Summary
imagen confocal en vivo ofrece biólogos con una poderosa herramienta para estudiar el desarrollo. A continuación, presentamos un protocolo detallado para la imagen confocal en vivo de flores en desarrollo de Arabidopsis.
Abstract
El estudio del crecimiento y desarrollo de la planta ha dependido durante mucho tiempo en las técnicas experimentales utilizando tejidos muertos, fijos y que carecen de celulares de resolución adecuada. Los recientes avances en microscopía confocal, junto con el desarrollo de numerosos fluoróforos, han superado estos problemas y ha abierto la posibilidad de estudiar la expresión de varios genes simultáneamente, con una buena resolución celular, en muestras vivas. imagen confocal en vivo proporciona los biólogos de plantas con una poderosa herramienta para estudiar el desarrollo, y se ha utilizado ampliamente para estudiar el crecimiento radicular y la formación de órganos laterales sobre los flancos del meristemo apical. Sin embargo, no ha sido ampliamente aplicado al estudio del desarrollo de la flor, en parte debido a los problemas que son específicos para la formación de imágenes de flores, tales como los sépalos que crecen sobre el meristemo flor, y filtrar la fluorescencia de los tejidos subyacentes. A continuación, presentamos un protocolo detallado para llevar a cabo la imagen confocal en vivo en vivo, desarrollando Árabeidopsis capullos, ya sea utilizando un montante o un microscopio invertido.
Introduction
La mayor parte del cuerpo de la planta forma post-embrionaria de grupos de células madre situadas en o cerca de la punta - o meristemos apicales - de los brotes y raíces. Todas las estructuras por encima del suelo de la planta adulta derivan del meristemo apical del brote (SAM), que produce continuamente órganos laterales en sus flancos: Hojas durante la fase vegetativa, y meristemos florales (FM) después de que éste pase a la fase reproductiva. FM a su vez se convierten en flores. Mientras que la Arabidopsis SAM produce órganos laterales de una en una, en un patrón repetitivo, espiral, fms producir cuatro tipos de órganos florales dentro de cuatro verticilos, de una manera parcialmente síncrono, con múltiples programas de desarrollo desentrañar simultáneamente. Las redes genéticas que subyacen a la especificación de la identidad de los diferentes órganos florales se han descifrado parcialmente (para revisiones, véanse las referencias 1, 2), pero muchos aspectos de la flor development, tales como floral de posicionamiento de órganos y la definición de los límites entre verticilos, siguen siendo poco conocidos.
Estudios de genética molecular tempranas de desarrollo de la planta en su mayoría se basaban en técnicas tales como hibridación in situ y los reporteros GUS para analizar la expresión génica. Si bien estos métodos han proporcionado una gran cantidad de información y contribuido en gran medida a nuestra comprensión del crecimiento de las plantas y el desarrollo de flores, hay limitaciones importantes: carecen de buena resolución celular, no permita la fácil observación del patrón de expresión de múltiples genes en la misma muestras, y esto es importante, sólo pueden aplicarse a los tejidos muertos y fijos. Los recientes avances en microscopía confocal han superado estas limitaciones y proporcionar los biólogos del desarrollo de una herramienta poderosa para investigar los procesos de morfogénesis de plantas subyacente. En particular, la microscopía confocal permite la observación de los tejidos vivos y órganos a lo largo de su formación, que es critical para comprender plenamente un proceso esencialmente dinámico como el desarrollo.
De formación de imágenes confocal en vivo se ha usado ampliamente para analizar el crecimiento aéreas de las plantas y la producción de órganos laterales por el SAM (por ejemplo, Referencias 3, 4, 5, 6), pero con la excepción de unos pocos informes (por ejemplo, las referencias 7, 8, 9, 10), que no ha sido ampliamente aplicado al estudio de desarrollo de la flor. Los protocolos para la imagen confocal en vivo de la SAM están disponibles (por ejemplo, hace referencia a 11, 12), y proporcionan una buena base para la forma de la imagen de los botones de las flores en desarrollo que rodean el SAM. Sin embargo, los brotes de flor de imagen presenta retos específicos: por ejemplo,brotes de flor se convierten rápidamente en más grande que el SAM, y en la etapa 4, sépalos comenzar a cubrir las FM (etapas como se describe en la referencia 13), y de atenuación de la fluorescencia de los tejidos subyacentes (Figura 2A). A continuación, ofrecemos un protocolo detallado que explica cómo realizar la imagen confocal en vivo en el desarrollo de los brotes de flor de Arabidopsis utilizando un montante o un microscopio invertido y una lente de inmersión en agua. Hemos publicado anteriormente en este protocolo de referencia 14.
Protocol
1. Medios y preparación platos
- Preparar la disección de platos rellenando cajas redondo de plástico (de aproximadamente 6 cm de ancho, 2 cm de profundidad) a 0,5 cm con 2% de agarosa.
- Preparar la formación de imágenes platos.
- Para un microscopio confocal en posición vertical, llenar rectangular de plástico cajas de bisagras (aproximadamente 7 cm de largo, 4,5 cm de ancho, 3 cm de profundidad) a 0,5 cm con medio de formación de imágenes (véase la sección 1.3, "medio Imaging"; Figura 1F).
- Para un microscopio confocal invertido: llenar pequeña placa de Petri (aproximadamente 3,5 cm de ancho, 1 cm de profundidad) exactamente hasta el borde con medio de formación de imágenes (véase la sección 1.3, "medio Imaging"; Figura 1G).
- Preparar medio formador de imágenes.
- Para la imagen de un solo punto, utilizar 1% de agarosa.
- Para los experimentos de lapso de tiempo, utilizar un medio de crecimiento vértice (0.5x mezcla de sal basal de Murashige y Skoog sin vitamina, 1% de sacarosa, 0,8% de agarosa, pH 5,8 con hidróxido de potasiosolución e, suplementado con vitamina [0,01% de mio-inositol, ácido nicotínico 0,0001%, hidrocloruro de piridoxina 0,0001%, 0,001% de hidrocloruro de tiamina, 0,0002% de glicina] y citoquinina [500 nM N6-benciladenina]) 15.
2. Crecimiento de Plantas
- Siembre semillas esterilizadas en placas MS (0.5 o de la mezcla de sal basal de Murashige y Skoog 1x sin vitamina, 0,8% de agar, pH 5,8 con solución de hidróxido de potasio) con selección apropiada. placas lugar en día largo (16 h de luz) o días continuos, 16-22 ° C Condiciones de durante dos semanas.
- plantas de semillero de trasplante Onto suelo con una separación suficiente para permitir el desarrollo robusto. Coloque las plantas de día corto, 16-22 ° C CONDICIONES durante tres semanas.
NOTA: Las plantas que crecen en condiciones de día largo o continuas día directamente después del transplante resultados en floración prematura e inflorescencias que son menos vigorosos, y mucho más difícil de diseccionar. Del mismo modo, dejando las plantas bajo Condit día cortoiones durante más de tres semanas los resultados en día floración longitud independiente e inflorescencias que son menos vigorosa. - plantas de transferencia a largo días (16 h de luz) o días continuos, 16-22 ° C Condiciones de hasta que la flor. ápices son más fáciles de diseccionar cuando la inflorescencia es de 2-10 cm de largo.
3. La disección de la Shoot Apex
- Opcional: El uso de una piedra de afilar fina y una gota de aceite ligero, afilar fórceps bajo el microscopio estereoscópico para que sean de tipo cuchilla, no puntual.
- Retire silicuas, capullos de las flores mayores y las inflorescencias secundarias de la inflorescencia principal, empujando la base de los pedúnculos con las pinzas hasta que se rompen. Eliminar como muchas flores como sea posible sin aumento (Figura 1, comparar A y B).
- El uso de pinzas, Pierce un agujero vertical en la agarosa de un plato de disección, corte los últimos 0,5 cm de la inflorescencia y pegarlo verticalmente en la agarosa. El restantecapullos de flores deben estar por encima de la superficie de agarosa.
- Llenar el plato de imagen con agua estéril, desionizada de modo que el ápice del brote se sumerge por completo. Coloque el plato de disección bajo el microscopio estereoscópico, y eliminar el aire atrapado alrededor del ápice del brote mediante la creación de chorros de agua con una pipeta de 1000 l (Figura 1, comparar C y D).
- Bajo el microscopio estereoscópico, utilice el fórceps para eliminar los brotes de flor que no están en ser fotografiado empujando sobre la base del pedúnculo o la parte superior de la yema hasta que se rompe el pedúnculo (Figura 1E). Es importante que los pedúnculos romper limpiamente en la unión con el tallo, como pedúnculos sobrantes dificultan la eliminación de las yemas florales jóvenes.
- Si de imagen sólo los brotes de flor de la etapa 5 y más joven (Figura 2A), eliminar el agua antes de la disección de la etapa 6-8 capullos de flores. Si los brotes de flor de imágenes de la etapa 5 años o más, proceden a la ablación sépalo (ver sección 5.1). De lo contrario, ProCeed al paso 3.7.
- El uso de pinzas, perforar un agujero vertical en el medio de un plato de formación de imágenes, y se adhieren los rectos ápice diseccionado en el medio, de modo que sólo el meristemo apical y sus alrededores capullos de flores están por encima de la superficie del medio. Dependiendo de la yema (s) de flores son en ser fotografiado, puede ser necesario inclinar ligeramente la muestra, como capullos de flores no están necesariamente orientadas exactamente igual que el vástago (Figura 2A).
- Proceder a la tinción de la muestra si es necesario. Si no las manchas y / o imágenes de la muestra de inmediato, añadir agua y cerrar el plato de imagen para evitar la deshidratación. Si se utiliza un microscopio invertido, colocar el plato de formación de imágenes en una caja de plástico transparente y cerrarla.
Figura 1: Preparación de los ápices de vástagos para formación de imágenes confocal en vivo. (A - E) Disección de undisparar ápice para la imagen. Inflorescencia antes (A) y después (B) la eliminación de las silicuas y flores mayores. (C - D) ápice del brote sumerge en agua en el plato de la disección, con una burbuja de aire atrapada en la punta (C) y después de la eliminación de la burbuja de aire (D). (E) el ápice del brote en el plato de la disección, después de la disección de los botones florales mayores de la etapa 5. (F - G) Vista de ápices en el plato de imagen, en el escenario de un microscopio confocal vertical (F) e invertida (G) . En (F), una lente de inmersión en agua 40X se coloca encima de uno de los vértices, con la punta de la lente se sumerge en agua. En (G), el ápice del brote se coloca al revés por encima de la lente de inmersión en agua 40X, con una columna de agua que conecta el medio de formación de imágenes a la punta de la lente. El panel más pequeño en (F) muestra una higsu vista ampliación de la zona en el rectángulo rojo, con un ápice del brote insertada en un medio de formación de imágenes; líneas rojas y azules indican la superficie del medio y el agua, respectivamente. (H - I) Los ejemplos de los productos a medida que permiten la adición de más agua en la punta de la lente-inmersión en agua: un manguito de caucho de silicio a partir de un casquillo de la bujía (H), y un manguito improvisada a partir del dedo de un guante de látex sin polvo (G). Barras de escala = 0,5 cm de (A) y (B), 0,1 cm de (C) y (D), y 100 micras de (E). Esta cifra se publicó inicialmente en referencia 14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. La tinción
NOTA: Las paredes celulares o membranas de plasma se pueden teñir con yoduro de propidio o FM4-64, respectivamente, para lograr la resolución celulardurante la exploración. Alternativamente, las líneas reportero con proteínas fluorescentes etiquetados a la membrana plasmática se pueden utilizar 6, 16.
- Eliminar el agua del plato de formación de imágenes, y asegurar que la superficie del medio es seco para evitar la dilución del colorante.
