
MACSxpress NK isolation kit Miltenyi Biotec  130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human Miltenyi Biotec  130-098-196
MACSmix Tube Rotator  Miltenyi Biotec  130-090-753
anti-human CD3 APC Biolegend 300412
anti-human CD3 V450 BD Biosciences 560366
anti-human CD14 PerCP Miltenyi Biotec  130-094-969
anti-human CD14 V450 BD Biosciences 560349
anti-human CD16 PE Biolegend 302008
anti-human CD16 PerCP Biolegend 302029
anti-human CD19 PE-Cy7 Biolegend 302216
anti-human CD19 V450 BD Biosciences 560353
anti-human CD45 BV510 BD Biosciences 563204
anti-human CD56 FITC Biolegend 345811
anti-human CD107a PE Biolegend 328608
anti-human IFN-γ AF-647 BD Biosciences 557729
anti-human MIP-1β APC-H7 BD Biosciences 561280
DAPI Biolegend 422801
Zombie Violet Fixable Viability Kit Biolegend 423113 fixable dead cell marker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Watzl, C. How to trigger a killer: modulation of natural killer cell reactivity on many levels. Adv Immunol. 124, 137-170 (2014).
  2. Khaznadar, Z., et al. Defective NK Cells in Acute Myeloid Leukemia Patients at Diagnosis Are Associated with Blast Transcriptional Signatures of Immune Evasion. J Immunol. 195 (6), 2580-2590 (2015).
  3. Pical-Izard, C., et al. Reconstitution of natural killer cells in HLA-matched HSCT after reduced-intensity conditioning: impact on clinical outcome. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (3), 429-439 (2015).
  4. Ahlenstiel, G., et al. Early changes in natural killer cell function indicate virologic response to interferon therapy for hepatitis C. Gastroenterology. 141 (4), 1231-1239 (2011).
  5. Porrata, L. F., et al. Early lymphocyte recovery predicts superior survival after autologous stem cell transplantation in non-Hodgkin lymphoma: a prospective study. Biol Blood Marrow Transplant. 14 (7), 807-816 (2008).
  6. Silva, I. P., et al. Reversal of NK-cell exhaustion in advanced melanoma by Tim-3 blockade. Cancer Immunol Res. 2 (5), 410-422 (2014).
  7. Kiessling, R., Klein, E., Wigzell, H. "Natural" killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur J Immunol. 5 (2), 112-117 (1975).
  8. Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. J Vis Exp. (48), (2011).
  9. Mariani, E., et al. Chemokine production by natural killer cells from nonagenarians. Eur J Immunol. 32 (6), 1524-1529 (2002).
  10. Reefman, E., et al. Cytokine secretion is distinct from secretion of cytotoxic granules in NK cells. J Immunol. 184 (9), 4852-4862 (2010).
  11. Jacobs, B., et al. NK Cell Subgroups, Phenotype, and Functions After Autologous Stem Cell Transplantation. Front. Immunol. 6, 583 (2015).
  12. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  13. Theorell, J., et al. Sensitive and viable quantification of inside-out signals for LFA-1 activation in human cytotoxic lymphocytes by flow cytometry. J Immunol Methods. 366 (1-2), 106-118 (2011).
  14. Brander, C., et al. Inhibition of human NK cell-mediated cytotoxicity by exposure to ammonium chloride. J Immunol Methods. 252 (1-2), 1-14 (2001).
  15. Beeton, C., Chandy, K. G. Enrichment of NK cells from human blood with the RosetteSep kit from StemCell technologies. J Vis Exp. (8), e326 (2007).
  16. Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1 (3), 1507-1516 (2006).
  17. Baginska, J., et al. Granzyme B degradation by autophagy decreases tumor cell susceptibility to natural killer-mediated lysis under hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17450-17455 (2013).
  18. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  19. Sutton, V. R., et al. Serglycin determines secretory granule repertoire and regulates NK cell and CTL cytotoxicity. FEBS J. 283 (5), 947-961 (2016).
  20. Schönberg, K., Hejazi, M., Uhrberg, M. Protocol for the clonal analysis of NK cell effector functions by multi-parameter flow cytometry. Methods Mol Biol. 903, 381-392 (2012).
  21. Björkström, N. K., et al. Expression patterns of NKG2A, KIR, and CD57 define a process of CD56dim NK-cell differentiation uncoupled from NK-cell education. Blood. 116 (19), 3853-3864 (2010).
  22. Bryceson, Y. T., Ljunggren, H. G., Long, E. O. Minimal requirement for induction of natural cytotoxicity and intersection of activation signals by inhibitory receptors. Blood. 114 (13), 2657-2666 (2009).
  23. Cooper, M. A., et al. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset. Blood. 97 (10), 3146-3151 (2001).
  24. Fauriat, C., Long, E. O., Ljunggren, H. G., Bryceson, Y. T. Regulation of human NK-cell cytokine and chemokine production by target cell recognition. Blood. 115 (11), 2167-2176 (2010).
  25. Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. J Clin Oncol. 33 (17), 1974-1982 (2015).
  26. Glienke, W., et al. Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells. Front Pharmacol. 6, 21 (2015).
  27. Curran, K. J., Brentjens, R. J. Chimeric antigen receptor T cells for cancer immunotherapy. J Clin Oncol. 33 (15), 1703-1706 (2015).
  28. Zappasodi, R., de Braud, F., Di Nicola, M. Lymphoma Immunotherapy: Current Status. Front. Immunol. 6, 448 (2015).
  29. Laprevotte, E., et al. Endogenous IL-8 acts as a CD16 co-activator for natural killer-mediated anti-CD20 B cell depletion in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Res. 37 (4), 440-446 (2013).
  30. Maloney, D. G., et al. IDEC-C2B8 (Rituximab) anti-CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade non-Hodgkin's lymphoma. Blood. 90 (6), 2188-2195 (1997).
  31. Salles, G., et al. Phase 1 study results of the type II glycoengineered humanized anti-CD20 monoclonal antibody obinutuzumab (GA101) in B-cell lymphoma patients. Blood. 119 (22), 5126-5132 (2012).
  32. Terszowski, G., Klein, C., Stern, M. KIR/HLA interactions negatively affect rituximab- but not GA101 (obinutuzumab)-induced antibody-dependent cellular cytotoxicity. J Immunol. 192 (12), 5618-5624 (2014).
  33. Hsu, A. K., et al. The immunostimulatory effect of lenalidomide on NK-cell function is profoundly inhibited by concurrent dexamethasone therapy. Blood. 117 (5), 1605-1613 (2011).
  34. Salih, J., et al. The BCR/ABL-inhibitors imatinib, nilotinib and dasatinib differentially affect NK cell reactivity. Int J Cancer. 127 (9), 2119-2128 (2010).
  35. Benson, D. M., et al. A phase 1 trial of the anti-KIR antibody IPH2101 in patients with relapsed/refractory multiple myeloma. Blood. 120 (22), 4324-4333 (2012).
  36. Vey, N., et al. A phase 1 trial of the anti-inhibitory KIR mAb IPH2101 for AML in complete remission. Blood. 120 (22), 4317-4323 (2012).
  37. Terme, M., Ullrich, E., Delahaye, N. F., Chaput, N., Zitvogel, L. Natural killer cell-directed therapies: moving from unexpected results to successful strategies. Nat Immunol. 9 (5), 486-494 (2008).

Tags

Immunologi NK-celler CD107a cytotoksicitet funktion IFN-y MIP-1p K562-celler
Flowcytometri-baserede assay for Overvågning af NK cellefunktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, … More

Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J. Vis. Exp. (116), e54615, doi:10.3791/54615 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter