Summary
簡単かつ信頼性のある方法は、異なるNK細胞サブセット内の脱顆粒、サイトカインおよびケモカインの産生などNK細胞機能のセットを分析するために、ここで説明されています。
Introduction
先天性免疫系ナチュラルキラー（NK）の一部として、細胞はウイルス感染や悪性形質転換した細胞に対する防御の第一線に寄与する。抑制と活性化受容体のシステムは、T細胞とは対照的に、前の抗原プライミングすることなく、健康で形質転換された細胞を区別できるようにします。標的細胞に遭遇すると、NK細胞は、それらの標的を殺すために免疫シナプスに自分の細胞傷害性顆粒（ 例えば、パーフォリン、グランザイム）の内容物を放出します。また、NK細胞が生産し、異なるサイトカインの種類（ 例えば、インターフェロンγ：;：TNF-α、IFN-γ、腫瘍壊死因子α）を分泌：標的細胞上に及びケモカイン（MIP-1β 例えば、マクロファージ炎症性タンパク質1βを）相互作用またはサイトカイン刺激1。
このような細胞毒性、ケモカインおよびサイトカイン産生として十分なNK細胞の機能は、多様なDISの運命に重要な影響を持っています容易になります。それらは減少IFN-γ産生およびNK細胞受容体2の活性化の低下した発現からなる診断で不良NK細胞プロフィールを示す場合、白血病患者は、再発率の増加を示します。標的細胞の相互作用の際にサイトカイン産生などNK細胞の数および機能の早期回復は、同種幹細胞移植3を受けている患者において減少再発および生存率の改善率と関連しています。また、C型肝炎ウイルスに感染した患者におけるインターフェロン療法の開始時に、末梢NK細胞の脱顆粒の容量は、非応答者4よりも早い応答における強いです。リンパ腫または多発性骨髄腫を患っている患者における自家幹細胞移植（autoSCT）後15日目のNK細胞数（> 80 /μl）を改善された無増悪および全生存5を予測しています。メラノーマ患者におけるT細胞免疫グロブリンの発現およびムチンドメインcontaininG分子3（TIM-3）、NK細胞上の免疫調節タンパク質は、病期および予後6と相関します。
科学者たちは、過去数十年間を通じてNK細胞の機能を監視しています。事前のプライミングなしの腫瘍細胞に対するNK細胞の細胞毒性の最初の分析は、51 Cr放出アッセイ7を使用して対処しました。より最近では、科学者は、拡張NK細胞8の細胞毒性を評価するために、非放射性の方法を開発しました。サイトカインおよびケモカイン産生は、しばしば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）技術9,10を用いて評価されています。過去数十年の間、これらの方法は、フローサイトメトリーに基づくアッセイによって補完されています。従来の表面染色プロトコルとの組み合わせでタンパク質輸送阻害剤（ 例えば、ブレフェルジンAおよびモネンシン）と細胞透過法の使用は、異なる特定のリンパにおけるケモカインおよびサイトカイン産生を研究する科学者を有効にしていますocyteサブセット（ 例えば 、T、BまたはNK細胞）11。また、別のフローサイトメトリーベースのアッセイは、T及びNK細胞の細胞毒性をモニターするために開発されてきました。 2004年アルターらは 、細胞傷害性顆粒12の脱顆粒のマーカーとして標的細胞の遭遇時にNK細胞のリソソーム関連タンパク質のCD107a（LAMP1）の表面発現を記載しました。異なる蛍光色素及びマルチチャネルフローサイトメーターの広い範囲は、私たちの日に利用可能であるので、同時に異なるNK細胞サブセットに多様なNK細胞機能（細胞毒性、サイトカインおよびケモカイン産生）を監視することが可能となりました。これは、生検または白血球減少症を患っている患者の血液サンプル中、 例えば、サンプルサイズが制限される状況において特に重要となります。
グローバルNK細胞の機能をテストするために、別のフローサイトメトリーに基づくアッセイを効率的に組み合わせることができます。テオレルらは HEAからNK細胞を刺激し腫瘍細胞株K562とlthyドナーと13、フローサイトメトリーを介して、NK細胞の脱顆粒、インサイドアウト信号およびケモカイン産生を分析しました。最近autoSCT中の腫瘍患者におけるNK細胞のサブグループ、表現型および機能はフローサイトメトリーに基づくアッセイを流す用いて分析しました。これは、NK細胞はautoSCT 11後の非常に早い時点での腫瘍細胞の認識の際に、サイトカイン/ケモカインの脱顆粒及び生成することができたことが示されました。
ここでプロトコルが同時に異なるサブセット内のNK細胞の機能を監視することを可能にするフローサイトメトリーに基づくアッセイを使用して脱顆粒の容量、ケモカインおよびサイトカイン産生を含む、腫瘍細胞との相互作用にNK細胞の機能を評価するために記載されています。
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Protocol
この研究は、フランクフルト大学の地域倫理委員会の勧告に準じて行きました。
K562細胞の1培養
- R10培地で培養K562細胞を37℃および5％CO 2で細胞培養フラスコ中で1ml当たり0.5×10 6細胞の密度で（グルタミン培地、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、10％ウシ胎児血清を有するRPMI1640） 2。
- 収穫K562細胞の新しい実験の開始前に24時間。