- Bajo el microscopio estereoscópico, se aplican de 20 a 30 l de cualquiera de las soluciones de yoduro de propidio ml, o 80 mg solución 1 mg / / mL FM4-64 al ápice diseccionado con una pipeta de 10 mL. Asegúrese de que toda la muestra está cubierto de tinte para asegurar una tinción homogénea.
- Mancha durante 2 min si se utiliza yoduro de propidio, o 20 min si se utiliza FM4-64.
- Enjuague dos veces con agua estéril, desionizada.
5. Sepal ablación
NOTA: En la etapa 4, primordios de sépalos comenzar a cubrir la FM. A medida que crecen, que filtran la fluorescencia a partir del tejido subyacente, y dificultan el proceso de formación de imágenes. Sépalos o bien pueden ser retirados manualmente usando un mounte metal pind en un pin-tornillo de banco, o se impide que crezca el uso de la ablación con láser en los primordios de sépalos emergente. Alternativamente, es posible en algunos casos a utilizar mutantes tales como apetala1-1, en los que los sépalos no aparecen o están reemplazados por órganos en forma de hoja que no cubren la FM mientras que la parte central de la flor se desarrolla normalmente (Figura 2F) 17.
- Ablación Sepal en capullos de flores de la etapa 5 y mayores utilizando un pin-tornillo de banco que sostiene una aguja de metal recta (Figura 2, E1-E2)
- Coloque el plato de disección con el ápice diseccionado bajo el microscopio estereoscópico, y establecer la ampliación al máximo. Sumergir el ápice del brote en agua estéril, desionizada, o alternativamente, utilizar una pipeta de 1000 l para aplicar agua a la ápice del brote regularmente mientras la disección de los sépalos.
- Con el pasador-tornillo de banco, coloque el pasador en la parte superior del sépalo abaxial, tangencialmente con respecto al ápice del brote. Empuje suavemente el sépalo lejos del ápice del brote hasta que se rompeDel botón floral.
- Procederá de manera similar con el sépalo adaxial, pero empujar el sépalo hacia el ápice del brote.
- Procederá de manera similar con los sépalos laterales, pero la posición del pasador radialmente con respecto al ápice del brote, y empujar los sépalos a un lado, lejos de la yema floral.
- Sumerja el ápice del brote en agua estéril, desionizada durante unos minutos para evitar la deshidratación.
- La ablación por láser de los primordios sépalo en la etapa 3-4 (Figura 2, C5-D5)
- Coloque el plato de imagen con el manchado, el ápice diseccionado en la platina del microscopio confocal. Localizar y centrarse en el vértice como si se preparara a la imagen (véase la sección 6, "Configuración de imagen").
- Usando el software del sistema de ablación por láser, definir la zona de ablación, que corresponde a la cresta y la punta de los primordios sépalo emergente antes de comenzar a cubrir el meristemo de flores (por lo general, en la etapa 3 para los sépalos abaxial y adaxial, y en la etapa tardía 3 / temprano etapa 4 para SE lateralPals).
- Establecer la potencia del láser y el tiempo de permanencia de los parámetros apropiados para la ablación de suficientes células sin causar demasiado daño a los tejidos subyacentes. Típicamente, dependiendo del sistema de ablación láser utilizado, los parámetros adecuados inicialmente necesitan ser identificadas a través de un proceso de ensayo y error para asegurar que suficientes células se eliminan para evitar que los sépalos para crecer posteriormente sobre el FM, sin afectar el resto de la flor brote. El uso de demasiada potencia del láser y morada tiempo resulta en daños en el centro de la flor, lo que afecta su crecimiento y / o supervivencia. Una vez se han identificado los parámetros adecuados, pueden ser reutilizados para posteriores experimentos.
NOTA: Si la ablación inicial resulta insuficiente, es posible proceder a una segunda ablación en los siguientes días (Figura 2, C4 y D2).
6. Configuración de imagen
- Utilizar un microscopio vertical.