- インキュベーターからK562細胞を含む細胞培養フラスコを取り外します。優しく上下にピペッティングによって培養培地内のK562細胞を再懸濁します。
- 15または50 mlチューブにK562細胞を含む培地に移し、8分間、400×gで細胞をペレット。上清を捨て、5ミリリットルR10培地で細胞を再懸濁し、よく混ぜます。
- トランスファー96-Uウェルプレートのウェルに細胞溶液を20μl。 20μlのにトリパンブルーを追加し、少なくとも5回ピペッティングによりよく混ぜます。ピペット細胞計数室への溶液の10μlの細胞をカウントします。
- 8分間400×gで細胞をペレット化。 R10培地中で細胞を再懸濁し、1mlあたり0.5〜1×10 6個の細胞にK562細胞の濃度を調整します。
- 使用するまで37℃で細胞培養フラスコ中のK562細胞をインキュベートし、5％CO 2。
NK細胞の単離2
- 地元の倫理委員会の承認及びガイドラインによると、EDTAまたはヘパリン処理末梢血のいずれか6-10 mlに収集する前に、健康なドナーや患者の書面によるインフォームドコンセントを得ます。
- その後、店舗実験の開始まで4℃でNK細胞単離のための試薬とは、無菌条件下で室温（RT）でそれらを使用します。磁性マイクロビーズおよびTに記載の細胞分離のための具体的な磁石を用いて末梢血からNK細胞を単離します製造者の指示彼。
- バイアルに（NK細胞単離キット内に含まれる）設けられたバッファAの7.5ミリリットルをピペットで凍結乾燥されたNK細胞の負分離抗体カクテルの1バイアルを再構成。ダウン3-4回ピペッティングにより穏やかに混合。
注：懸濁液は、各使用前に均一であることを、確認してください。 - ステップ2.2.1および（NK細胞単離キットの中に含まれる）のバッファBから再構成されたペレットの適切な量を混合することによって、最終的なカクテル溶液を準備します。これらのボリュームを決定するために、ボリューム= 1.0としてミリリットル中の全血試料の量を定義します。全血の1ボリュームを処理するために、バッファBの0.25体積（ステップ2.2.1から）再構成されたペレットの0.25ボリュームを使用してください。
- 全血試料を含む適切なチューブに混合物を転送します。ピペット内の血液の損失を回避するために、上下にピペットとしないでください。代わりに、チューブを閉じて、suspenまで慎重上下に移動シオンは均質です。ボルテックスしないでください。
- さらに室温で5分間チューブローテーターを用いてサンプルを均質化。
- 無菌条件下で、キャップを外し、製造業者によって推奨されているように15分間の磁気分離器にチューブを配置します。チューブのラベルは分離線の邪魔されずに視認性を可能にするために、磁石の裏側に面していることを確認します。この手順は邪魔されるように、分離中に磁石を動かさないでください。
- 慎重に新しい15ミリリットルチューブに上清を移し、完全培地（CM;造血細胞培地、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、5％ヒト血清）で埋めます。 8分間400×gで細胞をペレット化。
- オプション：ペレットが赤の場合、赤血球溶解バッファー（1ミリリットル中に細胞を再懸濁例えば 、1塩化アンモニウムカリウム（ACK）溶解バッファーのミリリットル：155 mMのNH 4 Clであり; 0.1mMのEDTA、10mMのKHCO 3 1 Lの蒸留水（DW））で、室温で8分間インキュベートします。また、ERを使用ythrocyte枯渇キット。
注：ACKバッファーの使用は負NK細胞機能14に影響を与える可能性があることを、覚えておいてください。 - 急速に細胞をペレットに8分間400×gで溶解し、遠心分離器を停止するには、CMの少なくとも1ミリリットルを追加することにより、ACKバッファーを希釈します。
- オプション：ペレットが赤の場合、赤血球溶解バッファー（1ミリリットル中に細胞を再懸濁例えば 、1塩化アンモニウムカリウム（ACK）溶解バッファーのミリリットル：155 mMのNH 4 Clであり; 0.1mMのEDTA、10mMのKHCO 3 1 Lの蒸留水（DW））で、室温で8分間インキュベートします。また、ERを使用ythrocyte枯渇キット。
- 1ミリリットルのCMで細胞ペレットを再懸濁し、カウントを続行します。 96-Uウェルプレート上にNK細胞溶液20μlを移します。各ウェルにメチレンブルーの20μlを添加して、少なくとも5回ピペッティングによりよく混ぜます。ピペット細胞計数室への溶液の10μlの細胞をカウントします。また、市販の細胞カウンターでカウントするために希釈されていない細胞懸濁液30μLを使用しています。
- 100μlのCMあたり少なくとも2×10 4 NK細胞の濃度に細胞を調整します。
- フローサイトメーターを使用して純度を確認するために、単離されたNK細胞集団の表面抗体染色を行います。
- 広報表1の通り示した抗体のボリュームを混合することによって、マスターミックス溶液をepare。
- 再懸濁88.5μlの洗浄緩衝液（WB; 0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）、PBS中0.1％のNaN 3）中の細胞を、マスターミックス溶液の11.5μlを添加します。暗所で4℃で20分間、細胞をインキュベートします。
注意：NaNの3は毒性と変異原です。対応する製品安全データシート（MSDS）に応じて、それを処理します。 - WBの1ミリリットルを加え、4分間400×gで細胞をペレット化。
- 再懸濁300μlの染色緩衝液+ DAPIで細胞を。フローサイトメーターを用いて細胞を取得します。
注：NK細胞の純度は、全ての生きているリンパ球の少なくとも80％である場合にのみ、実験をさらに進めます。
- バイアルに（NK細胞単離キット内に含まれる）設けられたバッファAの7.5ミリリットルをピペットで凍結乾燥されたNK細胞の負分離抗体カクテルの1バイアルを再構成。ダウン3-4回ピペッティングにより穏やかに混合。
NK細胞刺激のためのK562細胞の3収穫
- 目から（ステップ1.2）K562細胞を含む細胞培養フラスコを削除電子インキュベーター。優しく上下にピペッティングによって培養培地内のK562細胞を再懸濁します。
- 15または50ミリリットルチューブに全培地を移し、8分間400×gで細胞をペレット化。上清を捨て、5ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を再懸濁し、よく混ぜます。
- トランスファー96-Uウェルプレートのウェルに細胞溶液を20μl。トリパンブルー20μlを添加して、少なくとも5回ピペッティングによりよく混ぜます。ピペット細胞計数室への溶液の10μlの細胞をカウントします。あるいは、市販の細胞カウンターでカウントするように希釈されていない細胞懸濁液30μLを使用しています。
- 8分間400×gで細胞をペレット化。 100μlの培地あたり少なくとも2×10 4 K562細胞の濃度でCM中で細胞を再懸濁します。
注：後に1：対象：1の（E：T）比エフェクターで両方をインキュベートするために、同じK562およびNK細胞濃度を使用してください。
- 静かに少なくとも5回上下にピペッティングにより細胞を混ぜます。 96-Vウェルプレートの必要なウェルに、NK細胞溶液の100μl/ウェルを配布します。
- 刺激（ 例えば 、K562腫瘍細胞およびサイトカイン）することなく、各ドナーのためにと1と1を少なくとも2つのウェルを使用してください。可能な限り、少なくとも二重に実験を行い、陽性対照（ 例えば、ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）およびイオノマイシン;最終濃度：50 nMのPMA、ウェルあたりイオノマイシン1μM）を追加します。実験の日のための補償サイトメトリー更新の流れを準備します。
注：（議論を参照）抗体を、使用前に滴定します。
- 刺激（ 例えば 、K562腫瘍細胞およびサイトカイン）することなく、各ドナーのためにと1と1を少なくとも2つのウェルを使用してください。可能な限り、少なくとも二重に実験を行い、陽性対照（ 例えば、ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）およびイオノマイシン;最終濃度：50 nMのPMA、ウェルあたりイオノマイシン1μM）を追加します。実験の日のための補償サイトメトリー更新の流れを準備します。
- ライトのスイッチを切り、抗CD107aの抗体（2μlを、最終濃度が100：1）を追加し、96 VウェルプレートにNK細胞が各ウェルに。
- 静かにするためにそれらをピペットでダウンK562細胞を混ぜます少なくとも5倍。
- NK細胞/抗CD107aの抗体溶液を含有するウェルから、K562細胞による刺激のために計画されたものを特定します。これらのウェルにK562細胞溶液の100μl/ウェルを追加します。少なくとも5回ピペッティングにより慎重に混ぜます。
- K562細胞およびNK細胞/抗CD107aの抗体溶液を含有するウェルに、およびインターロイキン15（最終濃度10ng / mLのIL-15）、インターロイキン2（最終濃度100 U / mlのIL-2）を加えます。
- オプション：腫瘍誘発性サイトカイン誘導性NK細胞の機能対を解読するために、分散NK細胞上のみでK562細胞やサイトカインのいずれかの影響をテストします。
- 刺激することなく、陰性対照として計画された96-Vウェルプレート上のウェルを特定します。唯一のNK細胞/抗CD107aの抗体溶液を含むこれらのウェルに100μl/ウェルのCMを追加します。少なくとも5回ピペッティングにより慎重に混ぜます。
- オプション：陽性コントロールのために、100μを追加; PMAおよびイオノマイシン（最終濃度：50 nMのPMA、ウェルあたりイオノマイシン1μM）を含むリットルのCM NK細胞/抗CD107aの抗体溶液でウェルに。
- 37℃の暗所で3時間、5％CO 2のために細胞をインキュベートします。
- タンパク質輸送の阻害剤溶液を調製し（ 例えば、A及び/又はモネンシンをブレフェルジンA）CMに。インキュベーションの1時間後に、光96-Vウェルプレートの各ウェルに溶液を添加することオフ（最終濃度：0.5-1μMブレフェルジンA 2-3μMのモネンシン）。少なくとも5回ピペッティングにより慎重に混ぜます。残りの2時間インキュベーションを続けます。
5.表面や細胞内染色
- 3時間のインキュベーション期間の後、少なくとも5回ピペッティングすることによって、およびダウン慎重に96-Vウェルプレートのウェル内の細胞を混合し、チューブ、フローサイトメトリーにそれらを転送します。 1ミリリットル/ WBのチューブを追加します。 4分間400×gで細胞をペレット化。
- オプション：遠心分離は、各FACSチューブに細胞を移す前に、少なくとも5回、上下にピペッティングにより、細胞の回収を最適化するために、100μl/ウェルのPBSでウェルを洗浄する前に。