NOTA: Cuando la formación de imágenes con un microscopio vertical, varios vértices se pueden colocar en el mismo plato de imagen. Sin embargo, si el proceso de formación de imágenes tiene una duración de más de una hora, yoduro de propidio tiende a ser diluida, y algunas muestras podría necesitar re-tinción antes de la imagen. - Coloque el plato de formación de imágenes en la platina del microscopio (Figura 1F). Bajar la lente de inmersión en agua y elevar el escenario para que la punta de la lente se sumerge en el agua. Proceder con cautela a fin de no aplastar los ápices disecados o sumergir la lente en el medio de formación de imágenes.
- Si una burbuja de aire es atrapado en la punta de la lente, que chorros de agua con una pipeta de 1000 l para eliminarlo.
- Bajo iluminación de epifluorescencia, la posición de uno de los ápices diseccionado en el campo de la lente utilizando el aire XYTroller. Mira a través de los oculares y se centran en la muestra utilizando el controlador Z. Proceder con cautela a fin de no aplastar la muestra.
- Utilizando el software de microscopio confocal, zoom en la yema floral en ser fotografiado, y proceder a la obtención de imágenes de su muestra.
- Usando una pipeta de l 1000, poner una gota de agua estéril, desionizada en la punta de la lente.
- Mantenga el plato de formación de imágenes al revés, y con una pipeta de 1000 l, añadir una gota de agua estéril, desionizada hasta el ápice diseccionado.
- Coloque el plato de imagen al revés sobre la platina del microscopio (Figura 1G). Proceder con cautela a fin de no aplastar la muestra.
- Bajo iluminación de epifluorescencia, posicionar el vértice diseccionado sobre la punta de la lente utilizando el controlador XY. Con el controlador Z, baje con cuidado la etapa hasta que la muestra alcanza la gota de agua en la punta de la lente. Una columna de agua debe formar between la punta de la lente y el medio.
- Si no se forma la columna de agua, agregar cuidadosamente una gota de agua a la muestra con una pipeta de 1000 l. Añadir mangas improvisadas a la lente con el fin de añadir más agua en su punta, lo que facilita el establecimiento y el mantenimiento de la columna de agua (Figura 1H y 1I).
- Bajo iluminación de epifluorescencia, mirar a través de los oculares y se centran en la muestra utilizando el controlador Z. Proceder con cautela a fin de no aplastar la muestra.
- Utilizando el software de microscopio confocal, zoom en la yema floral en ser fotografiado, y proceder a obtener imágenes de la muestra.
NOTA: Mientras que las células en desade ping órganos florales se dividen más rápidamente, las células en el meristemo floral división una vez o dos veces cada segundo día, y linajes celulares son fáciles de seguir con los puntos de tiempo cada 24 h. Sin embargo, si es necesario, es posible que la imagen de las muestras de cada seis horas.
7. Consideraciones sobre los parámetros de imagen
NOTA: Cómo configurar los parámetros de imagen depende mucho del sistema confocal utilizado. A continuación se presentan sugerencias para algunos de estos parámetros que se pueden utilizar con cualquier microscopio confocal. Para más consideraciones sobre los parámetros de formación de imágenes, ver la sección de Discusión y referencia 14.
- Para la resolución XY: utilizar 1024 x 1024 para una buena resolución celular. Como alternativa, utilice 512 x 512 para reducir el tiempo de formación de imágenes, a expensas de la resolución.
- Para la resolución Z: establecer el tamaño de paso a 0,5-1,5 m. Bajando el tamaño de paso aumenta la resolución Z sino también el tiempo de formación de imágenes.
8. Visualización de datos confocal
- Convertir las imágenes fijas de los puntos de tiempo de desarrollo de la flor en una película.
- Abrir las imágenes fijas (en formato JPEG o TIF) en el software (por ejemplo, Fiji).
- Ir a Imagen> Pilas> Imágenes para el apilado. Las imágenes abiertas se agruparán en una pila.
- Si el orden de las imágenes en la pila no se corresponde con el orden cronológico, utilizar el plugin Pila Clasificador (Plug-ins> Pilas> Pila Clasificador) para reordenarlos.