- 上清を捨て、表面染色を続行します。
- 固定可能な死細胞マーカー（DCM）として423 nmでの発光最大値を用いて細胞を生きるために非浸透性であるアミン反応性蛍光色素が含まれます。前に（下記参照）、または使用DCMの種類に応じて、抗体の表面染色と平行に染色を行います。
- 99μlの/チューブのPBSで細胞を懸濁REと1μlの/固定可能なDCM（最終濃度：1：100）のチューブを追加します。よくボルテックスを用いて細胞を混合し、暗所で室温、15分間、それらをインキュベートします。
- 表2に記載されている「表面」抗体を一緒に混合することにより、マスターミックス溶液を調製し（染色ステップの列を参照してください青で強調表示）。でを使用してくださいボリューム/チューブdicatedし、染色するフローサイトメトリー管の数とそれらを掛けます。
- インキュベーション後、細胞の入ったチューブを、フローサイトメトリーを取り、1ミリリットル/ WBのチューブを追加します。 4分間400×gで細胞をペレット化。
- WBの84μL/チューブで細胞を再懸濁し、16μlの/マスターミックス液のチューブを追加し、上清を捨てます。よくボルテックスを用いて細胞を混ぜます。暗所で4℃で20分間細胞をインキュベートします。
- 20分後、4分間400×gで1ミリリットル/チューブWB、ペレット細胞を追加します。
- 上清を捨て、100μlの/コールド固定液（ 例えば、2％（最終）パラホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド）のチューブで細胞を再懸濁。よくボルテックスを用いて細胞を混ぜます。暗所で4℃で10分間細胞をインキュベートします。
- このステップの後、細胞内サイトカイン/ケモカインのための細胞を染色またはWBで4℃で一晩保管してください。
注：一晩のインキュベーションの後、より低い細胞回復が発生することがあります。
- このステップの後、細胞内サイトカイン/ケモカインのための細胞を染色またはWBで4℃で一晩保管してください。
- 4分間400×gで1ミリリットル/チューブWBで細胞を洗浄し、透過化のステップに進みます。
- 透過化緩衝液（PB）（ 例えば、0.2％サポニン、PBS中の1％BSA溶液）を調製します。
- 4分間400×gでのPBの1ミリリットル/チューブで細胞を2回洗浄します。細胞内染色を続行します。
注意：サポニンが潜在的に刺激します。対応する製品安全データシート（MSDS）に応じて、それを処理します。 - （緑色で強調表示） 表2に示す「細胞内」抗体ボリュームを使用してマスターミックス溶液を調製します。染色されるべき管の数と、これらのボリュームを掛けます。
- 再懸濁を90μl/チューブPB内の細胞および抗体のマスターミックス溶液10μl/チューブを適用します。ボルテックスを用いてよく混ぜ、3のために、細胞をインキュベート暗所で4℃で0分。
- 4分間400×gでのPBの1ミリリットル/チューブで細胞を2回洗浄します。
- 上清を捨て、400μlの/チューブPB中で細胞を再懸濁します。よくボルテックスを用いて細胞を混ぜます。測定まで暗所で細胞を氷上に置きます。
6.フローサイトメトリー報酬および買収
- パラメータ設定フォルダ内のフローサイトメトリー取得ソフトウェア内（ 表2参照）の異なる蛍光色素のためのチャンネルを選択します。また、FSC-Aおよび-Hのためだけでなく、SSC-Aおよび-Hためのチャネルを選択します。
- 取得ファイルに選択されたパラメータ用に作成された補償行列をロードします。
- （ 表2参照）、各使用蛍光色素のための単一色の染色を行うことにより、ステップ2.2.8から分離されたNK細胞を使用して補償行列を作成します。ステップ5.1から5.4に記載された表面染色プロトコルを使用してください。いずれの抗体なし（未染色のコントロールを含めます）ならびにアイソタイプコントロールおよび/または蛍光マイナス1のコントロール（FMO）。
注：セルベースの報酬の代替として、補償コントロールとしてIgG結合ビーズを使用しています。 - 試料注入口（SIP）に抗体せずに、単一の染色サンプルとサンプルのために各チューブを置きます。フローサイトメトリー取得ソフトウェアで「記録」ボタンをクリックし、サンプルあたり少なくとも5×10 3 NK細胞の細胞数を取得します。
- 補償行列を作成するために、フローサイトメトリー取得ソフトウェアの補償計算アプリケーションを使用してください。
- （ 表2参照）、各使用蛍光色素のための単一色の染色を行うことにより、ステップ2.2.8から分離されたNK細胞を使用して補償行列を作成します。ステップ5.1から5.4に記載された表面染色プロトコルを使用してください。いずれの抗体なし（未染色のコントロールを含めます）ならびにアイソタイプコントロールおよび/または蛍光マイナス1のコントロール（FMO）。
- NK細胞集団を同定するためのドットプロットを作成します。
- FSC-A / FSC-HとSSC-A / SSC-Hドットプロットを使用して、単一の細胞を識別します。 「ポリゴンゲート」ボタンをクリックします。両方のドットプロットで直線状の分布パターンを有する細胞、周りにゲートを描きます。新しいドットプロットを開くためにゲートをダブルクリックします。
- リンパ球を識別するためのFSC-A / SSCドットプロットを選択します。/ NK細胞集団（ 図1参照）。その周りに多角形ゲートを描画し、ゲートをダブルクリックします。
- SIPにNK細胞刺激アッセイの各試料管を配置します。 「記録」ボタンをクリックし、サンプルあたり少なくとも5×10 3 NK細胞の細胞数を取得します。
7.分析と統計
- 解析ソフトウェアプログラムフローサイトメトリーを開きます。刺激されていない対照サンプルを開くには、ローディングサンプルボタンをクリックします。
- 異なるNK細胞亜集団のためのゲーティングシステムを作成します（ 図1を参照）。
- FSC-A / SSC-プロットを作成するために、ドットプロットボタンをクリックしてください。矩形ゲートボタンをクリックして、破片を除外する> 5×10 4 FSC-値を持つすべてのイベントの上に長方形ゲートを描きます。ゲートをダブルクリックしてゲートを開きます。
- 再び新しいドットプロット内のFSC-A / SSC-Aのパラメータを選択し、ポリゴンゲートボタンをクリックします。 Dリンパ球集団の周りに生ポリゴンゲート（ 図1参照）。ゲートを開きます。
- 新しいドットプロットのためのSSC-A / SSC-Hパラメータを選択して、すべての単一のセルの周囲にポリゴンゲートを描きます。単一細胞は、FSC-A / FSC-HとSSC-A / SSC-Hパラメータを横断線形分布を実証する（ 図1を参照）。その上でダブルクリックしてゲートを開きます。
- この時間FSC-A / FSC-Hパラメータを使用して手順を繰り返し7.2.3。
- パラメータCD45を使用して、チャネル（CD3 DCM; CD14; CD19）をダンプ死細胞を排除します。すべてのCD45陽性の周りに長方形ゲートを描画し、チャネル陰性細胞をダンプします。ゲートをダブルクリックしてゲートを開きます。
- CD56を使用することにより、全NK細胞集団を特定し、チャネルパラメータをダンプします。 CD56陽性の周りに長方形ゲートを作成し、チャネル陰性細胞をダンプします。その上でダブルクリックしてゲートを開きます。
- CD56 / CD16ドットプロット内のすべての3つのNK細胞サブセットの周りの長方形ゲートを描画します。イデ、CD56 ++ CD16 +およびCD56 + CD16 ++ NK細胞サブセット- CD56 ++ CD16などの異なるサブセットをntify。
- 各個々のNK細胞サブセットのためのNK細胞の機能を分析します。
- それを開くために3つのNK細胞サブセットのゲートのいずれかをクリックしてください。 CD56 / CD107aの、CD56 / IFN-γおよびCD56 / MIP-1βについては、3種類のドットプロットを作成します。
- それぞれのCD107a、IFN-γまたはMIP-1βだけでなく陽性であるCD56陽性細胞、のための長方形のゲートを描きます（ 図1を参照）。
- 残りの各NK細胞サブセットのための手順を繰り返し7.3.1-7.3.2。
- 繰り返しステップ7.2およびすべての刺激のサンプルについて7.3。解析ソフトウェア内の統計輸出ボタンをクリックして、各個々のサンプルのすべての統計値を保存します。
- NK細胞の機能を分析するために、個々のサンプルの統計値を含むファイルを開きます。個々のNK細胞の値を選択しますサブセット（ 例えば 、CD56 ++ CD16 - NK細胞）別のファイルにコピーすることによって。
- 刺激で治療されているのCD107a陽性NK細胞の割合から、刺激で処理されていないのCD107a陽性NK細胞の割合を差し引きます。
注：刺激に応答して、この特定のNK細胞サブセットの脱顆粒の能力を実証するために、結果を使用してください。 - IFN-γおよびMIP-1βの陽性NK細胞のための手順を繰り返し7.5.1は、刺激に応答してサイトカインおよびケモカイン産生を実証します。
- 刺激の際に、それらの脱顆粒能力およびサイトカイン/ケモカイン産生を評価するために、残りの各NK細胞サブセットのための手順を繰り返し7.5.1-7.5.2。
- 刺激で治療されているのCD107a陽性NK細胞の割合から、刺激で処理されていないのCD107a陽性NK細胞の割合を差し引きます。
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Representative Results
全NK細胞集団と三つの異なるNK細胞サブセットの脱顆粒、サイトカインおよびケモカイン産生を分析するためのゲーティング戦略は、図1に示されています。
1健康なドナーの代表的な結果を図2に示されている。任意の刺激のないNK細胞はいずれもIFN-γもMIP-1βを生産し、その表面上のCD107a（ 図2A）を発現しませんでした。対照的に、腫瘍細胞およびサイトカインで刺激したNK細胞は、細胞内IFN-γおよびMIP-1βの有意な量を生じました。また、それらの20％以上は、その表面（ 図2C）上のCD107aを発現することによって示された腫瘍細胞の相互作用によって脱顆粒。 PMAおよびイオノマイシン刺激はコントロール（ 図2B）として使用しました。