- Para activar la pila en una película, ir a Archivo> Guardar como> AVI.
Representative Results
La Figura 2 presenta diferentes vistas de confocales Z-pilas de capullos de flores Arabidopsis vivas que expresan diferentes genes indicadores fluorescentes, y se tiñeron con yoduro de propidio (Figura 2, A-C5 y G) o FM4-64 (Figura 2, E1-F) a proporcionar una resolución clara celular. La mayoría de los sistemas confocales permiten la obtención de imágenes de dos fluoróforos con espectros de emisión que no se solapan tal como GFP o YFP junto con ya sea yoduro de propidio o FM4-64 (Figura 2A - 2F). Los mejores sistemas confocales también son capaces de separar múltiples fluoróforos con espectros de emisión que se superponen parcialmente en las mismas muestras, tales como GFP y YFP, y dsRed y yoduro de propidio (Figura 2G).
Tres ejemplos de experimentos de lapso de tiempo se presentan en la figura2 y muestran capullos de flores en desarrollo normalmente después de la ablación sépalo se realizó ya sea con un sistema de ablación por láser (Figura 2, alquilo C1-C5 y D1-D5) o manualmente con un pasador-tornillo de banco y un pasador de metal (Figura 2, E1-E2). Tenga en cuenta que el brote de flor se muestra en la Figura 2, E1-E2 es de una planta mutante superman-1, que es la razón por primordios carpelo no se observan en el centro de la yema en la etapa 7. La ablación por láser de emergente primordios sépalo del brote de flor se muestra en la Figura 2, alquilo C1-C5 les impide que cubre la FM, que todavía se pueden obtener imágenes en la etapa 5 (Figura 2, C5). A la inversa, en el caso de la yema floral se muestra en la Figura 2, D1-D5, la ablación por láser sólo retrasa el crecimiento sépalo, pero sépalos eventualmente creció para cubrir la mayor parte de la FM por la etapa 5 (Figura 2, D5
Figura 2: Visualización de confocal Z-pilas de yemas florales en vivo. A y B2 son vistas de transparencia; B1 y B4-G son proyecciones de máxima intensidad; B3 es una vista rebanada ortogonal. (A - E2) flores que expresan un reportero Venus para el gen APETALA3 (verde); paredes celulares se tiñeron con yoduro de propidio (rojo, a excepción de B4, verde). (A) Inflorescencia; números indican etapas florales; sépalos en la etapa 4 y 5 flores filtran la fluorescencia del reportero Venus, que normalmente forms un anillo. Tenga en cuenta que algunos brotes de flores aparecen inclinadas con respecto a la inflorescencia. (B1 - B4) Cuatro vistas diferentes de la misma confocal Z-pila de un capullo de la etapa 5 de la flor: proyecciones de máxima intensidad (B1 y B4) con intensidad de señal Venus estará con intensidad de píxel en el color verde (B1) o con código de color fuego (B4; código de color se muestra en la parte inferior del panel); vista transparencia (B2) y vista rebanada ortogonal (B3; la orientación XY, XZ y YZ de las rodajas se indica en el panel). (C1 - C5) 4-días de lapso de tiempo de un brote flor individual de la etapa 3 a la etapa 5; ablación láser (marcados como rasgos blancos) realizó en el día 1 y el día 3 fueron suficientes para evitar que los sépalos de cubrir el centro del brote de la flor en la etapa 5. (D1 - D5) 4-días de lapso de tiempo de un brote de flor individuo de escenario3 a la etapa 5; ablación láser realizados en días 1, 2 y 3 fueron insuficientes para evitar que los sépalos de cubrir el centro del brote de la flor. (E1 - E2) del brote de flor individual después de la extracción manual de la abaxial y sépalos adaxial (E1), y de todos los sépalos (E2); puntas de flecha blancas indican sépalos restantes; asteriscos blancas indican cicatrices resultantes de la eliminación de los sépalos. (F) Etapa 7 flor apetala1-1 expresar un reportero DR5-3xVenusN7 18 (verde); membranas plasmáticas se tiñeron con FM4-64 (rojo); puntas de flechas azules indican las estructuras semejantes a hojas que reemplazan sépalos y no cubren la yema floral. (G) Etapa 4 del brote de flor que expresa un reportero GFP fluorescente para Dornröschen-LIKE 7 (verde), un reportero Venus para SUPERMAN (rojo) y un reportero dsRed para CLAVATA3 19 (cian); Célulasparedes se tiñeron con yoduro de propidio (gris). d: día; ST: etapa. Barras de escala = 25 m; escala es idéntico en B1, B2 y B4, en C1-C5 y en D1-D5. Esta cifra se modificó a partir de referencia 14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