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図1：戦略ゲーティングその後のゲートがプロットされています。まず、破片はFSC-A / SSCプロットに除外されています。その後、リンパ球が識別され、ダブレットは、SSC-A / SSC-HとFSC-A / FSC-Hで2プロットを使用して除外されています。その後、全てのCD45 +細胞を含む、すべての死者を除くゲートは、CD3 +、CD14 +およびCD19 +細胞は、CD45 /ダンプチャネルをプロットすることによって設定されます。次に、NK細胞は、CD56 +細胞にゲートすることによって識別されます。 CD56 / CD16とのプロットは、主NK細胞サブセットを同定することができます。最後に、全体のNK細胞集団内で、機能的なマーカーは、それぞれのCD107a、IFN-γおよびMIP-1β、対CD56をプロットすることにより同定されます。これは、NK細胞サブセットのすべての異なる種類のも同様に行うことができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 図1に記載のゲーティング戦略を使用して1つの健康なNK細胞のドナーからの代表的な結果 、（脱顆粒に対して）のCD107aのようなNK細胞の機能的マーカーには、IFN-γおよびMIP-1βを同定することができます。左の列（A）は、刺激の非存在下でNK細胞を用いた結果を示しています。中央の列（B）は、陽性対照PMA /イオノマイシンの存在下での結果を示しています。右の列（C）は、腫瘍細胞株K562とし、サイトカインIL-2（100 U / ml）およびIL-15（10 ngの/ ml）の存在下で刺激したNK細胞の結果を提示します。 表示するには、こちらをクリックしてください。この図の拡大版。
表2：細胞外および細胞内染色のための抗体。
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Discussion
記載された方法は、健康なドナーまたは患者の全血試料からのNK細胞の機能を研究するための、簡単で迅速かつ信頼性の高い方法です。この方法は、他の多くの精製方法15のために必須である時間のかかる密度勾配遠心分離を避け、直接全血からNK細胞を精製するための大きな利点を提供しています。また、それは、小児及び/又は免疫不全の患者のサンプルのために適切な代替になり、「古典的な」NK細胞単離/濃縮法に比べて小さなサンプルサイズを必要とします。このプロトコルは、NK細胞の機能をエクスビボでの基底値を得るために使用することができ、それはまた、以前に8記載の他の方法と相補的なこのような方法であること、さらにNK培養および拡大を可能にします。それにもかかわらず、いくつかの重要なステップは、考慮しなければなりません。アッセイは、細胞外および細胞内抗体染色に基づいているので、woは最適に決定するために重要です最初の各抗体について濃度をrking。特に、細胞内染色のために、使用された抗体の慎重な評価を強くお勧めします。良い方法が使用される抗体の希釈系列テストすることである（ 例えば、1：1から100：12.5）細胞懸濁液中には、またはPMA /イオノマイシンなしで刺激しました。その後刺激と非刺激サンプル間の陽性事象の比を算出し、プロットされています。最も高い正の倍率変化率（最高の信号対バックグラウンド比）を有する抗体の希釈は、さらなる実験16に使用する必要があります。また、アイソタイプおよびFMOコントロールなどのコントロールを使用すると、陽性細胞集団で正しくゲートするために、細胞内染色のために特に基本的なことを証明することができます。
しかし、記載された方法のいくつかの重要な制限があります。 CD107aの発現は、脱顆粒のマーカーであるため、間接的にのみNK細胞の細胞毒性を示します。 NK細胞の細胞傷害性のAND脱顆粒容量が異なっていてもよいです。分泌されたグランザイムBの分解における腫瘍細胞の結果でオートファジー経路のアップレギュレーションおよびNK細胞の相互作用17時の細胞死を減少させます。したがって、追加のDCM（ 例えば、カスパーゼ3切断）標的細胞18内の細胞死事象を監視するために染色パネルに追加されるかもしれません。また、NK細胞の細胞傷害性は、細胞内染色19,20によって定量化することができ、それらの顆粒内の細胞傷害性タンパク質（ 例えば 、パーフォリン、グランザイムB）の量によって影響されます。
また、プロトコルを変更するには、異なる可能性があります。代わりに、単離されたNK細胞、末梢血単核細胞（PBMC）を用いることができます。 1は、PBMC集団内の絶対NK細胞の数は、様々なドナーの間、さらには異なる時点で同じドナー由来のサンプル間で異なることに注意しなければならないけれども。 NK細胞degranulT比：ationがEに大きく依存しています。すべての実験を通してT比：異なるドナーの間または種々の時点でのNK細胞の機能を比較するために、PBMCの集団内の絶対NK細胞数は、定数Eを確立するために使用されるべきです。 NK細胞の機能は、同じドナー内の異なる時点でモニターしている場合は、PBMCを凍結することができ、分析は、インター実験バリエーション11を減少させるために、すべての異なる時点のために一度に行うことができます。
最大18色の染色のパネルが可能であるため、NK細胞機能の分析は、非常に、より詳細に拡張することができます。 CD57、NKG2A、およびキラー細胞免疫グロブリン様受容体（のKIR）などの付加的な表面マーカーを使用し、さらにNK細胞サブセットを同定することができます。少なくとも一つの自己KIRを発現教育NK細胞は無学NK細胞よりもK562細胞との相互作用の際に強い脱顆粒。これとは対照的に、より分化したCD57 + CD56 + + NK細胞21 - SUP> NK細胞は、分化度の低いCD57と比較して、IL-12およびIL-15刺激の際に少ないIFN-γを産生します。また、NK細胞機能の他のマーカーには対処することができます。 LFA-1は、NK細胞の接着のために重要な分子であり、NK細胞活性化の際に、その開構造で表現されます。このいわゆる「インサイドアウト信号が「早期NK細胞活性化マーカー22です。