A continuación, ofrecemos un protocolo para la obtención de imágenes, el desarrollo de los brotes de flor de Arabidopsis en vivo con un microscopio confocal y una lente de inmersión en agua. Si bien esto se puede hacer, ya sea con un montante o un microscopio invertido, es más fácil y rápido de usar la antigua. También vale la pena señalar que los diferentes sistemas confocal varían significativamente en términos de velocidad, sensibilidad y capacidad de separar las longitudes de onda. Los mejores microscopio confocal permiten ahora a la imagen de varios canales diferentes (por ejemplo, GFP, YFP, dsRed y yoduro de propidio; Figura 2 g) en las mismas muestras. Algunos microscopio confocal están equipados con un detector espectral, que puede recoger la fluorescencia de varios fluoróforos simultáneamente y separarlos después. Cuando se utiliza un detector regular, sin embargo, un conjunto de láseres y filtros debe ser utilizado para excitar y separar la fluorescencia de diferentes fluoróforos. Algunos fluoróforos tienen espectros de emisión totalmente distinta (por ejemplo, una CFPd YFP), y se pueden obtener imágenes de forma simultánea. Otros fluoróforos tienen espectros de emisión que se superponen parcialmente (por ejemplo, GFP y YFP), y en general tienen que ser fotografiado por separado, lo que aumenta el tiempo de formación de imágenes. Imaging cercanos fluoróforos también a menudo requiere la restricción de la cantidad del espectro se recoge para cada canal para evitar la fluorescencia de un fluoróforo de las fugas en el otro canal. Esto provoca una pérdida de intensidad de la señal recogida, que puede ser compensada por un aumento de la potencia del láser y la ganancia. Sin embargo, el tiempo de proyección de imagen prolongada y una mayor potencia del láser pueden blanquear y / o dañar la muestra. El aumento de la potencia del láser y / o ganancia también pueden aumentar el ruido de fondo. Optimización de intensidad de la señal, la resolución y el tiempo de proyección de imagen para cada muestra se realiza a través de un proceso de ensayo y error, e implica permanentes compensaciones.
Este protocolo se explica cómo realizar la imagen confocal en vivo de los botones florales en desarrollo en los flancos de un ápice del brote diseccionado. EsoPuede argumentarse que el hecho de que el ápice del brote no está conectado al resto de la planta y crece en un medio que contiene citoquininas podrían afectar SAM y desarrollo de la flor. Sin embargo, este medio se diseñó empíricamente a través de un proceso de ensayo y error para asegurar el rodaje diseccionado meristemos apicales producen nuevos brotes de flores en el plastocrono normal, y que estos capullos de las flores se desarrollan normalmente 15. Del mismo modo, la disección sépalo no parece afectar los patrones de expresión de genes o el desarrollo del resto de la flor. Otros protocolos de detalle la forma de realizar la imagen confocal en vivo de la SAM todavía unido al resto de la planta (por ejemplo, referencia 11). Tales protocolos podrían adaptarse a, y ofrecen una alternativa útil para la obtención de imágenes de flores en desarrollo, sobre todo en el estudio de los procesos relacionados con citoquininas. Presentan varios inconvenientes, sin embargo: los tallo se alarga y giros, y cambia la orientación de los capullos de las flores; unnd mientras imágenes de un ápice del brote unido al resto de la planta funciona bien con un microscopio vertical, es mucho más complicado que hacerlo con un microscopio invertido.