最後に、試験NK細胞機能のための刺激は同様に変更することができます。何のサイトカインが追加されていない場合は、私たちの経験では新鮮にK562細胞の相互作用によってのみ脱顆粒不十分NK細胞を単離しました。なぜならバイスタンダー細胞の影響により、さらにサイトカインを添加せずに新たに単離したPBMCを使用してこの問題を回避します。また、サイトカイン産生、特にIFN-γおよびTNF-αは、IL-12およびIL-18刺激の23時に開始することができます。 NK細胞サブセット内のIFN-γ産生がdependin異なる場合があります使用刺激（サイトカイン対ターゲット誘発性刺激）24にグラム。また、代わりに標的細胞としてK562細胞を使用する、腫瘍患者由来の原発腫瘍細胞は、免疫調節療法（ 例えば 、モノクローナル抗体治療または免疫調節薬の前または間に自己の腫瘍細胞に対するNK細胞の機能をテストするために使用することができます（IMiDs））。
過去数年以内に、免疫療法の分野は、免疫チェックポイント阻害剤（ 例えば、ipilumumab、nivolumumab、pembrolizumab）の臨床承認を得て急速に発展してきただけでなく、T細胞を発現性遺伝子改変されたキメラ抗原受容体（CAR）を使用して25と成功試験血液腫瘍患者27の治療のために（参照26に概説）CAR-NK細胞など。したがって、NK細胞ベースの免疫療法が焦点にますますなってきています。抗CD20抗体は、下水処理で大きな成功を収めています過去20年間28内悪性リンパ腫のNT。 NK細胞の大部分は、抗体で標識された標的細胞（ - ADCC抗体依存性細胞傷害性）を認識し、殺すために細胞を有効に低親和性Fc受容体のCD16を発現します。 NK細胞の機能を誘発する抗体の能力は記載されたプロトコール29を用いてインビトロで試験することができます。 Terszowski らは 、異なる臨床承認された抗CD20抗体を用いたBリンパ芽球様細胞株に対するNK細胞のADCCを分析しました。リツキシマブ治療の際に誘導ADCC（最初の臨床的に承認された抗CD20抗体30）負KIR / HLA相互作用によって影響を受けたobinutuzumab使用している場合、この効果は認められなかった（小説糖操作II型CD20モノクローナル抗体）一方31、32。また、NK細胞の機能は、イミドレナリドマイド33と異なるチロシンkinasような異なる新規抗腫瘍薬の影響を受けていますE阻害剤（TKI）34。現在NK細胞特異的なチェックポイント阻害剤が臨床試験において試験されます。例としては、抗KIR 35,36または抗NKG2A抗体（NCT02331875）だけでなく、抗CD137抗体のような活性化アゴニスト（; NCT02110082 NCT01775631）の使用です。
重要なことには、養子NK細胞の移動は臨床効果37を約束と異なる悪性疾患の種々の行われています。最良のドナーを選択する目的で、患者の腫瘍に対するNK細胞の機能は、潜在的なNK細胞のドナーからの血液サンプルを用いて、 インビトロで試験されるかもしれません。
要約すると、説明したプロトコルは、健常ドナーまたは患者からの多様なNK細胞の機能を分析するために設計されています。これらの機能は、選択した時点での様々な刺激に応じて多様なNK細胞サブセットでモニターすることができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 + glutamine | Invitrogen | 6187-044 | |
| penicilin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| BD Falcon Round Bottom Tube | BD | 352008 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270-106 | heat inactivated before use |
| T-flask | Greiner Bio-One | 690195 | |
| K562 tumor cell line | DSMZ GmbH | ACC 10 | |
| ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer | made in house | / | components are listed in the text |
| Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1,000 ml Plastipur | Fresenius Kabi | 1088813 | |
| Megafuge 40R Centrifuge | Heraeus | / | |
| EDTA blood collector tubes | Sarstedt | 386453 | S-Monovette 7.5 ml, K3EDTA |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Hematopoietic media (XVIVO) | Lonza Group Ltd | BE04-743Q | |