Lentes de inmersión tienen una mejor apertura numérica (NA) que las lentes "secos" (es decir, las lentes que están separados de la muestra por el aire), y por lo tanto proporcionan una resolución más fina de la muestra, lo cual es crítico cuando se utiliza un microscopio confocal. El uso de una lente de inmersión en agua por lo tanto proporciona una mejor NA de una lente seca, mientras que la prevención de la ápice del brote de deshidratación durante el proceso de formación de imágenes. Mientras que la glicerina y lentes de petróleo tienen una AN aún mayor que las lentes de agua, que requieren el uso de un cubreobjetos, que es muy poco práctico con una muestra del tamaño de un ápice del brote, que también sigue creciendo durante los experimentos de lapso de tiempo. Dado el tamaño de las muestras (dependiendo de las etapas florales, las pilas pueden ser más de 150 m de espesor), también es importante la utilización de una lente con una distancia de trabajo larga. Utilizamos típicamente una lente de 20 o 40X con un NA de 1 y una distancia de trabajo de 1.7-2.5 mm.
Software microscopio confocal ofrece varias formas de visualizar datos confocal, incluyendo reconstrucciones tridimensionales (figura 2, B1, B2 y B4) y vistas rebanada (Figura 2, B3). Aunque las vistas tridimensionales más comúnmente utilizados son proyecciones de máxima intensidad de los Z-pilas confocal (Figura 2, B1 y B4), algunos software (por ejemplo ZEN y Imaris) también ofrecen vistas de transparencia que filtra la señal de las partes más profundas de la muestra (Figura 2, B2), que puede ser útil cuando se mira en procesos que tienen lugar, o genes expresados en, la capa epidérmica. La intensidad de señal puede ser codificado con un solo color (figura 2, B1), utilizando inte pixelnsity, o el uso de un código de color (Figura 2, B4).
imagen confocal en vivo no sólo ofrece información valiosa cualitativos en el desarrollo de flores, sino que también proporciona potencialmente biólogos del desarrollo con una gran cantidad de datos cuantitativos. Software diferente (por ejemplo Imaris, Fiji, MARS-ALT, MorphographX 15, 20, 21) permite la cuantificación del número o el volumen de células que expresan uno o varios reporteros, o el nivel de expresión de reportero en células diferentes. Dicho software también puede ser utilizado para llevar a cabo la segmentación de células automático, realizar un seguimiento de los linajes de células y cuantificar el crecimiento. Este software ofrece diferentes herramientas similares, pero también difiere en muchos aspectos. MARS-ALT y MorphoGraphX fueron diseñados específicamente para las plantas 15, 20, 21, a diferencia de Imaris unand Fiji. MorphoGraphX sólo permite la segmentación y análisis de la capa epidérmica, mientras que Imaris y MARS-ALT permiten la segmentación y el análisis de toda la muestra. Sin embargo, MARS-ALT requiere la formación de imágenes antes de la misma muestra desde tres ángulos diferentes 15, y Imaris sólo requiere una sola pila. El acceso a la información cuantitativa es fundamental para mejorar nuestra comprensión del desarrollo de la flor.
Disclosures
El autor no tiene nada que revelar.
Acknowledgments
El autor desea agradecer al Prof. Elliot M. Meyerowitz por su apoyo y comentarios sobre el manuscrito, así como Ann Lavanway en el Dartmouth College y el Dr. Andres Collazo en la Instalación de imágenes biológicas en Caltech, por su ayuda en la solución de problemas técnicos con el imagen confocal en vivo. El trabajo de Nathanaël Prunet es apoyada por los Institutos Nacionales de Salud a través de subvención R01 GM104244 a Elliot M. Meyerowitz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
| Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
| Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
| Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
| Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
| Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
| P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
| Stereomicroscope | with an 80-90X maximum magnification | ||
| Laser ablation system | for sepal ablation | ||
| Laser scanning confocal microscope system | |||
| 20 or 40X water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
| Agarose | |||
| Sucrose | |||
| Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
| Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
| N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |
References
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