| human serum | DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M | / | healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use |
| Neubauer-improved counting chamber, bright line | Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd. | 0640030/ 1110000 | |
| trypan blue solution (0.4%) | Invitrogen | 15250-061 | |
| 3% acetic acid with methylene blue | Stemcell Technologies | 07060 | |
| Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates | Corning | 3894 | |
| Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates | Corning | 351177 | |
| DPBS (Ca2+- and Mg2+-free) | Gibco Invitrogen | 14190-169 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2153-100G | |
| NaN3 | Sigma Aldrich | 08591-1ML-F | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Merck | 524400-1MG | |
| ionomycin | PromoKine | PK-CA577-1566-5 | |
| interleukin 15 (IL-15) | PeproTech | 200-15 | |
| Proleukin S (IL-2) | Novartis Pharma | 730523 | |
| Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested. |
| Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A) | BD Biosciences | 555029 | |
| paraformaldehyde | AppliChem | UN2209 | |
| saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| flow cytometer: Canto10C | BD Biosciences | / | |
| FlowJo | TreeStar Inc. | / | |
| Graph Pad | Graph Pad Inc. | / | |
| MACSxpress Separator | Miltenyi Biotec | 130-098-308 | |
| MACSxpress NK isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-098-185 | |
| MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-098-196 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| anti-human CD3 APC | Biolegend | 300412 | |
| anti-human CD3 V450 | BD Biosciences | 560366 | |
| anti-human CD14 PerCP | Miltenyi Biotec | 130-094-969 | |
| anti-human CD14 V450 | BD Biosciences | 560349 | |
| anti-human CD16 PE | Biolegend | 302008 | |
| anti-human CD16 PerCP | Biolegend | 302029 | |
| anti-human CD19 PE-Cy7 | Biolegend | 302216 | |
| anti-human CD19 V450 | BD Biosciences | 560353 | |
| anti-human CD45 BV510 | BD Biosciences | 563204 | |
| anti-human CD56 FITC | Biolegend | 345811 | |
| anti-human CD107a PE | Biolegend | 328608 | |
| anti-human IFN-γ AF-647 | BD Biosciences | 557729 | |
| anti-human MIP-1β APC-H7 | BD Biosciences | 561280 | |
| DAPI | Biolegend | 422801 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Kit | Biolegend | 423113 | fixable dead cell marker |
References
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